CN102898512B - 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明公开了编码该重组抗菌肽的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组载体和重组菌，以及该重组抗菌肽的制备方法和抗菌用途。本发明重组抗菌肽抗菌活性强，制备重组抗菌肽的方法简单，产量高，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途。
背景技术
近年来由于经济与利益的驱使，滥用抗生素和超标使用抗生素的现象普遍存在。随着抗生素广泛而长期的使用，其负面作用日益凸显，细菌的耐药性与药物残留严重威胁着人类健康，寻求抗生素替代品势在必行。我国现已开发了抗菌肽、益生素、糖萜素、低聚糖、中草药、酶制剂、酸化剂等绿色添加剂以替代抗生素。
抗菌肽是宿主免疫系统产生的一类非特异性的抵抗外界病原体感染的免疫应答产物，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。抗菌肽因其种类多，来源安全，抗菌活性高，抗菌谱广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为是替代抗生素的理想药物。
菌丝霉素是从腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectania nigrella）分泌的一种抗菌肽，又称假黑盘菌抗菌肽，由于其独特的杀菌机制，使菌丝霉素具有细胞毒性和溶血性等危害，具有很大的药用潜力。然而，假黑盘菌中菌丝霉素的表达量低、分子小，分离困难，化学合成菌丝霉素成本高，所以利用分子生物学技术重组表达外源基因是获取目标蛋白的有效途径。
申请号：201010115167.4，发明名称：一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌的专利申请公开了一种重组菌丝霉素的制备方法及应用，该菌丝霉素的分子量为4401.9Da，其核苷酸编码序列如该申请中SEQ ID NO.1所示。管韬等，“菌丝霉素的串联表达及其菌内抑菌活性分析”，畜牧兽医学报，2012,43（4）：620-626公开了重组菌丝霉素的串联表达菌株，表达的融合蛋白的分子量为30、35和40KD，核苷酸编码序列的大小为135、261和387bp。王楠，“假黑盘菌素和T4溶菌酶微生物高效表达系统的建立”，中国农业科学院学位论文，2010年10期公开了在毕赤酵母细胞中表达和生产重组菌丝霉素的方法，其制备得到的稳定表达重组菌丝霉素的工程菌株PleI，在发酵条件优化的前提下，中试规模（50L发酵体系）时，重组菌丝霉素的表达量仅为0.14g/L，即140μg/ml。
现有技术中，研究者用不同的基因工程方法表达得到了重组菌丝霉素，但是表达水平均较低，难以实现工业化生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的重组抗菌肽——重组菌丝霉素，以及编码该重组抗菌肽的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的重组载体、工程菌，还提供了该重组抗菌肽的制备方法和用途。
本发明重组抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重组抗菌肽的其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.2。
本发明SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明重组载体，它包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述的重组载体优选为pET30a重组载体。
本发明重组菌，它包括前述的重组载体。所述重组菌优选为重组大肠杆菌。
本发明重组菌丝霉素的制备方法，它包括如下步骤：
（1）取前述重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，离心，得菌体和发酵上清液；
（2）取步骤（1）所得菌体裂解，离心，得裂解上清液，与步骤（1）所得发酵上清液合并，分离纯化，即得。
优选地，所述步骤（1）中，大肠杆菌培养基为LB培养基，培养的条件是37℃、pH6.0、300r/min振荡培养，培养时间为3~18h，诱导表达使用的诱导剂是浓度为1.0M的IPTG。进一步优选地，所述培养时间为10h。
优选地，步骤（2）所述分离纯化采用GSTrap FF柱层析。
本发明最后提供了前述重组抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
本发明从天然菌丝霉素出发，用基因工程的方法制备得到了重组抗菌肽，该重组抗菌肽抗菌活性高，为临床抗菌药物提供了一种新的选择，并且，且本发明重组抗菌肽的制备方法简单，产量高，是现有重组菌丝霉素产量的12.8倍以上，经济效益巨大，工业应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1质粒pMD19-T-AP2双酶切结果，M:DNA标准分子量(DL2000)；1：质粒pMD19-T-AP2酶切鉴定结果；2：质粒pMD19-T-AP2酶切鉴定结果；
图2重组表达质粒pET30a-AP2酶切鉴定结果，M:DNA标准分子量；(DL4500)；1：pET30a-AP2酶切鉴定结果；2：pET30a-AP2酶切鉴定结果；
图3本发明工程菌鉴定结果，M:DNA标准分子量(DL10000)；1：工程菌的质粒酶切鉴定结果；
图4本发明重组抗菌肽的表达与纯化，M:Protein marker;1,2:二聚体重组菌细胞总蛋白;3:二聚体抗菌肽纯化结果；
图5重组大肠杆菌30L诱导培养下菌体增殖与抗菌肽生产曲线。
具体实施方式
实验材料
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和蒸馏水；
GSTrap FF柱层析，市售。
菌丝霉素：由上海吉尔生化使用Apex 396多肽合成仪及固相合成法合成，氨基酸序列与天然菌丝霉素序列一致，抗菌效果与天然的菌丝霉素相同。
实施例1本发明重组抗菌肽的制备
一、重组抗菌肽基因工程菌的构建
1、目标基因片段的克隆
（1）假黑盘菌（P.nigrella）总RNA提取
采用Takara公司RNAiso Plus总RNA提取试剂盒（D9108A）.
（2）用RT-PCR及定点突变技术扩增出菌丝霉素编码序列，引物（下划线为酶切位点，斜体部分为突变碱基）和反应条件如下：
正向引物（F）：
5’-GAATTCGGATCCATTGAAGGCCGCGGCTTTGGCTGCAATGGC-3’反向引物（R）：
5’-AGCGGCCGCGTCGACTTAATAGCATTTGCACACAAAGCCGCCTTTCGCGCAATAGCC-3’
反应条件为：
（3）DNA片段回收：割取含目的基因的胶条，用小量柱式凝胶回收试剂盒进行回收；
（4）二聚体克隆质粒的构建：将上述PCR扩增产物用限制酶酶切后进行DNA连接反应，得T载体，条件如下：
检测：取T载体，用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序检测。
电泳结果如图1所示，得到含有大小为267bp的目的基因片段AP2；根据测序谱图，读出目的基因片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
2、构建重组表达载体
含目的基因AP2（P.nigrella抗菌肽基因）的T克隆载体与表达载体pET30α均用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用（胶回收纯化试剂盒，购自天根生物公司）。
双酶切体系如下：
37℃反应2～4小时；
酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片断。经凝胶回收的抗菌肽基因片段与pET30α载体（限制性内切酶酶切纯化后的片断）连接，采用NEB公司T4连接酶。
反应体系如下：
16℃反应4～6小时。
检测：取构建得到的重组pET30α载体，限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测。
检测电泳结果如图2所示，说明构建的重组pET30α载体含有大小为267bp的目的基因片段。
3、工程菌的制作
参考《分子克隆实验指南》（第三版）
1）取-80℃保存的E.coli DH5α，划线接种于LB平板上，37℃培养12～14h；
2）挑取单菌落接种于10mL新鲜的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜；
3）取200μL过夜培养液于20mL LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡生长至OD600约为0.6；
4）取培养液约10mL于50mL灭菌离心管中，4℃下6000g/min离心5min，弃上清；
5）加入2mL冷的0.1M的氯化钙溶液，轻轻吹打，使菌体充分悬浮；
6）6000g/min离心5min，弃上清；
7）加入100～200μL预冷的0.1M的氯化钙溶液，轻轻吹打，重新悬浮菌体，加入終浓度为10～15%的甘油混匀，-80℃保存，即为大肠杆菌感受态细胞。
8）吸取含目的基因片断的连接产物10μL加入100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰中放置30min；
9）42℃热激90秒后，再在冰中放置2分钟；
10）加入890μL LB液体培养基，37℃，180r/min振荡培养60min；
11）将离心管内容物混匀，取100μL已转化的感受态细胞加到含有100μg/mL Amp的LB固体培养基上，用无菌歪头玻棒将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养14~18h，观察培养基上菌落形成情况，筛选阳性克隆。
鉴定：挑选在100μg/mL Amp平板上正常生长的单菌落，扩增后提取质粒进行双酶切鉴定。
鉴定结果如图3所示，说明构建得到了含有267bp目的基因片段的工程菌。
二、本发明重组抗菌肽的制备
1、大肠杆菌阳性转化子的诱导培养
1）取步骤一制得的工程菌，接于2L LB液体培养基中培养至OD600约为0.5；
2）加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4h；
3）4℃下，5000r/min离心5min分别收集菌体和发酵上清液，用预冷的PBS洗涤3次。
2、重组抗菌肽纯化
1）取步骤1得到的菌体，加入90mL PBS重悬菌体，加入10mL细胞裂解液，室温作用30min，得菌体裂解液；
2）冰上超声破碎细胞至悬液澄清，100W的超声频率，间隔时间为30%；
3）4℃下，12000r/min离心20min，收集裂解上清液，与步骤1中的发酵上清液合并至注射器中；
4）上样：注射器连接至1mL GSTrap FF预装柱，加入5mL预冷的PBS平衡柱子后，取上清液以0.5mL/min的流速入柱；
5）漂洗：柱内加入10mL冷PBS洗涤柱子，流速为1.5mL/min；
6）洗脱：柱内加入5mL GSH洗脱液洗脱样品，流速为1.0mL/min，收集洗脱液。
检测：取步骤1）得到的菌体裂解液和步骤6）得到的洗脱液，利用SDS-PAGE对表达产物进行检测。
检测结果如图4所示，菌体裂解液中含有大量目标蛋白，纯化后的洗脱液为纯品目标蛋白，其分子量为33KD，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3、重组抗菌肽抑菌活性分析
参考美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）中的微量肉汤稀释法进行重组菌丝霉素的最小抑菌浓度（MIC）测定。
1）重组蛋白和培养基制备：用0.01%乙酸将步骤3得到的纯品目标蛋白的浓度稀释至128μg/ml，采用Mueller-Hinton肉汤做受试菌培养基。
2）MIC板制备：将倍比稀释后的待测蛋白溶液分别加入灭菌的96孔板中，第1至第11孔加待测蛋白溶液，浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml；第12孔加0.01%的乙酸溶液作阳性对照，每孔10μL，冰冻干燥后密封，-20℃短期保存备用。
3）接种物制备：利用菌悬液法分别制备浓度为0.5麦氏比浊标准的各受试菌菌悬液（1.5×108CFU/mL），经Mueller-Hinton肉汤1000倍稀释后，向每孔中加100μl。密封后接种有细菌的悬液于37℃孵育18h，接种有白假丝酵母菌的悬液于30℃孵育48h。每个处理组三个重复。
4）结果判断：MIC定义为完全抑制细菌生长的最低蛋白浓度。
表1重组抗菌肽抑菌分析结果
如表1所示，本发明制备得到的纯品蛋白的抑菌效果与菌丝霉素的效果类似，最小抑菌浓度低，抗菌能力强，说明纯品目标蛋白为重组抗菌肽。
4、重组大肠杆菌30L诱导培养方法
取步骤一制得的工程菌，在30L液体发酵系统中诱导培养生产抗菌肽的方法：发酵分两个阶段进行。
①第一阶段：发酵种子液制备（摇瓶中进行）。接l环生长良好的阳性单菌落至装有500mL种子培养基（液体LB培养基）的1000mL摇瓶中，置于200r/min恒温摇瓶柜，37℃振荡培养至OD600约为1.0，作为发酵用的一级种子。
②第二阶段：连续诱导发酵。以5％的接种量接种到含1mM IPTG的LB液体培养基中，在37℃和300r/min的条件下振荡培养。全程用氨水调节培养基的pH，使之保持在设定值6.0，每隔一段时间取样检测一次重组抗菌肽表达量，直至抗菌肽产量出现指数增长时终止发酵。
检测：取样后，按照步骤2的方法纯化，采用考马斯亮蓝法测定洗脱液的蛋白浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准。
检测结果如图5所示，用本发明工程菌发酵3h时，抗菌肽产量可达到200μg/ml，发酵10h时，抗菌肽产量最高，可达到1800μg/ml；发酵18h时，抗菌肽产量仍高达1600μg/ml。
本发明制备抗菌肽的方法，在30L发酵体系中，发酵3h的重组抗菌肽是现有技术50L发酵体系表达量的1.4倍；发酵18h的重组抗菌肽是现有技术50L发酵体系表达量的11.4倍；发酵10h重组抗菌肽的含量高达1800μg/ml，表达量是现有技术50L发酵体系表达量的12.8倍，说明本发明重组抗菌肽的制备方法大大优于现有重组抗菌肽的制备方法。
综上，本发明通过基因重组方法，构建了重组抗菌肽目的基因片段、重组质粒、工程菌，重组抗菌肽具有与菌丝霉素相当的抗菌活性，为临床抗菌药物提供了一种新的选择。用本发明工程菌发酵制备重组抗菌肽，成本低、操作简便、发酵周期短、表达水平高，发酵10h时，重组抗菌肽的含量高达1800μg/ml，是重组菌丝霉素的最高表达水平，经济效益巨大，具有良好的工业应用前景。
Claims (9)
1.SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：它是重组pET30a载体。
4.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求2或3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：它为重组大肠杆菌。
6.一种制备重组抗菌肽的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取权利要求4或5所述的重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，离心，得菌体和发酵上清液；
（2）取步骤（1）所得菌体，裂解，离心，得裂解上清液，与步骤（1）所得发酵上清液合并，分离纯化，即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，大肠杆菌培养基为LB培养基，培养的条件是37 ℃、pH6.0、300 r/min振荡培养，培养时间为3~18h，诱导表达使用的诱导剂是浓度为1.0M的 IPTG。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养时间为10h。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，分离纯化采用GSTrap FF柱层析。
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