CN103898153A - 一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法，属于生物化学技术领域，该方法是构建多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体；将构建的重组表达载体转化毕赤酵母GS115或KM71中，在不含组氨酸的培养基上筛选到重组菌；将筛选到的重组菌接种于BMGY培养液，快速振荡培养，离心收集菌体，用培养液重悬，稀释，快速振荡培养至对数期加入甲醇，流加甲醇继续培养；收集菌体，超声破碎，离心收集上清，可从上清中分离纯化到金属硫蛋白。本发明方法克服了传统金属硫蛋白制备方法的不足，有效避免了大量动物资源的浪费、细菌源内毒素污染，降低了生产成本，提高了蛋白产量。

Description

一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体地说是一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法。

背景技术

一般的，金属硫蛋白（Metallothioneins，简称MTs）是一类富含巯基、与金属离子具有高度亲和性的低分子量蛋白。金属硫蛋白在生物界广泛分布，含有61个氨基酸,其中20个氨基酸为半胱氨酸，少数有21个，每个分子可结合7-12个金属离子。由于MTs分子中富含巯基，从而使其在生物体中具有多种重要的生理功能，如重金属的解毒、体内微量元素的平衡调节、自由基的清除等等。由于具有广谱高效的保健效果和极高的医疗价值，可应用于包括医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业等实验用品等等，前景十分广阔。

目前，国内主要采用兔肝或猪肝生产金属硫蛋白。该方法首先用重金属离子诱导猪、兔，使之产生金属硫蛋白，然后，宰杀取其肝脏提取其中的金属硫蛋白。然而，用该方法获得金属硫蛋白，设备投入大、转让费高、提纯步骤繁琐且产量极低（最高达8.6mg/g猪肝），需要消耗大量动物资源。现时，已有文献报道利用基因工程手段构建大肠杆菌工程菌生产金属硫蛋白的方法，然而产量较低（CN1141395C）。虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法（CN101144093B），但仍存在产率低这个不足之处(最高达25.2mg/L发酵液)。因此，急需寻找一种成本低、效果好、产量高、适合大规模生产的方法。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视。酵母是单细胞真核生物，不仅具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还安全，并具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题。其中，毕赤酵母表达系统具有遗传稳定、背景蛋白少、易高密度发酵、外源蛋白表达量高等优点，是目前应用最为广泛的酵母表达系统。已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，该多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体的获得方法是：将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体。

所设计的金属硫蛋白的编码序列是SEQ ID NO.1 。

高效表达金属硫蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）构建多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体：

将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体；

（2）将（1）中构建的重组表达载体转化毕赤酵母GS115或KM71中，在不含组氨酸的培养基上筛选到重组菌；

（3）将（2）筛选到的重组菌接种于BMGY培养液，28～30℃下快速振荡培养16～20小时，1500～3000g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬，稀释至OD_600nm约1.0，28～30℃下快速振荡培养至对数期加入甲醇至终浓度0.5%～1.5%，此后，每24小时向培养基中加入甲醇继续培养96～150小时； 

（4）收集菌体，超声破碎，离心收集上清，可从上清中分离纯化到金属硫蛋白。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

1、目前，市场上已有的产品是通过诱导活体动物产生金属硫蛋白，再从动物肝脏中提取金属硫蛋白的方法制得。该方法生产成本高、提纯步骤繁琐且产量极低。虽然此后一些文献报道的方法通过基因工程、蛋白工程使金属硫蛋白产量有了一定提高，但产率仍很低（最高25.2mg/L发酵液）。本发明通过增加基因拷贝数使金属硫蛋白获得了高效表达，得率高，每升发酵液可得到42mg金属硫蛋白。

2、本发明方法使用的宿主菌是酵母，具有生长迅速、繁殖快、原料价廉、便于基因操作、易于规模化等诸多优点，而且安全无毒，可用来发酵制备各种食品和药物，在医药、保健食品、食品添加剂的生产上已有广泛应用。

3、本发明方法克服了传统金属硫蛋白制备方法的不足，有效避免了大量动物资源的浪费、细菌源内毒素污染，降低了生产成本，提高了蛋白产量。

4、本发明方法还可通过发酵条件及发酵工艺的优化，不断提高产量，降低生产成本。

具体实施方式

下面对本发明的一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法作以下详细说明。

本发明的一种高效表达金属硫蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）构建多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体：

将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体；

（2）将（1）中构建的重组表达载体转化毕赤酵母GS115或KM71中，在不含组氨酸的培养基上筛选到重组菌；

（3）将（2）筛选到的重组菌接种于BMGY培养液，28～30℃下快速振荡培养16～20小时，1500～3000g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬，稀释至OD_600nm约1.0，28～30℃下快速振荡培养至对数期加入甲醇至终浓度0.5%～1.5%，此后，每24小时向培养基中加入甲醇继续培养96～150小时； 

（4）收集菌体，超声破碎，离心收集上清，可从上清中分离纯化到金属硫蛋白。

基因的来源可以是人类或其他动物体，针对其他动物体也可以按照这个方法去设计，提高蛋白的表达。

实施例一：

该高效表达金属硫蛋白的方法的步骤是：

（1）重组表达载体的构建

将金属硫蛋白的编码序列，按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计和合成，然后，PCR扩增金属硫蛋白编码序列，通过酶切、连接，将基因插入到载体pAO815上的EcoRI位点后，构建成含单拷贝金属硫蛋白表达盒（pAOX1及金属硫蛋白编码序列）的表达载体；

用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从上述构建的表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入上述表达载体的BamHⅠ位点上，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复该插入程序可构建出一系列金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体；

（2）重组菌的构建

选择限制性内切酶线性化重组质粒DNA，之后，利用电转化法将线性化重组质粒DNA转入毕赤酵母GS115或KM71中，利用表达载体上His4基因与宿主的互补效应，在不含组氨酸的平板上筛选得到转化子，必要时利用PCR技术验证重组的发生；

（3）重组菌的培养与诱导表达

将上述重组菌接种于BMGY培养液中，28～30℃下快速振荡培养至OD_600nm=2～6时，1500～3000g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬，稀释至OD_600nm约1.0，28～30℃下快速振荡培养至对数期加入甲醇至终浓度为0.5%-1.5%，此后，每24小时向培养基中加入甲醇至终浓度0.5%～1.5%，继续培养96小时～150小时，离心收集菌体；

（4）金属硫蛋白的纯化

利用超声破碎仪破碎上述收集到的菌体，离心收集上清，并通过分子筛-离子交换层析-分子筛-反向高效液相层析纯化金属硫蛋白，纯度高达98%，SDS-PAGE检测呈单一条带状态。

实施例二：

该种高效表达金属硫蛋白的方法的优化步骤是：

（1）重组表达载体的构建

首先，将金属硫蛋白编码序列，按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计和合成，然后，PCR扩增金属硫蛋白编码序列，通过酶切、连接，将基因插入到载体pAO815上的EcoRI位点后，转化感受态大肠杆菌Top10F’，在含50ug/ul Amp的LB平板上筛选Amp抗性克隆，挑取Amp抗性转化子，接种在含50ug/ul Amp的培养基，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA；

以上述质粒DNA为模板，5’AOX1及3’AOX1为测序引物进行测序验证目的基因的正确插入；

用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从上述构建的表达载体上分离出金属硫蛋白表达盒（pAOX1及金属硫蛋白编码序列），将其再次插入上述表达载体的BamHⅠ位点上，转化感受态大肠杆菌Top10F’，筛选Amp抗性克隆，提取其质粒得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，利用同样的方法重复该过程得到三个金属硫蛋白表达盒串联的重组表达载体；

（2）重组菌的构建

选择限制性内切酶SacⅠ线性化上述含三个表达盒的表达载体DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析确保酶切完全，纯化得到的线性化质粒DNA，之后，采用电转化法转化毕赤酵母KM71，将电击后的菌体涂布在不含组氨酸的MGY平板上置于30℃培养至单个菌落出现；

挑取其中单菌落于MGY培养液中，30℃振荡培养20小时时，收集细胞，在含15%甘油的MGY中悬浮，先用液氮冰冻再于-80℃长期保存；

（3）重组菌的培养与表达

发酵前，将重组菌从-80℃取出，在MGY平板上划线30℃培养至单菌落出现，挑取单菌落接种于BMGY培养液中，30℃下快速振荡培养20小时，2500g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬至OD_600nm约1.0，30℃下快速振荡培养20小时后加入甲醇至终浓度为1.0%，此后每24小时向培养基中加入甲醇至终浓度1.0%，继续培养96小时,离心收集菌体；

（4）金属硫蛋白的纯化

用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0）重悬收集到的菌体，并用超声波破碎仪破碎细胞，室温下18000rpm离心30分钟，收集上清，上清通过用0.05mol/L的Trics-HCl(pH7.0)平衡的葡聚糖凝胶，收集分子量小于10000Kda的蛋白洗脱峰，利用CM-Sephadex再次分离收集到的蛋白样品，用含0.1mol/LNaCl的Trics-HCl(pH7.0)洗柱后，用含0.5mol/LNaCl的Trics-HCl(pH7.0)洗脱蛋白，收集洗脱峰，利用SDS-PAGE检测目的蛋白所在的洗脱峰，将该洗脱峰通过超纯水平衡的葡聚糖凝胶进行脱盐，最后将含目的蛋白的洗脱峰利用反向高效液相层析进行分离，用0.05%三氯乙酸+乙腈（30%～60%）+水（60%～30%）的梯度进行洗脱，收集到的金属硫蛋白纯度高达98%，纯化后的金属硫蛋白进行SDS-PAGE检测得到分子量约6.2Kda的单一条带，按照此发明方法，在摇瓶发酵水平上，每升发酵液可得到42mg的金属硫蛋白。

Sequence Listing

 

<110> 山东东兴生物科技股份有限公司

 

<120> 一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法

 

<160> 1

 

<170> PatentIn Version 3.3

 

<210> 1

<211> 

<212> DNA

<213> 人工序列（金属硫蛋白的编码序列）

 

<220>

<221>

<222>

<223>

 

<400> 1

atggacccaa actgttcttg tgctactggt ggttcttgta cttgtactgg ttcttgtaag      60

tgtaaggaat gtaagtgtac ttcttgtaag aagtcttgtt gttcttgttg tccaatgtct     120

tgtgctaagt gtgctcaagg ttgtatctgt aagggtgctt ctgaaaagtg ttcttgttgt     180

gcttaa                                                                              186

 

Claims (5)

1.一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体的获得方法是：将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构`建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体，其特征在于所设计的金属硫蛋白的编码序列是SEQ ID NO.1 。

3.一种高效表达金属硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体：

将按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pAO815上的EcoRI位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的BamHⅠ位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体；

（2）将（1）中构建的重组表达载体转化毕赤酵母GS115或KM71中，在不含组氨酸的培养基上筛选到重组菌；

（3）将（2）筛选到的重组菌接种于BMGY培养液，28～30℃下快速振荡培养16～20小时，1500～3000g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬，稀释至OD_600nm约1.0，28～30℃下快速振荡培养至对数期加入甲醇至终浓度0.5%～1.5%，此后，每24小时向培养基中加入甲醇继续培养96～150小时； 

（4）收集菌体，超声破碎，离心收集上清，可从上清中分离纯化到金属硫蛋白。

4.一种高效表达金属硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）重组表达载体的构建

将金属硫蛋白的编码序列，按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计和合成，然后，PCR扩增金属硫蛋白编码序列，通过酶切、连接，将基因插入到载体pAO815上的EcoRI位点后，构建成含单拷贝金属硫蛋白表达盒（pAOX1及金属硫蛋白编码序列）的表达载体；

用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从上述构建的表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入上述表达载体的BamHⅠ位点上，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复该插入程序可构建出一系列金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体；

（2）重组菌的构建

选择限制性内切酶线性化重组质粒DNA，之后，利用电转化法将线性化重组质粒DNA转入毕赤酵母GS115或KM71中，利用表达载体上His4基因与宿主的互补效应，在不含组氨酸的平板上筛选得到转化子，必要时利用PCR技术验证重组的发生；

（3）重组菌的培养与诱导表达

将上述重组菌接种于BMGY培养液中，28～30℃下快速振荡培养至OD_600nm=2～6时，1500～3000g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬，稀释至OD_600nm约1.0，28～30℃下快速振荡培养至对数期加入甲醇至终浓度为0.5%-1.5%，此后，每24小时向培养基中加入甲醇至终浓度0.5%～1.5%，继续培养96小时～150小时，离心收集菌体；

（4）金属硫蛋白的纯化

利用超声破碎仪破碎上述收集到的菌体，离心收集上清，并通过分子筛-离子交换层析-分子筛-反向高效液相层析纯化金属硫蛋白，纯度高达98%，SDS-PAGE检测呈单一条带状态。

5.一种高效表达金属硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）重组表达载体的构建

首先，将金属硫蛋白编码序列，按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计和合成，然后，PCR扩增金属硫蛋白编码序列，通过酶切、连接，将基因插入到载体pAO815上的EcoRI位点后，转化感受态大肠杆菌Top10F’，在含50ug/ul Amp的LB平板上筛选Amp抗性克隆，挑取Amp抗性转化子，接种在含50ug/ul Amp的培养基，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA；

以上述质粒DNA为模板，5’AOX1及3’AOX1为测序引物进行测序验证目的基因的正确插入；

用限制性内切酶BglⅡ及BamHⅠ从上述构建的表达载体上分离出金属硫蛋白表达盒（pAOX1及金属硫蛋白编码序列），将其再次插入上述表达载体的BamHⅠ位点上，转化感受态大肠杆菌Top10F’，筛选Amp抗性克隆，提取其质粒得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，利用同样的方法重复该过程得到三个金属硫蛋白表达盒串联的重组表达载体；

（2）重组菌的构建

选择限制性内切酶SacⅠ线性化上述含三个表达盒的表达载体DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析确保酶切完全，纯化得到的线性化质粒DNA，之后，采用电转化法转化毕赤酵母KM71，将电击后的菌体涂布在不含组氨酸的MGY平板上置于30℃培养至单个菌落出现；

挑取其中单菌落于MGY培养液中，30℃振荡培养20小时时，收集细胞，在含15%甘油的MGY中悬浮，先用液氮冰冻再于-80℃长期保存；

（3）重组菌的培养与表达

发酵前，将重组菌从-80℃取出，在MGY平板上划线30℃培养至单菌落出现，挑取单菌落接种于BMGY培养液中，30℃下快速振荡培养20小时，2500g离心5分钟，收集菌体，用BMMY培养液重悬至OD_600nm约1.0，30℃下快速振荡培养20小时后加入甲醇至终浓度为1.0%，此后每24小时向培养基中加入甲醇至终浓度1.0%，继续培养96小时,离心收集菌体；

（4）金属硫蛋白的纯化

收集到的菌体，破碎细胞，分离纯化金属硫蛋白。