CN103319586B

CN103319586B - 抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽mp1102、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103319586B
Application number: CN201310253154.7A
Authority: CN
Inventors: 王建华; 毛若雨; 滕达; 王秀敏; 张勇
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN103319586A

Abstract

本发明提供了一种抗耐药性金黄色葡萄球菌的新型抗菌肽MP1102，其对金黄色葡萄球菌，包括MRSA，具有强烈的杀菌活性。对编码抗菌肽MP1102的基因进行优化，构建pPICZαA-MP1102重组表达载体，经BglII线性化转化毕赤酵母X-33，获得MP1102高水平表达重组酵母菌株M5，实现了MP1102在毕赤酵母X-33中高水平分泌表达，建立M5转化子高密度发酵体系，总蛋白浓度、抗菌肽MP1102浓度及生物量检测结果显示，25℃，120h发酵后总蛋白浓度达到809mg/L，抗菌肽MP1102浓度达到420mg/L，占总蛋白比例为52%，生物量达到353g/L。MP1102具有开发为新一代抗菌药物的潜力。

Description

抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽MP1102、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及抗耐药性金黄色葡萄球菌的新型抗菌肽MP1102、其制备方法及应用。

背景技术

抗菌肽（AMP）是生物体内具有生物活性的小分子多肽，主要特点如下：抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，而且对真菌、原虫乃至病毒和肿瘤细胞都有杀伤或抑制作用(Brandenburg,et al,2012)。由于其突出的生物学特性，最有潜力作为型新安全无害抗生素替代品，从而备受科学界关注(Brandenburg,et al,2012；Eckert，2011)。

抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高（基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高）等一直是抗菌肽应用中面临的挑战(Eckert，2011)。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗耐药性金黄色葡萄球菌的新型抗菌肽MP1102、其制备方法及应用。

本发明使用生物信息学，结合抗菌肽构效关系，设计出NZ2114的衍生肽MP1102，MP1102为一个全新的抗菌肽，不具备溶血性，具有抗菌活性强，抗菌谱窄等优点。本发明是基于新型抗菌肽MP1102高水平表达、纯化及理化性质的分析研究。

为了实现本发明目的，本发明通过生物信息学工具结合抗菌肽构效关系，设计出一种抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽MP1102，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明还提供编码抗菌肽MP1102的基因，经酵母偏爱密码子优化后的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明还提供含有编码抗菌肽MP1102的基因的载体，优选为酵母表达载体，如出发载体为pPICZαA。

本发明还提供含有编码抗菌肽MP1102的基因或上述表达载体的基因工程菌，如重组酵母菌。

本发明还提供一种制备抗菌肽MP1102的方法，包括以下步骤：

1）基因表达框的设计：对抗菌肽MP1102的编码基因进行酵母偏爱密码子优化（SEQ ID No:2），在优化后的基因序列的N端插入信号肽切割位点kex2，将两个TAA终止密码子插入该序列的C端，并在两端分别添加XbaI、XhoI酶切位点，在酶切位点两端分别插入保护碱基，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示；

2）重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XbaI和XhoI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICZαA-MP1102；

3）重组酵母菌的制备：载体pPICZαA-MP1102经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽MP1102的重组酵母菌；

4）抗菌肽MP1102的制备：对步骤3）中获得的重组酵母菌进行发酵培养，离心发酵液，收集上清，上清经纯化（例如采用阳离子交换层析进行纯化）后即得抗菌肽MP1102。

使用的发酵培养基配方以每升计为：葡萄糖45g、NH₄H₂PO₄50g、K₂SO₄20g、MgSO₄.7H₂O15g、KH₂PO₄6g、CaSO₄0.4g和KOH1.5g，以水配制。

本发明还提供抗菌肽MP1102在制备用于治疗耐药性金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

本发明还提供一种用于治疗耐药性金黄色葡萄球菌的药物，其有效成分包括抗菌肽MP1102。

本发明进一步提供一种分泌表达抗菌肽MP1102的重组酵母菌，其构建方法包括以下步骤：

1）对抗菌肽MP1102的编码基因进行酵母偏爱密码子优化（SEQ ID No:2），在优化后的基因序列的N端插入信号肽切割位点kex2，将两个TAA终止密码子插入该序列的C端，并在两端分别添加XbaI、XhoI酶切位点，在酶切位点两端分别插入保护碱基，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2）将SEQ ID No:3所示的基因经XbaI和XhoI双酶切后，与经过同样双酶切的 pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICZαA-MP1102；

3）载体pPICZαA-MP1102经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，即得分泌表达抗菌肽MP1102的重组酵母菌。

本发明首次提出具有高活性的专抗耐药性金黄色葡萄球菌的新型抗菌肽MP1102，通过对编码抗菌肽MP1102的基因进行酵母偏爱密码子优化，构建至pPICZαA载体上，首次实现在毕赤酵母X-33中分泌表达。通过对酵母重组菌株进行高密度诱导发酵，120h发酵后抗菌肽MP1102产量高达420mg/L，可获得纯度高于94%的抗菌肽MP1102产品。

附图说明

图1为本发明实施例1中对抗菌肽MP1102的二级结构分析预测结果。

图2为本发明实施例1中对抗菌肽MP1102的三级结构模拟预测结果。

图3为本发明实施例1中PCR法扩增MP1102基因的结果；其中，M：标准DNA markerII，上样量为5μL，1：以pF1，pR1为引物，pUC57-MP1102为模板的PCR产物，上样量为2μL。

图4为本发明实施例4中重组pPICZαA-MP1102载体线性化结果；其中，M：Trans5K DNA marker，点样量为5μL；1：重组载体pPICZαA-MP1102，点样量为5μL；2：线性化重组载体pPICZαA-MP1102，上样量为5μL。

图5为本发明实施例4中MP1102阳性转化子鉴定结果；其中，M：DNA Marker，1-10：不同编号转化子特异引物PCR扩增产物。

图6为本发明实施例5中摇瓶水平MP1102重组酵母菌株筛选发酵液上清抑菌活性；其中，V：点样量为10μL的10μg/mL万古霉素；ZαA：pPICZαA空质粒重组转化子120h发酵液上清；X-33：毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清；1-12：表示编号为1-12号MP1102重组酵母转化子，点样量为50μL。

图7为本发明实施例6中M5摇瓶水平不同时间诱导表达发酵液上清抑菌活性；其中，V：10μL的10μg/mL万古霉素；Amp：点样量为10μL的1000×氨苄青霉素；pPICZaA：pPICZαA空质粒重组转化子24-120h发酵液上清；X-33：毕赤酵母X-33原始菌株24-120h发酵液上清；1-3：N13转化子摇瓶水平三个平行样24-120h发酵上清，上样量为50μL。

图8为本发明实施例6中M5重组酵母菌株摇瓶水平29℃不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M：超低分子量蛋白Marker；1：空载体pPICZaA转化子发酵液上清；2-7：M5转化子24、48、72、96、120h发酵液上清。上样量均为 20μL。

图9为本发明实施例7中M5重组酵母菌株29℃高密度发酵不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M：超低分子量蛋白marker；1-6：分别表示诱导0、24、48、72、96、120h发酵上清液，上样量为20μL。

图10为本发明实施例7中29℃诱导重组酵母菌株M5高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

图11为本发明实施例7中M5重组酵母菌株25℃高密度发酵不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M：超低分子量蛋白marker；1-6：分别表示诱导0、24、48、72、96、120h发酵上清液，上样量为20μL。

图12为本发明实施例7中25℃诱导重组酵母菌株M5高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

图13为本发明实施例8中抗菌肽MP1102纯化及鉴定结果；其中，A，M：超低分子量蛋白Marker；1：洗脱峰2收集的洗脱液；2：洗脱峰1收集的洗脱液；3：穿透峰收集的洗脱液；上样量为10μL；B，1、2、3分别与A中对应的洗脱液抑菌圈实验结果；C，M超低分子量蛋白Marker；1：纯化后冻干粉复溶液；2：未纯化的透析后发酵液冻干粉复溶液；D，纯化的MP1102质谱鉴定。

图14为本发明实施例10中抗菌肽MP1102溶血性实验结果。

图15为本发明实施例12中MP1102理化性质研究结果；其中，A，温度对抗菌肽MP1102活性的影响；1-5：分别为4、40、60、80、100℃处理1h MP1102溶液；1`-5`：分别经过4、40、60、80、100℃处理1h的PBS缓冲液；B，pH值对MP1102活性的影响；a-e：分表示MP1102在pH为2、4、6、8、10的缓冲液中，37℃孵育12h后的抗菌活性；a`-e`:分别不含MP1102的pH为2、4、6、8、10缓冲液，37℃孵育12h后抗菌活性。

图16为本发明实施例13中MP1102对金黄色葡萄球菌ATCC25923时间-杀菌曲线。

图17为本发明实施例13中MP1102对金黄色葡萄球菌ATCC43300时间-杀菌曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中使用的酶和试剂：限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

发明中使用的常见培养基配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl10g/L；固体LB培养基则加入2%的琼脂糖。

低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl5g/L；固体低盐LB培养基则加入2%的琼脂粉。

MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/L，牛肉浸粉5g/L，淀粉1.5g/L；固体MH培养基则加入2%的琼脂粉。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，葡萄糖20g/L；固体YPD培养基则加入2%琼脂粉。

YPDS培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，山梨醇182.2g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。

BMGY培养基（1L）：酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，10%甘油100mL，13.4%无氨基酸酵母氮源（YNB）100mL，0.02%生物素2mL，1mol/L磷酸缓冲液，pH6.0，100mL。

BMMY培养基（1L）：酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，0.5%甲醇溶液100mL，13.4%无氨基酸酵母氮源（YNB）100mL，0.02%生物素2mL，1mol/L磷酸缓冲液，pH6.0，100mL。

关于LB培养基，低盐LB，MH，YPD，YPDS，BMGY，BMMY等培养基使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

本发明中基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。

本发明蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE：参照文献。

本发明中蛋白质浓度测定方法为考马斯亮蓝法。

本发明中蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOF MS法。

本发明中蛋白纯化的方法是基于离子层析法。

本发明使用的发酵方法是高密度发酵法。

以下实施例中涉及的菌种和质粒见表1。

表1供试菌种和质粒

实施例1抗菌肽MP1102序列设计

通过生物信息学工具统计分析NZ2114系列衍生肽的物化参数，并结合抗菌肽结构与活性构效关系对NZ2114结构参数进行优化，降低NZ2114的不稳定系数及脂肪簇系数，增加NZ2114疏水力矩，增加α螺旋度参数，从而对NZ2114的第9位、13位、14位氨基酸进行定点突变，设计出新型抗菌肽MP1102，MP1102一级氨基酸序列为：GFGCNGPWQEDDVKCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。

一级序列结果参数如表2所示：

表2抗菌肽结构参数分析

通过生物信息学软件（http://emboss.bioinformatics.nl/），对二级结构进行分析，结果如图1所示。分析结果表明，MP1102含有α螺旋（H）与β折叠（E）结构，并形成了大量的转曲结构（T）。通过Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）同源建模，对MP1102的3D结构进行模拟（图2），模拟结果表明，MP1102是由一个Loop环连接的α螺旋和两个β折叠组合成CSαβ结构。

实施例2编码抗菌肽MP1102的基因的获得

（1）编码抗菌肽MP1102的MP1102基因表达序列的优化

根据酵母密码子表Pichia pastoris[gbpln]:137CDS's(81301codons)

通过密码子优化后DNA序列如SEQ ID No:2所示。序列特征：120bp；类型：核酸；链型：双链；拓扑结构：线性；分子类型：双链DNA。

（2）基因表达框的设计

基于有效终止MP1102翻译表达，两个连续TAA终止密码子插入MP1102编码序列C端。信号肽切割位点kex2位点插入MP1102N端，实现MP1102在毕赤酵母中实现天然分泌表达。在MP1102基因两端设计XhoI，XbaI核酸内切酶位点XhoI、XbaI用于基因克隆表达，并在两端分别添加保护碱基，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。表达框基因设计如下：

保护碱基

XhoI

Kex2

MP1102

终止密码子

XhaI

保护碱基

ccg ctcgag AAGAGA GGT TTT GGT TGT AAC GGT CCA TGG CAA GAA GAT

XhoI Kex2G F G C N G P W Q E D

GAT GTT AAG TGT CAT AAC CAT TGT AAG TCT ATT AAG GGT TAC AAG

D L R C H N H C K S I K G Y K

GGT GGT TAC TGT GCT AAG GGT GGT TTT GTT TGT AAG TGT TAC taa taa G G Y

C A K G G F V C K C Y※※

tctaga gc

XhaI

（3）PCR扩增MP1102基因表达框

设计好的MP1102基因表达框由生工生物工程有限公司合成，基因整合到pUC57质粒载体上，为了获得大量MP1102基因，设计PCR扩增引物进行PCR扩增：pF1：5’-CCGCTCGAGAAGAGAGGTTT-3’和pR1：5’-GCTCTAGATTATTAGTAACAC-3’。

以重组的pUC57-MP1102质粒为模板，PCR反应体系如下（50μL）：

反应条件：

PCR产物经PCR产物试剂盒（购自北京天根生物有限公司）纯化回收，获得高纯度的MP1102基因片段（图3），-20℃保存备用。

实施例3重组酵母表达载体构建

（1）用XhoI和XbaI核酸内切酶双酶切实施例2获得的MP1102基因及pPICZαA载体。

双酶切体系如下：

酶切条件：37℃，水浴4h。

酶切产物用DAN产物回收试剂盒回收（购自天根生物有限公司），-20℃保存备用。

MP1102基因和pPICZαA载体经过XbaI和XhoI双酶切消化后，用T4DNA连接酶将MP1102基因与线性化的pPICZαA载体进行连接，连接体系如下：

连接条件：25℃，1h。

（2）将（1）中重组载体转化至大肠杆菌DH5α中，具体操作步骤如下：取 -80℃冷冻保存大肠杆菌DH5α感受态细胞，立即置于冰上解冻。取90μL感受态细胞加入到1.5mL灭菌离心管，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，迅速置于42℃水浴锅热激90s，快速置于冰上冰浴2min，向每个离心管中加入500μL低盐LB培养基（不含抗生素），混匀，37℃，100rpm培养1-2h。然后低转速5000rpm离心2min，去上清，加200μL低盐LB培养基重悬，取100μL重悬菌液涂布在含有25μg/mL Zeocin低盐LB固体平板上，37℃，倒置培养16-18h。

（3）大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定

挑取（2）中低盐LB平板上长出的单菌落接种于10mL LB液体培养基中（含25μg/mL Zeocin），37℃，250rpm过夜培养，通过菌落PCR鉴定阳性转化子。挑取特异引物鉴定的阳性转化子接种于10mL低盐LB液体培养基中（含25μg/mL Zeocin），37℃，250rpm过夜培养，取500μL送上海生物工程有限公司测序，与设计基因序列进行比对，从DNA水平上验证外源基因插入是否完全正确。

a）3’,5’AOX-通用引物检测：

3’AOX：5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’

5’AOX：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

菌落PCR反应体系：

PCR反应条件：

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

b）pF1，pR1特异性引物检测

pF1：5’-CCGCTCGAGAAGAGAGGTTT-3’

pR1：5’-GCTCTAGATTATTAGTAACAC-3’

菌落PCR反应体系：

PCR反应条件：

PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

c）测序结果表明MP1102基因片段插入位点正确，方向，序列正确，与设计相吻合。

（4）重组pPICZαA-MP1102质粒提取

挑取鉴定正确的大肠杆菌DH5α阳性转化子，接种于10mL含25μg/mL Zeocin低盐LB液体培养基，37℃，250rpm过夜培养。采用质粒小提试剂盒提取大肠杆菌DH5α中重组质粒，具体操作按说明操作手册进行。

实施例4含MP1102基因的重组酵母菌株X-33的制备

（1）重组pPICZαA-MP1102载体线性化

将实施例3中获得的重组pPICZαA-MP1102载体用BglII核酸内切酶线性化后用于酵母转化。

线性化体系：

反应条件：37℃，4h。

图4电泳结果显示：pPICZαA-MP1102重组载体完全线性化。

（2）毕赤酵母X-33感受态制备

挑取毕赤酵母菌株X-33单菌落接种至10mL YPD培养基中，250rpm，30°C振荡培养过夜，1%接种量接种毕赤酵母X-33过夜培养物至50mL YPD培养基中，250rpm，30°C振荡培养至OD_600nm=1.1-1.3，4°C，4000rpm，离心5min，去上清液，50mL冰预冷的无菌水重悬菌体，4℃，4000rpm，离心5min，去上清液，25mL冰预冷的无菌水重悬菌体，4℃，4000rpm，离心5min，去上清液，2mL冰预冷1M山梨醇重悬菌体，4℃，4000rpm，离心5min，去上清液，200μL冰预冷1M山梨醇重悬菌体，90μL/管分装直接用于电转化，现制备现用。

（3）电转化

向（2）中90μL毕赤酵母X-33感受态细胞中加入1-5μg线性化重组质粒pPICMP1102（溶于10μL TE缓冲液中），轻轻混匀，转至冰预冷的电转杯中，冰上放置5min，电转，参数为1200V，25μF，400Ω。电转后立即加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀转入2mL离心管中，30℃，复苏2h，取100μL复苏后的菌液涂布在含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPDS平板上，29℃倒置培养，直至长出单菌落。

（4）重组酵母菌株X-33转化子鉴定

a）重组酵母菌株X-33基因组提取：挑取YPDS平板上重组转化子于10mL YPD液体培养（含100μg/mL Zeocin）中，29℃，250rpm振荡培养过夜，取1mL菌液，5000rpm离心5min，去上清，500μlPBS重悬菌体，8000rpm离心5min，去上清，100μL TE重悬，沸水浴10min，-80℃冷冻30min，沸水浴10min，4000rpm离心5min取上清即酵母基因组作为PCR鉴定阳性转化子。

b）PCR鉴定阳性转化子：重组酵母基因组作为模板，以MP1102特异性引物F1：5’-CCGCTCGAGAAGAGAGGTTT-3’；R1：5’-GCTCTAGATTATTAGTAACAC-3’做PCR进行鉴定，设计包含目的基因片段PCR产物长度为108bp；PCR产物电泳结果显示在100bp处出现条带，与设计产物长度相符。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

图5结果表明，通过该方法可以获得大量MP1102毕赤酵母阳性重组转化子。

实施例5摇瓶水平MP1102重组酵母菌株筛选

（1）挑取实施例4鉴定的阳性重组酵母转化子，接种于10Ml YPD液体培养基（含100μg/mL Zeocin）中，30℃，250rpm培养16-18h，以1%接种量将过夜菌液接种于10mLBMGY培养基中，30℃，250rpm培养至OD_600nm约5.0，收集菌液，4℃，4000rpm，离心5min，去上清液，收集菌体，用50mL BMMY培养基重悬细胞至OD_600nm约为1.0，将上述菌液转移至250mL摇瓶中，加盖4层灭菌纱布，放入摇床继续培养，此时计为初始诱导0h，此后，每24h加100%甲醇至终浓度0.5%，诱导120h，并在0、24、48、72、96、120h取500μL，12000rpm离心10min，收集上清液，-20℃保存备用。通过抑菌圈分析(Zhang,et al,2011)用来检测重组酵母发酵液抗S.aureus ATCC25923活性。具体方法如下：挑取S.aureus ATCC25923单菌落接种于10mL MH培养基中，37℃，250rpm培养OD600_nm=0.4,1%接种量接种于50mL MH培养基中，混匀，迅速倒入19cm×19cm方形培养皿中，待凝固后，在培养基表面小心放置牛津杯，分别加入50μL发酵液，以10μL10μg/mL万古霉素做为阳性对照。

图6结果表明，5号转化子发酵液抗菌活性最高，抑菌圈直径最大，将该转化子命名为M5号转化子，即巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）X33/MP1102，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.7788，保藏日期2013年6月21日。

实施例6最优转化子M5摇瓶水平诱导表达研究

按照实施例5的方法对M5转化子摇瓶诱导表达水平进行检测。设三个平行样，进行相同处理后，抑菌圈实验检测结果显示M5重组菌株发酵24h诱导表达发酵液上清出现明显抑菌活性，且随诱导时间延长，抑菌圈直径增大，抗菌活性越来越强，对照组空菌株和空载体均未检出抑菌圈，即不具有抗菌活性（图7），由此表明MP1102随着诱导时间延长而积累。

M5转化子发酵液上清经Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果表明，M5重组菌株经24h诱导后发酵液上清即可检测到MP1102蛋白条带，而空菌株和空载对照120h诱导均未检测MP1102蛋白条带。随着诱导时间的延长，总蛋白和菌体湿重也相应积累，诱导表达120h，M5发酵上清总蛋白浓度达到252mg/L和31g/L（图8）。

实施例7不同温度下重组酵母菌株M5高密度发酵技术

1、29℃重组酵母菌株M5高密度发酵技术

从YPD平板挑取M5转化子单菌落，接种于装液量为10mL YPD液体培养基（含100μg/mL Zeocin）50mL摇瓶中，29℃，250rmp，18-24h，以1%接种量接种于装液量为200mL YPD种子液培养基1L摇瓶中，29℃，250rmp，16-18h，OD600_nm为4.0-6.0，作为高密度发酵种子液备用。采用5L发酵罐（BIOSTATB plus,Sartorius Stedim Biotech）进行高密度发酵，发酵过程分为四个阶段：（1）菌体生长阶段：加入2L基础盐培养基，121℃灭菌20min，冷却至29℃，调节pH到5.0，加入9.6mL PMT1，接入200mL菌液（1:10），通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；（2）流加葡萄糖生长阶段：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加50%葡萄糖溶液（12‰PMT1），流加速度为24mL/L/min，连续流加6h，转速上调至1000rpm，其它发酵条件不变；（3）甲醇过渡诱导阶段:发酵条件变化，流加葡萄糖6h后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1mL/L/mmin逐渐增加到底六小时的6mL/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调为5.5，其他发酵条件不变。（4）甲醇过渡诱导阶段，甲醇流加速度为6mL/L/min，控制溶氧在20%以上，直至发酵结束。从过渡诱导开始，每隔12h取5mL样品，用于检测菌体湿重和蛋白表达情况。

（1）Tricine-SDS PAGE凝胶电泳检测结果如图9所示。

（2）总蛋白浓度与菌体湿重随诱导时间变化曲线如图10所示。结果表明：5L发酵罐低温（29℃）发酵，120h总蛋白浓度达到694mg/L，菌体湿重达到370g/L， MP1102产量292mg/L(42%)。

2、25℃重组酵母菌株M5高密度发酵技术

从YPD平板挑取M5转化子单菌落，接种于装液量为10ml YPD液体培养基（含100μg/mL Zeocin）的50mL摇瓶中，29℃，250rmp，18-24h，以1%接种量接种于装液量为200mL YPD种子液培养基的1L摇瓶中，29℃，250rmp，16-18h，OD600_nm为4.0-6.0作为高密度发酵种子液备用。采用5L发酵罐（BIOSTATB plus,Sartorius Stedim Biotech）进行高密度发酵，发酵过程分为四个阶段：（1）菌体生长阶段：加入2L基础盐培养基，121℃灭菌20min，冷却至25℃，调节pH到5.0，加入9.6mL PMT1，接入200mL菌液（1:10），通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；（2）流加葡萄糖生长阶段：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加50%葡萄糖溶液（12‰PMT1），流加速度为12mL/L/min，连续流加8h，转速上调至1000rpm，其它发酵条件不变；（3）甲醇过渡诱导阶段:发酵条件变化，流加葡萄糖6h后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1mL/L/mmin逐渐增加到底六小时的6mL/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调为5.5，其他发酵条件不变。（4）甲醇过渡诱导阶段，甲醇流加速度为6mL/L/min，控制溶氧在20%以上，直至发酵结束。从过渡诱导开始，每隔12h取5mL样品，用于检测菌体湿重和蛋白表达情况。

（1）Tricine-SDS-PAGE检测结果如图11所示。

（2）总蛋白浓度与菌体湿重随诱导时间变化曲线如图12所示。结果表明：5L发酵罐低温（25℃）发酵，120h总蛋白浓度达到809mg/L，菌体湿重达到353g/L，MP1102产量420mg/L(52%)。

实施例8抗菌肽MP1102纯化

根据实施例5获得的含有抗菌肽MP1102发酵液，经过1KD截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次，收集透析后发酵液，-80℃过夜冷冻，低温真空冷冻干燥机（-54℃，0.016mba）冻干，取一定量冻干粉用A液（20mM PBS pH6.7），复溶后上样。基于MP1102离子特性，选择强阳离子柱SP Sepharose F.F.进行层析纯化。对不同缓冲液pH，离子浓度进行优化，最终确定最佳纯化pH值为6.7，最佳洗脱浓度为60%B。通过步级梯度浓度洗脱对透析除盐后的发酵液进行纯化，分别收集穿透峰，洗脱峰1，洗脱峰2所对应洗脱液，通过Tricine-SDS PAGE凝胶电泳和抑菌活性检测，结果如图13所示，洗脱峰1均为非目的蛋白条带，且不具有抗金黄色葡萄球菌ATCC25923活性，而洗脱峰2具有抗菌活性，且Tricine-SDS PAGE凝胶电泳结果显示为单一蛋白条带（图13中A），具有很好分离效果。基于以上条件对透析后发酵液大量纯化，收集洗脱峰2对应的洗脱液，透析除盐，冻干处理后Tricine-SDS PAGE凝胶电泳检测仍为单一条带(如图13中C)，经MALDI-TOF MS质谱鉴定纯化产物分子量为4382.9Da，且没有杂峰，与MP1102理论分子量4383Da相符合（图13中D）。通过Band scale软件分析得到纯度为94.8%。

纯化条件：

A：20mM PBS pH6.7

B：20mM PBS pH6.7+1M NaCl

洗脱条件：先14.5%B洗脱，后用60%B洗脱v=3ml/min电导<20.5S/cm。

实施例9抗菌肽MP1102抗菌谱检测

根据实施例8获得大量抗菌肽MP1102冻干粉，用无菌生理水配制浓度为64μg/mL的抗菌肽MP1102和氨苄青霉素及万古霉素溶液，通过抑菌圈实验来检测MP1102抗菌谱(Zhang,et.al,2011)。挑取大肠杆菌CVCC195、大肠杆菌CMCC44102、大肠杆菌ER2566、枯草芽孢杆菌ATCC6633、凝结芽孢杆菌CMCC1.2407、地衣芽孢杆菌CMCC1.265、表皮葡萄球菌ATCC26069、双歧杆菌CMCC1.2212、金黄色葡萄球菌ATCC25923受试菌单菌落接种于液体MH培养基中，挑取李斯特菌ATCC19119、屎肠球菌1.2136、粪肠球菌1.130、粪肠球菌1.2024单菌落接种于添加有无菌小牛血清的MH液体培养基中，37℃振荡培养至OD_600nm为0.4，分别向20mL相应的固体培养基(42℃)加入200μL上述菌液，快速混匀，倒入培养皿中，待培养基完全凝固后，在其表面放置牛津杯，加入50μL64μg/mL抗菌肽，氨苄青霉素，万古霉素溶液37℃倒置静置培养，直至观察到明显抑菌圈或者明显没有抑菌圈，测量抑菌圈直径的大小。

检测结果（表3）表明：MP1102对3株大肠杆菌没有抑菌作用，对革兰氏阳性菌B.subtilis ATCC6633，E.faecalis CMCC1.130也没有检测到明显抑菌圈，因此对其也没有抑菌作用，而对其它革兰氏阳性屎肠球菌E.faecium CMCC1.2136、地衣芽孢杆菌B.licheniformis CMCC1.265、表皮葡萄球菌S.epidermidis ATCC26069抑菌圈直径范围为8-15mm，对粪肠球菌E.faecalis CMCC1.2024、凝结芽孢杆菌B.coagulans CMCC1.2407、双歧杆菌B.bifidum CMCC1.2212、李斯特菌L.ivanovii ATCC19119的抑菌圈直径范围为15-23mm，对金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923抑菌圈直径达到30mm，抑菌活性最强，较氨苄青霉素和万古霉素抑菌圈直径更大。

表3.MP1102抑菌圈实验结果

注：-表示没有抑菌作用；+表示抑菌圈直径d<15mm;++表示抑菌圈直经15mm≤d≤23mm；+++表示抑菌圈直径d>23mm。

实施例10抗菌肽MP1102抗菌活性检测

根据实施例8获得大量抗菌肽MP1102冻干粉，用无菌生理水配制浓度为1280μg/mL的抗菌肽MP1102和氨苄青霉素及万古霉素溶液，2倍倍比稀释至终浓度0.625μg/mL，将不同浓度的抗菌肽MP1102溶液，氨苄青霉素溶液及万古霉素溶液分别加到无菌96孔细胞培养板中，每孔10μL，每个样品三个平行，相同量（10μL）无菌生理盐水作为生阳性对照，制备MIC板。金黄色葡萄球菌采用MH液体培养基培养，37℃振荡培养至OD_600nm=0.4，将金黄色葡萄球菌菌液制备成浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经37℃孵育后的无菌MH液体培养基1000倍稀释后，向制备好的MIC板样品孔中每孔加90μL菌悬液，37℃恒温孵育16-18h观察并记录实验结果。取MIC、2MIM、4MIC、8MIC浓度值的菌液10倍梯度稀释后涂布于MH固体培养基，37℃恒温孵育，24h，直至长出菌落，菌落计数，并计数，菌落数是低于初始接种时99.9%的最低浓度即为抗菌肽MP1102抗对应金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）。测定结果如表4所示：

表4.抗菌肽MP1102抗金黄色葡萄球菌MIC、MBC测定

实施例11抗菌肽MP1102溶血性实验

抗菌肽溶血性实验是通过检测抗菌肽MP1102对人红细胞溶血性来证实，参考(Cho and Lee，2011)方法。

根据实施例8获得大量的抗菌肽MP1102冻干粉，将MP1102溶解于无菌生理盐水中，配置成浓度为256μg/mL的母液，2倍倍比稀释终浓度为2μg/mL。采取一定量人血液，制成8%红细胞悬浮液，各取100μL红细胞悬浮液和MP1102溶液，加入96孔板，37℃孵育1h，1500rpm离心5min，吸取上清至ELISA酶标板检测540nm下紫外吸光值。生理盐水和0.1%Triton X-100分别为0%和100%溶血对照实验。溶血程度计算公式如下：

溶血度（%）=[(Abs_540nmMP1102－Abs_540nm生理盐水)／(Abs_540nm0.1%TritonX-100－Abs_540nm生理盐水)]×100%(Jung,et al,2007)

结果如图14所示。结果表明：MP1102不具有细胞溶血性，对红细胞不具有毒性，可以用于开发为血液注射型抗菌药物。

实施例12抗菌肽MP1102理化性质检测

（1）温度对抗菌活性影响：根据实施例8获得大量的MP1102抗菌肽冻干粉，取一定量MP1102冻干粉，溶解于PBS（pH6.0）缓冲液中，制备成终浓度为64μg/mL抗菌肽溶液，分装成五管，每管50μL，分别在4、40、60、80、100℃下水浴1h，以等体积PBS缓冲液做相同处理作为对照。按实施例5所述方法（抑菌圈分析）检测抗菌活性变化情况，结果如图15中A所示。

（2）pH对抗菌活性影响：根据实施例8获得大量MP1102冻干粉，将一定量MP1102冻干粉溶解于甘氨酸-盐酸缓冲液（pH2.0）、glycine-HCl缓冲液（pH2.0）、醋酸钠缓冲液（pH4.0）、磷酸钠缓冲液（pH6.0）、Tris-HCl缓冲液（pH8.0）、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH10.0）配置成终浓度为64μg/mL的不同pH环境的抗菌肽溶液，37℃孵育12h，以相同处理的对应pH缓冲液作为对照。按实施例五所述方法（抑菌圈分析）检测抗菌活性变化情况，结果如图15中B所示。

结果表明：MP1102对温度具有一定的耐受性（20-80℃），高于80℃温度处理1h，其活性会丧失；对pH具有一定的耐受性（pH2.0-10.0），在不同pH环境下均具有较强的抗菌活性，但是，其在碱性条件下抗菌活性高于酸性条件，且pH为8.0时抗菌活性最强。

实施例13抗菌肽MP1102杀菌动力学研究

时间-杀菌曲线反应抗菌肽MP1102的杀菌动力学。金黄色葡萄球菌ATCC25923和ATCC43300作为受试菌。挑取金黄色葡萄球菌ATCC25923和ATCC43300单菌落接种于MH液体培养基，37℃，200rpm过夜培养，1%接种量接种于10ml新鲜MH液体培养基中，37℃，200rpm培养至对数期（OD_600nm=0.4），将此时期菌液用新鲜的MH培养基稀释至1×10⁵CFU/mL菌浓，作为测试菌液，加入终浓度分别为1×、2×、4×MIC MP1102溶液，37℃，200rpm培养。同时，不加MP1102菌液和加入2×MIC万古霉素分别作为对照试验。在0、2、4、6、12、24h时间点分别取100μL菌液样品，并做10倍梯度稀释，取100μL不同梯度的稀释液涂布在MH固体平板上，37℃倒置培养48h，统计单菌落数，绘制时间-杀菌曲线。结果如图16和图17所示。结果表明：MP1102能够快速杀菌，处理2h后90%以上金黄色葡萄球菌均被杀死，处理6h后99.9%以上金黄色葡萄球菌被杀死，而处理6-12h，金黄色葡萄球菌ATCC43300出现轻微反弹，但菌落数依旧低于初始接种量（1.0×10⁶CFU/mL）。

本发明成功设计出一种新型抗菌肽MP1102，其对金黄色葡萄球菌，包括MRSA，具有强烈的杀菌活性。对编码抗菌肽MP1102的基因进行优化，构建pPICZαA-MP1102重组表达载体，经BglII线性化转化毕赤酵母X-33，获得MP1102高水平表达重组酵母菌株M5，实现了MP1102在毕赤酵母X-33中高水平分泌表达，建立M5转化子高密度发酵体系，总蛋白浓度、抗菌肽MP1102浓度及生物量检测结果显示，25℃，120h发酵后总蛋白浓度达到809mg/L，抗菌肽MP1102浓度达到420mg/L，占总蛋白比例为52%，生物量达到353g/L。并通过一步纯化法获得>94%纯度的抗菌肽MP1102产品，回收率约为60%，产量约为252mg/L。对MP1102进行了抗菌活性检测，结果显示，其抗金黄色葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌浓度（MIC）值为0.03μM，抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的MIC值为0.06μM，而最低杀菌浓度（MBC）均为0.06μM。通过pH及热稳定性试验表明，抗菌肽MP1102可以在较宽广的pH范围内（pH2-10）具有抗金黄色葡萄球菌活性，且热稳定性好，在20-80℃加热处理1h依然保留活性，100℃加热处理1h活性基本丧失。另外，通过时间-杀菌曲线结果反应抗菌肽MP1102在短时间内（2h）就能快速杀灭90%以上的金黄色葡萄球菌（包括MRSA）。MP1102具有开发为新一代抗菌药物的潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

Brandenburg L.-O.,Merres J.,Albrecht L.-J.,Varoga D.and Pufe T.Antimicrobial peptides:multifunctional drugs for different applications.Polymers.2012,4:539-560.

Cho J.and Lee D.G.The characteristic region of arenicin-1involved with a bacterial membranetargeting mechanism.Biochemical and Biophysical Research Communications.2011,405:422-427.

Eckert R.Road to clinical efficacy:challenges and novel strategies for antimicrobial peptidedevelopment.Future Microbiology.2011,6:635-651.

Jung H.J.,Park Y.,Sung W.S.,Suh B.K.,Lee J.,Hahm K.-S.and Lee D.G.Fungicidal effect ofpleurocidin by membrane-active mechanism and design of enantiomeric analogue for proteolyticresistance.Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes.2007,1768:1400-1405.

H.Tricine–SDS-PAGE.Nature Protocols.2006,1:16-22.

Zhang J.,Yang Y.,Teng D.,Tian Z.,Wang S.and Wang J.Expression of plectasin in Pichiapastoris and its characterization as a new antimicrobial peptide against Staphyloccocus andStreptococcus.Protein Expression and Purification.2011,78:189-196.

Claims

1.一种制备抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽MP1102的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基因表达框的设计：对抗菌肽MP1102的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的N端插入信号肽切割位点kex2，将两个TAA终止密码子插入该序列的C端，并在两端分别添加XbaI、XhoI酶切位点，在酶切位点两端分别插入保护碱基，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XbaI和XhoI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICZαA-MP1102；

3)重组酵母菌的制备：载体pPICZαA-MP1102经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽MP1102的重组酵母菌；

4)抗菌肽MP1102的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，离心发酵液，收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽MP1102。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中使用的发酵培养基配方以每升计为：葡萄糖45g、NH₄H₂PO₄50g、K₂SO₄20g、MgSO₄·7H₂O15g、KH₂PO₄6g、CaSO₄0.4g和KOH1.5g，以水配制。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中采用阳离子交换层析对上清进行纯化。

4.一种分泌表达抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽MP1102的重组酵母菌，其构建方法包括以下步骤：

1)对抗菌肽MP1102的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的N端插入信号肽切割位点kex2，将两个TAA终止密码子插入该序列的C端，并在两端分别添加XbaI、XhoI酶切位点，在酶切位点两端分别插入保护碱基，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)将SEQ ID No:3所示的基因经XbaI和XhoI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICZαA-MP1102；

3)载体pPICZαA-MP1102经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，即得分泌表达抗菌肽MP1102的重组酵母菌。