CN110438139A - 一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽t9w的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法。编码抗菌肽T9W的DNA序列，如SEQ ID No.1所示，并将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA‑T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10。用电转化方法将质粒转入到毕赤酵母菌X‑33感受态细胞中，阳性转化子在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。为进一步扩大发酵提供理论依据。本专利选用毕赤酵母作为抗菌肽T9W的表达宿主，完成了T9W的体外表达，本发明有效降低了抗菌肽T9W的生产成本，表达量高达13mg/L，实现了抗菌肽T9W的高效表达，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题。

Description

一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽T9W的方法
技术领域
本发明涉及一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法。
背景技术
广谱抗生素的大量使用不仅导致了耐药菌在世界范围内频繁出现，而且其在清除病原菌的同时也杀灭了正常细菌，对机体微生态平衡造成了严重破坏，在临床上经常出现继发感染等负面后果。抗菌肽以其卓越的抗菌活性及独特的作用机制而倍受青睐。抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)，又称为宿主防御肽(Host Defense Peptide，HDP)，是机体先天免疫系统的重要组成部分，是保护宿主抵御外源病菌侵入的屏障。抗菌肽来源广泛，具有调节免疫，广谱杀灭细菌、真菌、病毒、寄生虫、癌细胞等多方面的生物学功能。此外，抗菌肽特殊的作用机制成为新一代抗菌药物的潜质。新型高效抗菌肽T9W,其氨基酸序列RFRRLRKKWRKRLKKI，是一种能够靶向杀灭绿脓杆菌(P.aeruginosa)且无细胞毒性的α-螺旋抗菌肽，具有开发为新型饲料添加剂的潜力。但高昂的合成费用限制了T9W的进一步研究以及实际应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法，实现抗菌肽T9W高效分泌表达。
本发明所采用的技术如下：一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法，如下：根据毕赤酵母的密码子偏爱性对抗菌肽T9W的氨基酸序列进行人工设计编码，编码抗菌肽T9W的DNA序列，如SEQ ID No.1所示，并在其5’端连接限制性核酸内切酶XbaI酶切位点和Kex2信号肽切割位点，3’端连接两个终止密码子TAA，在基因片段终端连接限制性核酸内切酶XhoI酶切位点，将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA-T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10，利用电转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌毕赤酵母菌X-33中，在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。
本发明还提供上述毕赤酵母X-33基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括对发酵液进行凝胶过滤层析、离子交换柱层析和RP-HPLC的步骤。
本发明有效降低了抗菌肽T9W的生产成本，表达量高达13mg/L，实现了抗菌肽T9W的高效表达，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景，为后续T9W的研究提供了理论依据和基础。
附图说明
图1为重组表达载体构建测序电泳图；
图2为测序图与合成基因对比结果图；
图3为重组表达载体酶切鉴定结果图，M：5000bp DNA marker；1：表达载体pPICZαA-T9W；2：pPICZαA-T9W线性化产物；
图4为48孔板发酵表达上清的抑菌圈结果图，方形板的抑菌孔对应48孔板的单孔发酵液上清；对照板每孔加入等量BMGY，AB板每孔分别对应为所挑72个单菌落；
图5为Tricine-SDS-PAGE检测结果图，M：超低分子量蛋白Marker(2μL)；48-120：分别表示摇瓶表达T9W 48h-120h的发酵上清(20μL)；
图6为T9W纯品样本的高效液相鉴定图；
图7为设计基因结构图；
图8为重组表达载体结构图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如毕赤酵母表达操作实验手册。
以下实施例中使用的菌株和质粒：菌株：绿脓杆菌(P.aeruginos ATCC 27853，P.auruginosa ATCC 21625，P.auruginosa ATCC 21625)，金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC29213)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium C 7731)，大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)，毕赤酵母菌(Pichia pastoris X-33)等均保存于东北农业大学动物营养研究所；大肠杆菌(Escherichia coli TOP10)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。质粒：pPICZαA购自上海生工生物工程技术服务有限公司。其它常规试剂均属于分析纯级别。
表1为供试酶和试剂：
表2为以下实施例中涉及的培养基配方：Trincine-SDS PAGE浓缩胶和分离胶的配制
表3为以下实施例中涉及的Trincine-SDS PAGE浓缩胶和分离胶的配制
有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS、BMGY、BMMY等培养基的使用参照
Invitrogen毕赤酵母操作手册。
以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。
以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE。
以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为RP-HPLC。
以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOF MS法。
实施例1
基因合成和表达质粒的构建
根据毕赤酵母的密码子偏爱性对抗菌肽T9W的氨基酸序列RFRRLRKKWRKRLKKI进行人工设计编码：TTGCGTCCTTTGCTGAGACCATTGTTGAGACCATTGCTGAGACCACTGTTGAGACCATTGTTGAGACCACTGCTGAGACCACTG，并在其5’端连接限制性核酸内切酶XbaI酶切位点和Kex2信号肽切割位点，3’端连接两个终止密码子TAA，有效地终止翻译过程。在基因片段终端连接限制性核酸内切酶XhoI酶切位点。同时，将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA-T9W保存于E.coli Top 10。上述全基因合成以及亚克隆至表达载体的过程，由生工生物工程(上海)有限公司进行。选用毕赤酵母表达载体上的通用引物5'AOX1和3'AOX1对连接体进行重组表达载体的PCR验证。并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测以及基因测序，上述步骤由生工生物工程(上海)有限公司完成。如图7设计基因结构和图8重组载体结构所示。
实施例2
阳性转化子筛选和诱导发酵
将实施例1中设计的重组表达载体的电转化入毕赤酵母感受态细胞中，具体步骤如下：
1)预先将电转杯紫外灭菌，并置于冰上预冷。将1M山梨醇溶液置于冰上预冷；
2)将20μL线性化重组质粒加入100μL感受态细胞中，轻轻吹打混匀并转移至紫外灭菌的电转杯中。置于冰上静置10min；
3)电转化(电压1200V，电阻400Ω，电容25μF，脉冲时间10ms)；
4)电转后马上加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，充分混匀并转移至1.5mL离心管，30℃，静置复苏2h；
5)分别吸取复苏后的菌液50μL，100μL，200μL，均匀涂于YPDS平板(Zeocin，100μg/mL)上，置于培养箱中30℃倒置培养，直至培养出毕赤酵母X-33单菌落。
挑取YPDS平板上的完整单菌落72个进行48孔板的表达，并同时对应保存所挑单菌落于YPD方形平板。甲醇诱导96h后，收集上清液。利用上清液对绿脓杆菌ATCC 27853的抗性进行抑菌圈试验对转化子进行初筛，并用无转化子的BYGM做同等处理作为对照组。挑取抑菌效果好的阳性转化子进行后续的摇瓶发酵。为筛选高表达量阳性转化子菌株，采用48孔诱导表达的方法，具体诱导表达和筛选步骤如下：
(1)挑取转化子单菌落36个，对应接种于YPD方形培养皿(Zeocin，100μg/mL)的36个网格上，一一对应接种于含500μL BMGY培养基的48孔板前36个孔中。分别用封口膜密封好。将接种菌的YPD方形培养皿(Zeocin，100μg/mL)置于培养箱中29℃温育过夜，4℃保存。将48孔板置于摇床中，29℃，250rpm振荡培养24h；
(2)24h后，每间隔24h定时每孔分别补加2.5μL 100％甲醇；
(3)96h后，取出48孔板，置于超净台中静置沉淀约15min。每孔吸取约300μL沉淀上清置于1.5mL离心管中，12000rpm，10min，离心，收集上清并一一标号，-20℃保存。
本试验采用抑菌圈活性检测的方法检测表达上清液的抑菌活性，并根据其抑菌活性结果对转化子的表达水平进行了筛选。
(1)取出冻存的绿脓杆菌ATCC 27853菌液，用接种环在LB固态平板上Z字形划线，于37℃培养箱中倒置培养出单菌落。挑取接种于10mL LB。37℃振荡培养12-16h活化；
(2)吸取活化菌液100μL，接种于10mL MHB培养液中，37℃，200rpm振荡过夜培养直至OD600nm＝0.4；
(3)在超净台中吸取1mL活化菌液接种于100mL MHA培养基中(温度约为50℃)，用灭菌玻璃棒迅速搅拌混匀，搅拌过程中尽量减少气泡的产生。迅速倒入方形培养皿中，静置20min凝固后用打孔器对应在方形培养基的36个对应网格中打36个孔；
(4)吸取48孔板中36个发酵孔中的发酵上清150μL，对应加入在方板的36孔中。并同时在另外三个方形培养皿加入相同量的BMGY作为对照。37℃温育24h后观察抑制圈的形成及大小。
T9W的48孔板表达上清液对绿脓杆菌ATCC 27853的抑菌圈试验结果，挑取抑菌区域较大的阳性转化子48孔板A-30进行摇瓶表达。表达上清经TCA沉淀浓缩后进行Tricien-SDS-PAGE蛋白电泳定性检测，具体步骤如下：
通过Tricine-SDS PAGE蛋白电泳初步验证发酵液上清中T9W表达情况。
(1)内外槽分别倒入阴阳两极缓冲液，放置于冰盒中；
(2)电泳条件：将处理后的样品依次加入到点样孔中，30V恒压电泳，直至溴酚蓝跑至夹层下沿且为一条直线后换110V恒压继续电泳。直至溴酚蓝离分离胶底部1cm左右停止电泳。整个过程在4℃中进行；
(3)凝胶震荡染色4h(考马斯亮蓝R-250染色液)后加入脱色液浸没胶块，震荡脱色直至背景干净，条带清晰。取出胶块，利用凝胶成像系统观察并分析。
实施例3
纯化
为达到纯度较高的纯化效果，选用凝胶过滤层析、离子交换柱层析先对样品进行脱盐和粗提纯，除去样品中的还原剂、盐离子、大蛋白等杂质，再使用RP-HPLC的方法对AMPs粗品进行纯化，并对纯化产物进行浓度鉴定。最后利用低温真空冷冻干燥机(-54℃，0.016mba)冻干，每升发酵液可得重组蛋白纯品13mg。
G25去盐柱柱子信息：40x400mm；平衡缓冲液：50mM AB缓冲液(乙酸-乙酸钠)，pH＝4.0；流速：2.0mL/min
SP Sepharose F.F.阳离子交换柱柱子信息：HiTrapTM 5mL；纯化缓冲液:20mMPBS pH 6.7+1M NaCl pH 4.0；流速：1mL/min
分离色谱柱为C18色谱柱(VYDAC-C18，30×250mm，5μm)。色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.4mL/min；流动相组成为A：去离子水+0.1％三氟乙酸(TFA)，B：乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)。
表4为RP-HPLC对重组抗菌肽T9W的纯度鉴定
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽T9W的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgcgtcctt tgctgagacc attgttgaga ccattgctga gaccactgtt gagaccattg 60
ttgagaccac tgctgagacc actg 84

Claims (1)

1.一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法，其特征在于，方法如下：根据毕赤酵母的密码子偏爱性对抗菌肽T9W的氨基酸序列进行人工设计编码，编码抗菌肽T9W的DNA序列如SEQ ID No.1所示，并在其5’端连接限制性核酸内切酶XbaI酶切位点和Kex2信号肽切割位点，3’端连接两个终止密码子TAA，在基因片段终端连接限制性核酸内切酶XhoI酶切位点，将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA-T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10，利用电转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌毕赤酵母菌X-33中，在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。
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