CN109627285A - 迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用。本发明公开了一种迦得拟微绿球藻抗菌肽，氨基酸序列为HGAG或RWKKF；该迦得拟微绿球藻抗菌肽能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，用于制备食品防腐剂(天然食品防腐剂)或抗菌类药物。

Description

迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用。具体为以迦得拟微绿球藻蛋白为原料，经木瓜蛋白酶时序性水解后分离纯化和序列分析获得抗菌肽并明确其序列，属于生物医学领域。

背景技术

随着食品工业中防腐剂的大量使用以及抗生素的滥用产生的超级细菌对人体和环境造成的不利影响愈发严重，寻找一种高效、安全和绿色环保的天然抗菌剂用作新型食品防腐剂以及抗生素替代品已成为人们关注的重点。

抗菌肽是一种小分子多肽，广泛存在于动物、植物和细菌中，是生物体先天性免疫系统的重要组成部分。抗菌肽含有较多碱性氨基酸，具有一定的阳离子特性，能和细胞膜上的电负性分子结合并发生作用，对较大的离子强度和较高pH具有耐受性。肽链具有两亲性，序列的N端一般包含亲水性氨基酸，这些亲水结构域能提高活性多肽与细胞膜的相互作用；C端含较多疏水性氨基酸，有利于活性肽进入细胞膜的双分子层。抗菌肽在溶液状态下能发挥杀菌作用，高温下对活性影响不大，在100℃下加热10-30min仍能保持活性。

一般来说，抗菌肽有三个来源，即天然来源，基因工程制备和人工合成。虽然由基因工程制备和人工制备更为方便，但这两种方法只能得到已知的抗菌肽，而更多新型的抗菌肽则需要从天然来源中寻找。

微藻作为一个天然的资源宝库，具有多种活性物质，尤其是丰富的蛋白质资源，可以作为提取抗菌肽的重要来源。目前已经从螺旋藻、小球藻、伪鱼腥藻、集胞藻、念珠藻、席藻和颤藻等提取物中分离得到了对病原微生物的生长具有抑制作用的多肽。而迦得拟微绿球藻又具有安全无毒、蛋白含量高、可异养培养、含有多种活性物质等特点，是理想的抗菌肽筛选原料。因此，通过酶解微藻蛋白来开发新型的抗菌肽用于天然防腐剂和抗菌类药物开发具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖、抗菌谱广、人工合成方便的迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用，并且可将该组抗菌肽用作天然食品防腐剂和抗菌类药物的研究和开发。

为了解决上述技术问题，本发明提供迦得拟微绿球藻抗菌肽，该抗菌肽氨基酸序列为以下任一：

HGAG、RWKKF。

作为本发明的迦得拟微绿球藻抗菌肽的改进：

HGAG抗菌肽的分子量为340.90Da；

RWKKF抗菌肽的分子量为764.01Da。

本发明还同时提供了上述迦得拟微绿球藻抗菌肽的用途：抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

作为本发明的迦得拟微绿球藻抗菌肽的用途的改进：

所述抑制革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；

所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌。

作为本发明的迦得拟微绿球藻抗菌肽的用途的进一步改进：

所述抗菌肽用于制备食品防腐剂(天然食品防腐剂)或抗菌类药物。

本发明的抗菌肽对常见的细菌具有抑制作用。

本发明的抗菌肽可以由迦得拟微绿球藻经木瓜蛋白酶酶解后分离纯化或人工合成得到。

本发明采用的技术方案为：

1.异养方式发酵迦得拟微绿球藻，以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源进行通气搅拌发酵，提供充足氮源，有效积累更多蛋白，发酵结束后将迦得拟微绿球藻冷冻干燥。

2.迦得拟微绿球藻冻干粉配制成悬浮液，经破壁、盐析、脱盐等步骤提取得到藻蛋白，以木瓜蛋白酶时序性水解藻蛋白，以两种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌为供试菌种，分别测定0、0.5、1、2、4、8h水解时间下，水解产物的抑菌活性，并对有抑菌活性的水解产物，用Prep-C18半制备柱和Sepax Bio-C18多肽分析柱进一步分离纯化，最终得到无法再分离的活性组分P7，且抗菌肽的抑菌活性在逐步分离纯化中提高。

3.使用电喷雾四极杆飞行质谱(ESI-Q-TOF-MS)，通过二级质谱(MS/MS)扫描测定抗菌肽的分子量及氨基酸序列。最终结果表明活性组分P7为两种小分子多肽的混合物，氨基酸序列分别为HGAG和RWKKF，分子质量分别为340.90Da和764.01Da。人工合成抗菌肽，验证了其抑菌活性。

本发明的有益效果在于：

本发明所得的抗菌肽为微藻源抗菌肽，首次由迦得拟微绿球藻蛋白经木瓜蛋白酶水解所得，抗菌谱广，抑菌活性强，能有效抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等细菌的生长与繁殖，可将该抗菌肽用作天然食品防腐剂和抗菌类药物的研究和开发。

本发明所得的抗菌肽为小分子阳离子多肽，包含较多碱性氨基酸，结构简单，可人工合成，成本低。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为迦得拟微绿球藻蛋白2h水解液的Prep-C18半制备柱反相高效液相色谱图。

图2为活性组分F6的Sepax Bio-C18多肽分析柱反相高效液相色谱图。

图3为迦得拟微绿球藻蛋白水解产物抗菌肽的序列图。

图4为活性组分P7一级MS图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、迦得拟微绿球藻的异养培养

迦得拟微绿球藻菌种经活化及扩大培养，再转接至50L的机械发酵罐，以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源进行通气搅拌发酵，在温度28℃、pH7.0、通气量2vvm的条件下进行培养，当发酵液中的残糖降至5g/L时，用900g/L葡萄糖溶液进行补料发酵(使糖浓度维持在4-6g/L)。发酵终止时(发酵时间共为36小时)，发酵液经4℃，4000rpm离心15min，收集藻细胞，-86℃、0.10mbar冷冻干燥至恒重。

实施例2、迦得拟微绿球藻蛋白的提取

称取微藻冻干粉，采用0.01M、pH6.8的PBS缓冲液；按照料液比1:10(w/w)配制微藻悬浮液200mL，在1000bar压力下进行高压均质破壁，收集破壁液，在4℃、10000rpm下离心10min，收集上清液。在搅拌条件下缓慢添加固体硫酸铵至80％饱和浓度，充分搅拌30min，在4℃静置12h，静置完成后在4℃，12000rpm下离心30min以沉淀蛋白质组分。

收集沉淀，于2倍体积的0.01M，pH6.8的PBS缓冲液中复溶，之后用葡聚糖凝胶G25脱盐柱(内装葡聚糖凝胶G25 5ml)进行蛋白脱盐(控制流速为1.0ml/min)，冷冻干燥藻蛋白(-86℃、0.10mbar冷冻干燥至恒重)，储存在-20℃下备用。

实施例3、迦得拟微绿球藻水解肽制备及分离纯化

1)、迦得拟微绿球藻蛋白时序性水解

称取一定质量的蛋白冻干粉(实施例2所得)，溶于0.01M PBS配制成10mg/mL浓度的蛋白溶液进行酶反应，调节反应体系温度至60℃，使用0.01M NaOH调节pH至6.5，加入占蛋白冻干粉质量2％木瓜蛋白酶，水解时间分别为0、0.5、1、2、4、8h六个时间。各时间段水解完毕后，收集水解液在85℃水浴锅中灭酶10min，在4℃、8000rpm离心10min，收集上清液。通过抑菌活性测定，发现水解物的活性随水解时间增加而逐渐增加，在水解2h时达到最大，之后随着水解时间的增加活性无明显变化。选取2h水解产物，冷冻干燥(-86℃、0.10mbar冷冻干燥至恒重)得到多肽干粉。

2)、半制备反相高效液相色谱法分离抗菌肽

将多肽干粉配制成10mg/ml浓度的水溶液，上样前，使用0.22μm过滤器对样品进行过滤，经Prep-C18(10μm，21.2×250mm)半制备柱分离得到5个组分，结果见图1。

Prep-C18半制备柱分离具体为：去离子水作为洗脱液A，乙腈作为洗脱液B，以流速5ml/min进行洗脱。水解液洗脱程序如下：0-30min，40％B；30-35min，40-100％B；35-40min，100-0％B，检测波长为220nm。每分钟收集一管，合并相同的组分并冷冻干燥以备后续研究。因此，当洗脱时间为3min时，出现第一个峰，获得F1；随着洗脱时间增加，共出现5个不同的峰，获得F1～F5。

合并具有抑菌活性的F4和F5组分，记为F6。经Sepax Bio-C18多肽分析柱进一步分离，具体为：在上样前，使用0.22μm过滤器对样品进行过滤，上样浓度1mg/mL，流动相为去离子水/三氟乙酸(1000：1，v/v)作为洗脱液A，乙腈/三氟乙酸(1000：1，v/v)作为洗脱液B，以流速1mL/min进行梯度洗脱。蛋白质和多肽洗脱程序如下：0-10min，20％B；10-40min，20-60％B；40-50min，60-0％B。检测波长为220nm。每分钟收集一管，合并相同的组分并冷冻干燥以备后续研究。因此，当出现第一个峰时，获得P1；当出现第二个峰时，获得P2；以此类推，得到8个组分，结果见图2。

实施例4、迦得拟微绿球藻抗菌肽的筛分及鉴定

1)、迦得拟微绿球藻抗菌肽的抑菌活性检测

采用96孔板比浊法进行各样品的最小抑菌浓度(Minimal inhibitoralconcentration,MIC)的检测，以两种革兰氏阳性菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和两种革兰氏阴性菌——大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)作为供试菌种。

具体操作如下：

菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于肉汤培养基，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为10⁶CFU/mL。使用排枪向96孔板的每个孔中加入50μL MH琼脂培养基，之后向A行的第一个孔(A1)加50μL的蒸馏水作为阴性对照，向A行的第二个孔(A2)加入50μL1％庆大霉素水溶液作为阳性对照，A行其他孔中分别加入50μL 1％(质量％)的样品溶液。A行共12个孔，A3～A12分别加入样品，即0h、0.5h、1h、2h、4h水解产物，每个样品进行两次重复，8h水解产物在另一块96孔板上进行实验，具体步骤同上。

将A行所有小孔中的溶液混合均匀，之后进行梯度稀释至H行(每向下一行的稀释度为0.5)。最后向每个孔中都加入50μL经稀释后浓度为10⁶CFU/mL的菌悬液，混匀后盖上盖子经封口膜密封后放入37℃培养箱中孵育24h。培养完成后用酶标仪在610nm波长下测定每个孔中的吸光度。若样品溶液吸光度大于阴性对照则无抑菌效果，若小于阴性对照则有抑菌效果。具有抑菌效果所对应的最低样品浓度即为该组分的最低抑菌浓度(MIC)。MIC值与抑菌活性等级对应关系见表1。

测得水解物抑菌活性随水解时间增加而逐渐增加，水解2h时达到最大，之后随着水解时间的增加抑菌活性无明显变化。因此，选取2h水解产物，用Prep-C18半制备柱分离得到5个组分(F1～F5)，重复上述抑菌实验步骤测定各组分的抑菌活性。

测得组分F4、F5有抑菌活性后，将F4、F5合并记为F6，用Sepax Bio-C18多肽分析柱进一步分离F6得到8个组分(P1～P8)，重复上述抑菌实验步骤测定各组分的抑菌活性。

表1、MIC值与抑菌等级对应表

对Prep-C18半制备柱分离得到5个组(F1-F5)分别进行抑菌试验，发现F4和F5具有抑菌活性，结果见表2。

表2、迦得拟微绿球藻蛋白2h水解液经Prep-C18分离后各组分抑菌活性

合并F4、F5这两组分记为F6，进一步分离得到8个组分(P1-P8)，对每个组分再次进行抑菌活性，其中P7具有最强抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的MIC最佳可分别达到0.315mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL和20mg/mL，结果见表3。

表3、活性组分F6经Sepax Bio-C18分离后各组分抑菌活性

2.质谱法鉴定多肽结构

使用电喷雾四极杆飞行质谱(ESI-Q-TOF-MS)，通过二级质谱(MS/MS)扫描测定抗菌肽分子量氨基酸序列。质荷比扫描范围20-40000m/z，质量精度<1ppm。配制1μg/mL样品溶液，选择正离子化模式进行质谱扫描，选取一级质谱中离子强度最大的母离子，利用Analyst TF软件分析该离子下的二级质谱图。经质谱鉴定分析，表明P7为两种小分子多肽的混合物，氨基酸序列分别为HGAG和RWKKF，结果见图3，分子质量分别为340.90Da和764.01Da，结果见图4。

实施例5：抗菌肽人工合成及活性验证

根据所得到的抗菌肽序列，由上海淘普生物科技有限公司进行人工合成，通过LC-MS/MS分析鉴定人工合成多肽的分子量及纯度，

合成所得的HGAG抗菌肽的分子量为340.90Da、纯度≥98％；

合成所得的RWKKF抗菌肽的分子量为764.01Da、纯度≥98％。

将上述合成的HGAG抗菌肽、RWKKF抗菌肽替代实施例4中的样品，即，配制成1％(质量％)的HGAG抗菌肽溶液、1％(质量％)的RWKKF抗菌肽溶液；按照实施例4所述方法进行检测。

合成所得的HGAG抗菌肽对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的MIC分别达到0.315mg/mL，1.25mg/mL，2.5mg/mL，20mg/mL。

合成所得的RWKKF抗菌肽对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌MIC分别达到1.25mg/mL，20mg/mL，5mg/mL，对绿脓杆菌无抑制作用。

结果见表4。

表4、HGAG抗菌肽、RWKKF抗菌肽的抑菌活性

从而验证了抗菌肽的抑菌活性，发现其有具有显著的抑菌效果。通过对蛋白质数据库及抗菌肽数据库的比对，发现得到的两种多肽都是新型的抗菌肽。

对比实验1、将表5所述的人工合成肽按照实施例5所述方法进行检测，所得结果如下表5所述。

表5、针对4种菌的MIC(mg/mL)

NI:not inhibitory不抑制；

ND:not determined不确定，没有做过抑菌实验。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 迦得拟微绿球藻抗菌肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Gly Ala Gly

1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Trp Lys Lys Phe

1 5

Claims (5)

1.迦得拟微绿球藻抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的氨基酸序列为以下任一：

HGAG、RWKKF。

2.根据权利要求1所述的迦得拟微绿球藻抗菌肽，其特征在于：

HGAG抗菌肽的分子量为340.90Da；

RWKKF抗菌肽的分子量为764.01Da。

3.如权利要求1或2所述的迦得拟微绿球藻抗菌肽的用途，其特征在于：抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

4.根据权利要求3所述的迦得拟微绿球藻抗菌肽的用途，其特征在于：

所述抑制革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；

所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌。

5.根据权利要求3所述的迦得拟微绿球藻抗菌肽的用途，其特征在于：所述抗菌肽为食品防腐剂或抗菌类药物。