CN108060100B - 一种多功能暹罗芽孢杆菌及其生物活性物质的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的多功能暹罗芽孢杆菌及其生物活性产物的制备和应用。暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)SCSIO 05746，保藏编号：CGMCC No.13640。该菌具有产生bacillaenes、bacillbactins、bacillomycins、bacilysin、butirosin、difficidins、fengycins、macrolactins、surfactins、terpenes、PKS III和多种核糖体肽化合物的能力。可作为生物防治菌剂进行应用。用该菌还可以制备线性的铁载体linbacillbactins A‑B(1‑2)和siambactin A(3)，以及制备具有抗细菌、抗真菌和细胞毒等生物活性bacillaenes、bacillbactins、bacillomycins、fengycins、macrolactins和surfactins等其他类型化和物。且所制备的这些化合物在农业、食品和医药等领域具有应用前景。

Description

一种多功能暹罗芽孢杆菌及其生物活性物质的制备和应用
技术领域：
本发明属于微生物和新型医药农药领域，具体为一种新的多功能暹罗芽孢杆菌和以暹罗芽孢杆菌制备多种生物活性次生代谢产物及其它们的应用。
背景技术：
芽孢杆菌在自然界中分布十分广阔，它们能产生具有多种生物功能的代谢产物和酶等功能分子，因而在医药开发、工业酶制剂、生物农药、饲料加工、水产养殖中水体净化以及环境污染治理等等众多领域均具有重要的应用价值。特别是其中的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌应用特别广泛。
暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)是2010年报道的一个新种，首次分离自泰国腌制的螃蟹中。截至目前属于该种的菌株报道仍然不多，且相当一部分菌株仅仅依据16SrRNA基因序列同源性分析和形态学特征而被鉴定，因此在芽孢杆菌复杂的分类学上具有较大的不确定。据查询，在GenBank数据库中只有KCTC 13613T(AJVF00000000)，XY18(LAGT00000000)，SRCM100169(LYUE01000000)几株暹罗芽孢杆菌的在分类学获得了全基因组数据的支持，其核心基因的同源性较高，可作为其他菌株是否是暹罗芽孢杆菌的最重要依据。
在生物防治方面，暹罗芽孢杆菌展现出与其相近种解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)同样出色的生物防治能力。据报道，暹罗芽孢杆菌模式菌株KCTC 13613T能抑制立枯丝核菌和藤黄微球菌(J Bacteriol 2012,194(15):4148-4149)；暹罗芽孢杆菌L13的发酵液制备微生物海藻肥，具有对烟草花叶病病毒的消毒作用以及绿豆的促生长作用(CN201310165929.5)；暹罗芽孢杆菌LYLB4能防治梨轮纹病和软腐病(CN201610048328.X)；暹罗芽孢杆菌FC12-05能拮抗番茄疫霉根腐病菌(西北农林科技大学学报2012,40:107-114)；或者暹罗芽孢杆菌与其他芽孢杆菌复合制成微生物复合肥制剂(CN201610718598.7)。但是暹罗芽孢杆菌对其他作物和病菌的防治和促生作用仍需不断发掘。此外，使用暹罗芽孢杆菌制备活性产物鲜有报道，如暹罗芽孢杆菌FC12-05可产生被20％硫酸铵饱和度溶液沉淀的抗菌活性产物(可能是蛋白质)，暹罗芽孢杆菌FJAT-28592能产生与iturin A在HPLC保留时间一致抗真菌脂肽(农业生物技术学报2016,24:261-269)。在这些零星的报道中，其活性物质的结构没有被确定或者缺少充分的光谱学数据.
在查阅文献时，发明人发现陈倩倩等将芽孢杆菌FJAT-28592经16S rRNA基因序列比较和进化树分析鉴为暹罗芽孢杆菌，但是他们研究中的2个核心基因的ituD和lpa-14均与贝莱斯芽孢杆菌JS25R(原鉴定为甲基营养型芽胞杆菌，2016年经基因组比较重新修正其分类地位)同源性最高，均超过99.4％(农业生物技术学报2016,24:261-269)。因此芽孢杆菌FJAT-28592有很大的可能是贝莱斯芽孢杆菌。然而芽孢杆菌L13、LYLB4、FC12-05等都是主要依据16S rRNA基因序列来确定它们属于暹罗芽孢杆菌，这种分类结论在复杂的芽孢杆菌类群中往往存在偏差。可见，这些为数不多被称之为暹罗芽孢杆菌的真正分类地位还需要更多的证据来验证。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一株新的暹罗芽孢杆菌-暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)SCSIO 05746，其于2017年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.13640。
本发明的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746包括一个约4.27Mb环状染色体和一个约12.4kb的质粒，具有合成bacillaenes、bacillbactins、bacillomycins、bacilysin、butirosin、difficidins、fengycins、macrolactins、surfactins、terpenes、PKS III和多种核糖体肽化合物的能力。
本发明的第二个目的是提供暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746在制备bacillibactin，surfactins，macrolactin，bacillomycins D，fengycins或bacillaenes类型化合物中的应用。
进一步优选，所述的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746在制备linbacillbactins A、linbacillbactins B、siambactin A、bacillibactin、normal-C13Val7surfactin、anteiso-C13Leu7surfactin、iso-C14Leu7surfactin、normal-C14Leu7surfactin、anteiso-C14Leu7surfactin、macrolactin D、normal-C14bacillomycin D、iso-C16bacillomycin D)、normal-C17bacillomycin D和/或iso-C17bacillomycin D中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种利用暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746制备化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、制备暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746的发酵液；
b、将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂XAD7固相吸附发酵液中活性成分，吸附完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用体积分数80-100％乙醇解吸，回收乙醇溶剂后得的粗提物A；将经XAD7吸附后的残留上清液pH调节至2-3，静置，然后离心获得沉淀，沉淀经甲醇溶解提取，甲醇提取物经浓缩干燥获得粗提物B；
c、将粗提物A，采用硅胶柱层析，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集体积比为5:95-10:90的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，即得流份FA2；收集体积比为15:85-30:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到FA4；收集体积比为15:85-30:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到流份FA5；
d、将粗提物B，采用硅胶柱层析，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集体积比为10:90-40:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到流份FB3，流份FB3使用半制备反相HPLC纯化得到linbacillbactins A、linbacillbactins B、siambactinA和bacillibactins；
e、将流份FA2经凝胶LH20除杂，采用半制备反相HPLC纯化得到normal-C13Val7surfactin、anteiso-C13Leu7surfactin、iso-C14Leu7surfactin、normal-C14Leu7surfactin和anteiso-C14Leu7surfactin；
f、将流份FA4采用反相ODS快速色谱进行分离，收集乙腈：水(v/v)比为3:5-5:5洗脱液，再经采用半制备反相HPLC纯化得到macrolactin D及其衍生物；
g、将流份FA5采用半制备反相HPLC纯化得到normal-C14bacillomycin D、iso-C16bacillomycin D、normal-C17bacillomycin D和iso-C17bacillomycin D。
优选，所述的制备暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746的发酵液是以MSM液体培养基作为发酵培养基进行发酵获得，所述的MSM液体培养基每升含有20g蔗糖，2g NH4NO3，3g KH2PO4，10g Na2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.2g酵母提取物，50μg CaCl2，50μg MnSO4·4H2O，余量为水，pH 7.0-7.2。
本发明的第四个目的是提供式(I)所示中的任一化合物：
Figure BDA0001533798930000051
其中化合物1为linbacillbactins A；化合物2为linbacillbactins B；化合物3为siambactin A。
本发明的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746能产生杀真菌、杀虫、杀细菌以及诱导植物抗性的多种生物活性物质。
因此本发明的第四个目的是提供暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746在制备生物防治菌剂中的应用。
本发明还提供了normal-C17bacillomycin D或iso-C17bacillomycin D或linbacillbactins A、B或siambactin A在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。
本发明还提供了macrolactin D在制备抗耐药的Staphylococcus aureus MRSAGDE4P037P、Clostridium perfringens FSKP20或Erwinia carotovora药物中的应用。
本发明还提供了linbacillbactins A、B或siambactin A在制备抗氧化药物中的应用。
本发明的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746核心基因的同源性与上述三株菌达97％以上，且基于1345个核心基因构建的系统进化树与模式菌株KCTC 13613T位于同一进化分支，证明暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746是一株新的暹罗芽孢杆菌。该菌株具有合成bacillaenes、bacillbactins、bacillomycins、bacilysin、butirosin、difficidins、fengycins、macrolactins、surfactins、terpenes、PKS III和多种核糖体肽化合物的能力。能产生杀真菌、杀虫、杀细菌以及诱导植物抗性的多种生物活性物质，具有作为生物防治菌剂进行应用。
暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)SCSIO 05746，于2017年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.13640。
附图说明：
图1是暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746的菌落形态；
图2是线性bacillibactin类铁载体linbacillbactins A-B(1-2)和siambactin A(3)结构特征；
图3是暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746的16S rDNA序列分布与差异；
图4是基于1345个单拷贝核心基因的系统进化树确定暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746的分类地位；
图5是暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746次生代谢产物合成基因分布(不包括7个microcins核糖体肽)；
图6是暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746在MSM发酵培养基中可产生的次生代谢产物类型；
图7是固相萃取-酸沉淀“两步法”提取的粗提物A和B活性成分HPLC-DAD分析；
图8是Linbacillbactin A(1)的HRESIMS检测结果；
图9是Linbacillbactin A(1)的1H-1H COSY和HMBC的重要相关；
图10是化合物1-14的化学结构图；
图11是Linbacillbactin B(1)的HRESIMS检测结果；
图12是Siambactin A(3)的HRESIMS检测结果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1深海来源新暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746的鉴定
菌株SCSIO 05746，分离自印度洋-4617m的深海沉积物(94.3364°E,1.4256°N)。该菌在牛肉膏蛋白胨培养基上，形成圆形肉白色菌落，菌落表面扁平、干燥、有褶皱，接种环挑菌时菌落内部呈粘液状，有拉丝感(图1)。
将菌株SCSIO 05746接种于含3％人工海盐的TSB液体培养基中，37℃培养12h后按照常规方法提取总DNA。然后采用PacBio RS三代测序技术结合Illumina HiSeq2500二代测序技术进行基因组测定和组装，获得菌株SCSIO 05746的基因组完成图，包括一个约4.27M的环状染色体和一个12.395kb的环状质粒(表1)。其中包含9个拷贝的16S-23S-5SrRNA共转录本。值得注意的是其16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)在172、194和198位碱基有变化，其中G172G194T198(GGT)有6个拷贝，C172A194T198(CAT)为2个拷贝，而C172G194A198(CGA)仅1个拷贝(图3)。当菌株SCSIO 05746的16S rDNA序列为GGT时，与Bacillus velezensis CR-502T(AY603658)和Bacillus siamensis KCTC 13613T(AJVF01000043)同源性最高均为99.93％；当为CAT时与B.siamensis KCTC 13613T(AJVF01000043)和Bacillus nakamuraiNRRL B-41091T(LSAZ01000028)同源性均最高为99.8％；当为CGA时与B.siamensis KCTC13613T(AJVF01000043)最高为99.8％。可见单纯以16S rRNA基因序列为核心的分类体系，特别是芽孢杆菌等复杂类群的分类结果不完全可靠。为此，基于基因组比较的核心基因组系统发育树发展成为芽孢菌准确分类的新方法(IntJ Syst Evol Micr 2016,66:2438-2443)。通过与菌株SCSIO 05476相近的15株芽孢菌进行比较基因组学研究，发现了1345个单拷贝的核心同源基因。基于上述核心基因，使用MEGA6.0软件构建Neighbour-joining树，结果表明菌株SCSIO 05476与暹罗芽胞杆菌模式菌株KCTC 13613T进化关系最为密切聚在同一个进化分支上(图4)，可将菌株SCSIO 05476鉴定为暹罗芽胞杆菌。
菌株SCSIO 05476与目前报道的暹罗芽胞杆菌相比，其存在于高压、低温、高盐等非常独特的生态环境。更重要的是其16S rRNA基因序列共有9个拷贝3种序列，这与目前已经报道的暹罗芽胞杆菌均不相同，显示出其稀有性和独特性。进一步比较GenBank数据库中保存的3株暹罗芽胞杆菌芽孢杆菌发现，它们中大多数如bacillibactin、fengycin、surfactin、difficidin和bacillaene等保守的生物合成基因同源性均大于97.5％，显示出它们的相似性。但菌株SCSIO 05476具有macrolactin和bacillomycin D的生物合成基因簇，其他菌株没有macrolactin生物合成基因簇，且上述3株菌存在的是与bacillomycin D基因簇同源约81.9％-83.0％的iturin A生物合成基因簇(表2)。以上说明菌株SCSIO05476一个独特的暹罗芽胞杆菌的新菌株，将其命名为：暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)SCSIO 05746，于2017年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.13640。
表1暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746的遗产学特征
Figure BDA0001533798930000081
Figure BDA0001533798930000091
表2几株暹罗芽孢杆菌的基因组比较
Figure BDA0001533798930000092
*The encoded amino acid sequences are incomplete
实施例2暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746生产多样的生物活性物质和制备方法
使用antiSMASH在线分析平台对暹罗芽胞杆菌SCSIO 05746的基因组中蕴含的次生代谢产物合成基因簇进行分析和矫正，发现其含有潜在19个次生代谢产物合成基因簇，包括bacillaenes、bacillbactins、bacillomycins、bacilysin、butirosin、difficidins、fengycins、macrolactins、surfactins、terpenes等多种类型次生代谢产物基因簇(图5)。
进一步使用OSMAC策略发酵提高SCSIO 05746产生次生代谢产物的化学多样性，通过活性筛选和HPLC-DAD-MS分析，发现以MSM液体培养基(成分包括：20g蔗糖，2gNH4NO3，3gKH2PO4，10g Na2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.2g酵母提取物，50μg CaCl2，50μg MnSO4·4H2O，自来水1L，pH 7.0-7.2)为发酵培养基时，该菌至少能产生6中不同结构类型的次生代谢活性产物(图6)。包括许多新的fengycins、macrolactins和bacillaenes类型的生物活性产物(表3)。
将暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746接种于含人工海盐的TSB固体培养基上培养24h活化，然后接种于MSM液体培养基，28℃培养16h作为种子培养基，得到发酵种子液；然后将发酵种子液按照体积比2％接种于相同的MSM液体培养基，共发酵20L，28℃220rpm振荡培养3天，得到发酵液。接着将发酵液离心去除菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂XAD7固相吸附发酵液中活性成分，每1000mL发酵液中加入80mL大孔吸附树脂XAD7；吸附2h完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用95％乙醇解吸附，回收乙醇溶剂后得的18.9g粗提物A；进一步将经XAD7吸附后的残留上清液pH调节至2-3，4℃放置过夜，5000g离心15min获得沉淀，沉淀经甲醇多次溶解提取获得粗提物B，将减压蒸馏干燥后称重为3.89g。粗提物A和B色谱分析结果如图7所示。
将粗提物A与硅胶质量比约为1:2的比例拌样，采用快速硅胶柱色谱法分离(500-600目)，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集体积比为5:95-10:90的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，即得含surfactins类物质流份(FA2)；收集体积比为15:85-30:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到含macrolactins和bacillaenes类物质流份(FA4)；收集体积比为15:85-30:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到含bacillomycins D和fengycins的流份(FA5)。
将粗提物B，采用快速硅胶柱色谱法分离(500-600目)，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集体积比为10:90-40:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到含线性和环状bacillibactins的流份(FB3)。流份(FB3)进一步使用C18YMC-PackODS-A色谱柱
Figure BDA0001533798930000111
，经15％-30％的乙腈水溶液(即从体积分数15％的乙腈水溶液逐渐递增到体积分数30％的乙腈水溶液线性梯度洗脱)洗脱，流速为2.5ml/min，于保留时间10-30min收集4个色谱峰获得纯的linbacillbactins A(5.6mg，化合物1)和B(15mg，化合物2)，siambactin A(4.3mg，化合物3)和bacillibactin(135mg，化合物4)。
进一步将流份FA2经凝胶LH20除杂，采用半制备反相HPLC(色谱柱C18YMC-PackODS-A，5μm,
Figure BDA0001533798930000112
)，经60％-85％的乙腈水溶液(即从体积分数60％的乙腈水溶液逐渐递增到体积分数85％的乙腈水溶液线性梯度洗脱)洗脱，于15-35min依次获得surfactins类化合物，如normal-C13Val7surfactin(4.5mg)、anteiso-C13Leu7surfactin(20mg)、iso-C14Leu7surfactin(120mg)、normal-C14Leu7surfactin(188mg)和anteiso-C14Leu7surfactin(500mg)。将流份FA4再采用反相ODS快速色谱进行分离，收集乙腈：水(v/v)比为3:5-5:5洗脱液，再经采用半制备反相HPLC(色谱柱C18YMC-Pack ODS-A，5μm,
Figure BDA0001533798930000113
)，使用35％-45％的乙腈水溶液(即从体积分数35％的乙腈水溶液逐渐递增到体积分数45％的乙腈水溶液线性梯度洗脱)洗脱，于10-25min获得macrolactins类化合物，如macrolactin D(28mg)及其衍生物(均<5mg)。将流份FA5采用半制备反相HPLC(色谱柱C18YMC-PackODS-A，5μm,
Figure BDA0001533798930000122
)，经20％-85％的乙腈水溶液(即从体积分数20％的乙腈水溶液逐渐递增到体积分数85％的乙腈水溶液线性梯度洗脱)梯度洗脱，流速为2.5ml/min；于保留时间15-35min收集4个色谱峰获得纯的normal-C14bacillomycin D(5.5mg)、iso-C16bacillomycin D(6mg)、normal-C17bacillomycin D(48mg)和iso-C17bacillomycin D(80mg)。
表3菌株SCSIO 05746在MSM发酵培养基中可产生的新的次生代谢活性产物
Figure BDA0001533798930000121
Figure BDA0001533798930000131
实施例3活性物质的结构解析
化合物1(linbacillbactin A)为白色粉末，HRESIMS数据显示一个m/z 915.2829的[M+H]+离子峰(图8)，对应分子式为C40H46N6O19，不饱和度为18。1H和13C NMR(500MHz,DMSO-d6)以及HSQC谱显示，其存在9个羰基碳、18个sp2杂化的芳香碳(包括三个不连氧和6个连氧的季碳)、三个sp3连氧的次甲基、三个连氮次甲基、三个亚甲基、三个甲基和一个甲氧基(表4)。这些数据显示化合物1与bacillibactin具有相似的结构，但对称性因为开环被破坏，形成一个新的线性铁载体结构。进一步1H–1H COSY和HMBC数据显示了其三个-Thr-Gly-DHBA结构单元的连接顺序，以及δH 3.61与δC10a 170.2的远程相关确定了甲基酰化和开环的位置(图9)。因此化合物1作为新的化合物被命名为linbacillbactinA(图10)。
化合物2(linbacillbactin B)，白色粉末状，HRESIMS：m/z 897.2756[M+H]+推断其分子式为C40H44N6O18(图11)。1H-NMR和13C-NMR(500MHz，DMSO-d6)显示其与linbacillbactin A非常相似，但存在一些差异(表4)。主要是一个Thr的羟基碳信号消失，而一个甲基质子信号(δH13c 1.68)与新增的烯属质子信号(δH12c 6.69)存在COSY相关，与3个sp2杂化的碳信号(δC 134.312c,127.511c,163.110c)存在HMBC远程相关。说明化合物2是linbacillbactin A的一个Thr脱水形成脱氢酪氨酸(dehydrobutyrine，Dhb)的衍生物，因此化合物2作为linbacillbactin A的同系物被命名为linbacillbactin B(图10)。
化合物3(siambactin A)，白色粉末，HRESIMS给出一个m/z 883.2665[M+H]+，推断其分子式为C39H42N6O18(图12)。1D-NMR数据显示出其与化合物1和2具有极其相似的结构，尤其是化合物3含有和化合物2一样的Dhb结构单元(表4)。进一步比较发现化合物3不存在linbacillbactin B中的甲基信号δH13a 1.08和δC13a 16.9，结合一个明显的的自旋体系相关信号δH12a-11a 4.39/4.33-4.73-8.54提示化合物3是化合物2中苏氨酸被丝氨酸置换的产物。由于这种氨基酸底物的识别和掺入发生在这类化合物的骨架合成中，因此化合物3被认为是一个线性bacillibactin家族新类型的成员，命名为siambactin A(图10)。
其他的十一个已知化合物bacillibactin(4),normal-C13Val7surfactin(5)，anteiso-C13Leu7surfactin(6)，iso-C14Leu7surfactin(7)，normal-C14Leu7surfactin(8)，anteiso-C14Leu7surfactin(9)，macrolactin D(10)，normal-C14bacillomycin D(11)，iso-C16bacillomycin D(12)，normal-C17bacillomycin D(13)，和iso-C17bacillomycin D(14)(图10)均由MS和1D-NMR光谱数据比较报道相关文献确定。具体结构见图10所示。
Figure BDA0001533798930000151
其中化合物1为linbacillbactins A；化合物2为linbacillbactins B；化合物3为siambactin A。
表4化合物1–3的NMR数据(DMSO-d6)
Figure BDA0001533798930000152
Figure BDA0001533798930000161
实施例4暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746具有生物防治的能力
暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746具有复杂和多样的代谢途径，能利用多种碳水化合物、氨基酸、小分子有机酸以及芳香类物质等众多碳源和能源，能合成多种铁载体，以及能产生影响芽胞杆菌的游动性、菌落形态和生物膜形成等多细胞行为的信号分子样脂肽surfactins，同时surfactins和fengycins等可作为诱导因子作用于植物细胞的受体蛋白，诱导植物产生系统抗性。特别是SCSIO 05746具有多种多样的蛋白水解酶和葡聚糖酶以及众多抗病原真菌、细菌的抗生素bacillomycins D、fengycins、bacillaenes和macrolactins(表5)。这说明菌株SCSIO 05746具有较强的营养竞争和空间竞争能力，可通过裂解病原菌细胞、拮抗以及诱导植物系统抗性等多种方式发挥生防作用，具有作为生物防治制剂应用的能力。
表5.暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746产生的活性物质在生物防治中的作用
Figure BDA0001533798930000171
实施例5生物活性产物的活性测定和应用
Bacillomycins D类物质因为具有很强的抗真菌活性而闻名，它的细胞毒活性鲜有报道。本发明采用MTT法发现normal-C17bacillomycin D(13)和iso-C17bacillomycin D(14)对人乳腺癌细胞MDA-MB-435表现出较强的抑制活性，IC50分别为7.951±0.650和6.127±0.473。据文献报道Macrolactin D对Staphylococcus aureus、Alternaria solani、Pyricularia oryzae等细菌和真菌没有抑制作用(The Journal of Antibiotics 2008,61:668-674)。我们发现macrolactin D对耐药的Staphylococcus aureus MRSA GDE4P037P和临床重要病原Clostridium perfringens FSKP20、以及植物重要病原细菌Erwiniacarotovora都有一定抑制作用；此外macrolactin D离去7为糖侧链活性会显著增强，建议其可以以低毒的macrolactin D成药，实际在体内水解掉糖侧链变成活性更高的成分发挥抗炎作用。新化合物linbacillbactins A和B以及siambactin A作为铁载体家族的新成员有较强的鳌合Fe3+或Fe2+的活性，它们都含有3个抗氧化作用基团2，3二羟基苯甲酸单元，因而具有较强的抗氧化作用；同时它们还表现出微弱的细胞毒作用，对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的平均抑制率为7.187％。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种多功能暹罗芽孢杆菌及其生物活性物质的制备和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1538
<212> DNA
<213> 暹罗芽孢杆菌 SCSIO 05746(Bacillus siamensis)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gsttgtttga 180
accgcatggt tcaracawaa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240
cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300
ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420
cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480
gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540
gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600
gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660
gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720
agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840
tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900
aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020
gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140
tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260
aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320
tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacct 1538

Claims (6)

1.暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)SCSIO 05746，保藏编号：CGMCC No.13640。
2.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746在制备bacillibactin，surfactins，macrolactin，bacillomycins D，fengycins或bacillaenes类型化合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746在制备linbacillbactins A、linbacillbactins B、siambactin A、bacillibactin、normal-C13Val7 surfactin、anteiso-C13 Leu7 surfactin、iso-C14 Leu7 surfactin、normal-C14 Leu7surfactin、anteiso-C14 Leu7surfactin、macrolactin D、normal-C14 bacillomycin D、iso-C16 bacillomycin D)、normal-C17bacillomycin D和/或iso-C17 bacillomycin D中的应用；
所述的linbacillbactins A、linbacillbactins B、siambactin A的结构如式(I)所示：
Figure FDA0002811152930000011
4.一种利用权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746制备化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、制备暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746的发酵液；
b、将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂XAD7固相吸附发酵液中活性成分，吸附完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用体积分数80-100％乙醇解吸，回收乙醇溶剂后得粗提物A；将经XAD7吸附后的残留上清液pH调节至2-3，静置，然后离心获得沉淀，沉淀经甲醇溶解提取，甲醇提取物经浓缩干燥获得粗提物B；
c、将粗提物A，采用硅胶柱层析，按照二氯甲烷：甲醇v/v比为100:0-0:100梯度洗脱，收集体积比为5:95-10:90的甲醇-二氯甲烷v/v的洗脱组分，即得流份FA2；收集体积比为15:85-30:60的甲醇-二氯甲烷v/v的洗脱组分，得到FA4；收集体积比为15:85-30:60的甲醇-二氯甲烷v/v的洗脱组分，得到流份FA5；
d、将粗提物B，采用硅胶柱层析，按照二氯甲烷：甲醇v/v比为100:0-0:100梯度洗脱，收集体积比为10:90-40:60的甲醇-二氯甲烷v/v的洗脱组分，得到流份FB3，流份FB3使用半制备反相HPLC纯化得到linbacillbactins A、linbacillbactins B、siambactin A和bacillibactins；
e、将流份FA2经凝胶LH20除杂，采用半制备反相HPLC纯化得到normal-C13 Val7surfactin、anteiso-C13 Leu7 surfactin、iso-C14 Leu7 surfactin、normal-C14 Leu7surfactin和anteiso-C14 Leu7surfactin；
f、将流份FA4采用反相ODS快速色谱进行分离，收集乙腈：水v/v比为3:5-5:5洗脱液，再经采用半制备反相HPLC纯化得到macrolactin D及其衍生物；
g、将流份FA5采用半制备反相HPLC纯化得到normal-C14 bacillomycin D、iso-C16bacillomycin D、normal-C17 bacillomycin D和iso-C17 bacillomycin D。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备暹罗芽孢杆菌SCSIO05746的发酵液是以MSM液体培养基作为发酵培养基进行发酵获得，所述的MSM液体培养基每升含有20g蔗糖，2g NH4NO3，3g KH2PO4，10g Na2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.2g酵母提取物，50μg CaCl2，50μg MnSO4·4H2O，余量为水，pH 7.0-7.2。
6.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌SCSIO 05746在制备生物防治菌剂中的应用。
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