CN113046262B - 寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1及其应用 - Google Patents

寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及寡养单胞菌Stenotrophomonas‑CAULIU‑1及其应用。本发明提供寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas‑CAULIU‑1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21632。该菌株在适宜条件下能够在水热转化水相产物中生长，同时能够将水热转化水相产物中的含氮、含碳有毒物质降解为水、二氧化碳等物质，降低水热转化水相产物的毒性，提高其可生化性，有利于水热转化水相产物的进一步利用和达标排放。

Description

寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1及其应用。
背景技术
利用水热转化技术能够将农作物秸秆、餐厨垃圾、市政污泥、畜禽粪污等低能量密度的生物质资源转化为高能量密度的生物原油和生物炭等。水热转化产物包括气相、油相、水相和固相，经水热转化后生物质原料中的元素会在不同产物中重新分配，其中原料中一部分的碳与氮会转移到水相产物中，导致水相产物中COD(化学需氧量)含量较高。
与一般的生活污水、工业污水和畜禽养殖污水不同，水热转化水相产物中含有酚类、醛类、嘧啶、吡啶、酮类、烷类化合物，具有强烈的刺激性气味，如果不经处理排放会对环境造成严重污染。水热水相产物性质复杂，原料的特性、反应条件对水相产物的物质种类和含量影响较大，水相的形成机理和物质种类和含量目前仍然不明晰。水热转化水相的毒性已经成为限制水热转化技术绿色发展的重要阻力。
目前，水热转化水相处理主要利用微藻养殖、厌氧消化进行能源回收。然而，在水相中的酮类、酚类以及吡啶、吡嗪和吡咯等含氮杂环物质会严重抑制藻类的生长，想要进行微藻养殖必须额外加入大量的水稀释水相，使有毒物质浓度降低到合适水平；在厌氧消化体系中，由于水热原料中超过50％的氮进入了水相中，导致氨氮及含氮杂环物质的积累，抑制了厌氧菌群的活性，从而抑制甲烷生产过程。申请人在前期研究中通过水热转化水相的微生物毒性实验发现，320℃条件下产生的微藻水相产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果和0.5mg/ml的链霉素相当；厌氧发酵体系中添加6％的微藻水热液化水相会减少80％的甲烷产生；水热转化水相中的含氮物质、酚类、醛类和烃类物质对微藻的生长有明显的抑制作用。
综上所述，水热转化水相成分复杂、对生物的毒性较大，导致当前的生化处理效果不理想。若想要通过生化法再利用水相产物需要利用物理、化学方法或者利用有效微生物降解降低其毒性。利用微生物进行水热水相的处理与物理、化学方法相比具有环保、便于控制的优势，但是，目前尚缺乏能够耐受水热转化水相并对其中的物质进行高效降解的微生物。
发明内容
本发明的目的是提供一株寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1，该菌株能够耐受水热转化水相并对其中的含氮物质和COD进行高效降解。本发明的另一目的是提供该寡养单胞菌的应用。
本发明提供寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1，该菌株于2021年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.21632。
寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1分离自实验室土壤(中国农业大学，北京)。
寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供含有所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的菌剂。
本发明所述的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述菌剂可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明还提供由所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1经发酵制备得到的发酵物。
本发明通过实验证明，寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1能够耐受水热转化水相体系的环境，在水热转化水相中快速生长并高效降解其中的有机物，降低其COD和总氮含量，减少其中的有机物种类数量，进而有效降低水热转化水相的生物毒性。
基于寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的功能和特性，本发明提供寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的应用。
具体地，本发明提供所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1或含有寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的菌剂或由寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1制备得到的发酵物在水热转化水相产物降解中的应用。
本发明所述的水热转化水相产物包括有机物和无机物，其中有机物包括选自酚类、醇类、醛类、酮类、烷类、含氮杂环化合物(例如：吡啶、嘧啶等)中的一种或多种。
本发明提供所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1或含有寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的菌剂或由寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1制备得到的发酵物在降低水热转化水相产物COD中的应用。
本发明所述的COD物质包括但不限于碱类化合物、萜类化合物、酮类化合物、苷类化合物、酯类化合物、酚类化合物、醛类化合物等。
本发明提供所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1或含有寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的菌剂或由寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1制备得到的发酵物在水热转化水相产物无害化处理中的应用。
本发明还提供所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1或含有寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的菌剂或由寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1制备得到的发酵物降低水热转化水相产物的生物毒性中的应用。
本发明还提供一种水热转化水相产物的处理方法，该方法为将所述寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1或含有寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的菌剂或由寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1制备得到的发酵物接种于水热转化水相产物中进行培养。
优选地，所述培养为在25-37℃培养。更优选为在30-37℃下振荡培养。
优选地，所述方法中，接种量为102-108CFU寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1/mL水相产物。
作为本发明的一种优选实施方式，所述水热转化水相产物处理方法包括如下步骤：
(1)将寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1扩大培养至菌液浓度为102～108CFU/mL，得到接种菌液；将所述接种菌液与麸皮按质量比1:1混匀，30℃下晾干，得到菌剂；
(2)将步骤(1)中的菌液按照35-80％的接种量接种到水热转化水相产物中，或者，将步骤(1)的菌剂按照7-20％的接种量接种到水热转化水相产物中，在30-37℃、曝气或非曝气条件下振荡培养。
优选地，步骤(2)中，所述曝气条件为：曝气速率为0-95L/min，曝气时间1.5-5h/天。
本发明中，所述水热转化水相的制备原料包括但不限于畜禽粪污、秸秆、餐厨垃圾、人粪、水藻、水华等生物质原料。
本发明的有益效果在于：本发明提供的寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1在适宜条件下能够在水热转化水相产物中生长，同时能够将水热转化水相中的碱类化合物、萜类化合物、酮类化合物、苷类化合物、酯类化合物、酚类化合物、醛类化合物、吡啶和含磷化合物等有毒物质降解，降低水热转化水相中的COD和总氮含量，进而降低水热转化水相产物的毒性，提高水热转化水相的可生化性，有利于水热转化水相产物的进一步利用和达标排放。此外，该菌株通过在水热转化水相中转化获得的生物量，可以进一步回收利用，提高生物质水热转化技术路径的能量转化率。
附图说明
图1为本发明实施例1中基于寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1构建的系统发育树。
图2为本发明实施例3中寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1处理微藻水热转化水相的降解效果，其中，A：40％的微藻水热转化水相，B：30％的微藻水热转化水相，C：15％的微藻水热转化水相，D：8％的微藻水热转化水相，E：NA培养基，A1-E1：依次为A-E的水热转化水相经振荡培养72h后的菌液体系。
图3为本发明实施例3中气相色谱-质谱联用检测30％微藻水热转化水相经寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1降解前的物质峰图。
图4为本发明实施例3中气相色谱-质谱联用检测30％微藻水热转化水相经寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1降解后的物质峰图。
图5为本发明实施例3中30％微藻水热转化水相中菌株的生长曲线，其中，A为大肠杆菌在NB培养基中的生长曲线，B为寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1在NB培养基中的生长曲线，C为寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1在30％微藻水热转化水相中的生长曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的活化培养基和扩大培养基均为NA培养基：牛肉浸膏1.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，去离子水1000mL。121℃湿式灭菌20min，冷却备用。
实施例1寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的分离、纯化和保藏
1、培养基的准备：
使用NA培养基：牛肉浸膏1.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，去离子水1000mL。121℃湿式灭菌20min，冷却备用。
2、菌株的筛选、分离、纯化和保藏
(1)样品采集
寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1是从实验室土壤(中国农业大学，北京)刮取的微生物中经筛选、分离和纯化获得的。
(2)菌株的鉴定
将分离、纯化获得的寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1经生理生化和分子生物学鉴定，确定其为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)。寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
基于寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1构建其系统进化树，结果如图1所示。
(3)菌株的保藏
寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1已于2021年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.21632。
实施例2利用寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1降解猪粪水热转化水相
以猪粪的水热转化水相产物为处理对象，猪粪的水热转化水相产物的性质参数如下：pH 8.1，化学需氧量(COD)为89.6g/L，总氮(TN)含量4.7g/L。
利用寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1降解猪粪水热转化水相的方法包括如下步骤：
(1)将寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1接种至活化培养基中，37℃恒温箱中活化培养24h，得活化菌种；
(2)将步骤(1)的活化菌种接种于扩大培养基中，在37℃、180rpm条件下扩大培养至菌液浓度为107CFU/mL得到菌剂；
(3)将步骤(2)制备的菌剂按照20％的接种量接种到100L猪粪水热转化水相产物中，，在37℃、180rpm条件下振荡、曝气培养，其中曝气速率为90L/min，曝气时间2h/天。培养72h，菌株Stenotrophomonas-CAULIU-1的浓度为107CFU/mL，水热转化水相产物变为近白色，浑浊度较大。
将降解后的水热转化水相于12000rpm离心10min，检测水相中物质含量，检测结果如下：pH 6.7，化学需氧量(COD)为66.4g/L，总氮(TN)含量2.8g/L。
实施例3利用寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1降解微藻水热转化水相
以微藻水热转化水相产物为处理对象，微藻水热转化水相产物的性质参数如下：pH 8.8，化学需氧量(COD)为101.1g/L，总氮(TN)含量22.3mg/L。
利用寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1降解微藻水热转化水相的方法包括如下步骤：
(1)将寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1接种至活化培养基中，37℃恒温箱中活化培养24h，得活化菌种；
(2)将步骤(1)的活化菌种接种于扩大培养基中，在27℃、180rpm条件下振荡培养48h，至菌液浓度为107CFU/mL，得接种菌液；
(3)将步骤(2)制备的接种菌液添加到微藻水热转化水相中，使微藻水相在最终的处理体系中的体积百分含量分别为40％、30％、15％和8％，检测各个处理组水相中物质含量，pH、化学需氧量(COD)、总氮(TN)。在37℃、180rpm条件下振荡培养72h，菌株Stenotrophomonas-CAULIU-1的浓度为107CFU/mL，水热转化水相产物变为近白色，浑浊度较大(图2)。
将降解后的微藻水热转化水相于12000rpm离心10min，检测各个处理组水相中的物质含量，结果如表1所示。
表1微藻水热转化水相处理后的COD和pH
Figure BDA0002966518360000081
利用气相色谱-质谱联用检测微藻水热转化水相中降解前和降解后的物质，采用岛津GC2010气相色谱-质谱联用仪，配备DB-5色谱柱，对30％的微藻水热转化水相处理组进行检测。其中，图3为降解前30％的微藻水热转化水相中的物质检测结果，图4为降解后30％的微藻水热转化水相中的物质检测结果。具体的检测结果如表2和表3所示，结果表明，经过处理后，水相中物质种类数量减少39％左右。
表2 30％的微藻水热转化水相物质降解前的GC-MS检测结果
Figure BDA0002966518360000082
Figure BDA0002966518360000091
表3 30％的微藻水热转化水相降解后的GC-MS检测结果
Figure BDA0002966518360000092
Figure BDA0002966518360000101
进一步利用大肠杆菌抑菌圈实验检测水相毒性：分别吸取200μL降解前和降解后的30％微藻热转化水相，添加到放置于涂布有大肠杆菌菌液的平板牛津杯中，37℃培养12h，观察抑菌圈直径。结果显示，降解前的30％微藻热转化水相抑菌圈直径为10.32mm，降解后的水相没有观察到明显抑菌圈。
分别检测大肠杆菌和寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1在NB培养基和含有30％微藻热转化水相中的生长曲线。在接种大肠杆菌和寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1后，每隔2h，吸取2ml培养液，12000rpm离心2min后重新溶解到1ml蒸馏水中，在630nm下，利用普朗酶标仪检测吸光度。
结果如图5所示，Stenotrophomonas-CAULIU-1在30％的微藻水热转化水相中的生长虽然存在一定的延缓，但是随着培养时间的延长，Stenotrophomonas-CAULIU-1对水相逐渐适应，能够利用微藻水热转化水相中的物质成分进行生长。而大肠杆菌在30％的微藻水热转化水相中的OD一直＜0.2，变化不明显(由于OD较低，未在图中示出)。以上结果表明，大肠杆菌在30％的微藻水热转化水相中的生长受到严重抑制，相比之下，Stenotrophomonas-CAULIU-1则能够较好地生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1及其应用
<130> KHP211111515.8
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctgcttct ggtgcaacaa actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga 60
acgtattcac cgcagcaatg ctgatctgcg attactagcg attccgactt catggagtcg 120
agttgcagac tccaatccgg actgagatag ggtttctggg attggcttac cgtcgccggc 180
ttgcagccct ctgtccctac cattgtagta cgtgtgtagc cctggccgta agggccatga 240
tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcggtctcct tagagttccc 300
accattacgt gctggcaact aaggacaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 360
tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg ttcgagttcc cgaaggcacc 420
aatccatctc tggaaagttc tcgacatgtc aaggccaggt aaggttcttc gcgttgcatc 480
gaattaaacc acatactcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt 540
cttgcgaccg tactccccag gcggcgaact taacgcgtta gcttcgatac tgcgtgccaa 600
attgcaccca acatccagtt cgcatcgttt agggcgtgga ctaccagggt atctaatcct 660
gtttgctccc cacgctttcg tgcctcagtg tcagtgttgg tccaggtagc tgccttcgcc 720
atggatgttc ctcccgatct ctacgcattt cactgctaca ccgggaattc cgctaccctc 780
taccacactc tagttgtcca gtttccactg cagttcccag gttgagccca gggctttcac 840
aacagactta aacaaccacc tacgcacgct ttacgcccag taattccgag taacgcttgc 900
acccttcgta ttaccgcggc tgctggcacg aagttagccg gtgcttattc tttgggtacc 960
gtcatcccaa ccaggtatta gccggctgga tttctttccc aacaaaaggg ctttacaacc 1020
cgaaggcctt cttcacccac gcggtatggc tggatcaggc ttgcgcccat tgtccaatat 1080
tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg accgtgtctc agttccagtg tggctgatca 1140
tcctctcaga ccagctacgg atcgtcgcct tggtgggcct ttaccccgcc aactagctaa 1200
tccgacatcg gctcattcaa tcgcgcaagg cccgaaggtc ccctgctttc acccgtaggt 1260
cgtatgcggt attagcgtaa gtttccctac gttatccccc acgaaaaagt agattccgat 1320
gtattcctca cccgtccgcc actcgccacc c 1351

Claims (9)

1.寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21632。
2.菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1。
3.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1或权利要求2所述的菌剂在水热转化水相产物降解中的应用。
4.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1或权利要求2所述的菌剂在降低水热转化水相产物COD中的应用。
5.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1或权利要求2所述的菌剂在水热转化水相产物无害化处理中的应用。
6.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1或权利要求2所述的菌剂在降低水热转化水相产物的生物毒性中的应用。
7.一种水热转化水相产物的处理方法，其特征在于，将权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1或权利要求2所述的菌剂接种于水热转化产物中进行培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养为在25-37℃培养。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述接种的接种量为102-108CFU寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)Stenotrophomonas-CAULIU-1/mL水相产物。
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