CN115491338B - 一种化工中间体降解菌株及其在废水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化工中间体降解菌株，该菌株为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida），菌株名为JH‑1，于2022年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.25342。本发明的降解菌株能够以化工中间体双乙烯酮作为唯一碳源进行生长，可有效降解高盐化工废水中的双乙烯酮。

Description

一种化工中间体降解菌株及其在废水处理中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种化工中间体降解菌株及其在废水处理中的应用。
背景技术
化工生产行业在生产的过程当中会产生非常多的综合化废水，化工废水具有高需氧量、高盐度和对微生物有毒性，是一种比较典型的难降解废水，水质的成分比较复杂，副产物也比较多，通常情况下反应原料多为溶剂类物质或者是环状结构的化合物；污染物的含量比较高，主要是由于生产中原料反应不完全和溶剂介质进入水体而起的；有毒有害物质比较多。由于化工废水大都有毒、有害、生物难降解，且结构复杂。生物降解法是处理工业废水的有效方法之一，与传统的理化处理方法相比，具有节能减排、针对性强、处理工艺成本低、不产生二次污染、环保、适应大批量水处理等优点。生物降解法是利用微生物的代谢将废水中的有机物同化或分解，该法处理工业废水的关键是筛选出降解相应污染物的高效降解菌种，常用的污泥驯化是获得适宜菌种的有效途径。为了提高生物法的处理效果，需要驯化培养出既能在具有生物毒性的废水中生存，又能耐受高盐的高效降解菌株。
双乙烯酮又名乙酰基乙烯酮或乙烯基乙酰-β-内酯，是一种重要的精细化工产品。由于双乙烯酮分子结构中含有两个双键，使得它具有高度的不饱和性，化学性质极为活泼。可与醇、胺、卤素、醛、酮、酸等发生加成、分解、硝化、聚合等反应，生成多种精细化工中间体。在农药、医药、染料、饲料添加剂、有机合成等行业具有广泛的应用。双乙烯酮还可以合成多种非常有经济价值的杂环和稠杂环化合物，如吡咯衍生物、异恶唑衍生物、嘧啶衍生物、噻唑衍生物、喹啉衍生物、呋喃衍生物、香豆素衍生物等，这些化合物可以做为农药、医药、染料等行业的重要原料。这些化工产品及其中间体易在生物体内累积且难以生物降解，对环境和人类健康的危害不能忽视。因此，有必要继续筛选高效降解菌且降解性状稳定的菌株实现菌剂的大规模工业化生产，为工业废水的微生物处理提供高效的微生物种质资源。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种化工中间体降解菌株，能够以化工中间体双乙烯酮作为唯一碳源进行生长，可有效降解高盐化工废水中的双乙烯酮。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种化工中间体降解菌株，该菌株为变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida），菌株名为JH-1，于2022年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.25342。
优选地，前述高盐化工废水中的盐含量为1~20g/L，双乙烯酮含量为0.05~2g/L；降解温度为10~35℃。
一种利用上述的降解菌株制备的菌剂。
一种上述的菌剂在降解高盐化工废水中双乙烯酮中的应用，高盐化工废水中的盐含量为1~20g/L，双乙烯酮含量为0.05~2g/L；降解温度为10~35℃。
一种上述的菌剂降解高盐化工废水的方法，具体步骤为：将菌剂按照1%~10%的投加量投加至高盐化工废水中，曝气处理，进行降解。
一种上述的菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：
S1、将斜面保存的菌株JH-1接种至LB固体培养基中进行活化培养；
S2、将活化后的菌株JH-1挑取单菌落接种至LB液体培养基，培养至对数生长期，然后离心收集菌体细胞，菌体细胞用无菌水洗涤，将收集的细菌细胞重悬在等体积无菌水中，作为种子液；
S3、将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养至对数生长期，发酵结束后所得发酵液即为降解菌剂。
优选地，前述步骤S1中，LB固体培养基的组分为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和琼脂2%；培养条件为：温度25~35℃，时间12~24h。
优选地，前述步骤S2中，LB液体培养基的组分为：双乙烯酮0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L；培养条件为：温度30~35℃，转速160~180rpm，时间12~24h。
优选地，前述步骤S3中，发酵培养基的组份为：葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO4 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4 0.2 g/L和双乙烯酮0.5g/L，pH值7.2~7.5；发酵培养条件为：无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1：0.6~1.2，搅拌速度为180~240rpm，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h。
本发明的有益之处在于：本发明提供了一株能降解化工中间体生产废水的变形假单胞菌JH-1，将变形假单胞菌菌剂投加到含双乙烯酮的生产废水，可实现24h内将其高效降解95%以上，在废水处理的应用中，该菌株耐受能力强，可以耐受高浓度的双乙烯酮，且对盐浓度、温度的适应范围广，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中菌株JH-1的菌落形态图；
图2为菌株JH-1对双乙烯酮的降解效果图；
图3为菌株JH-1对不同浓度双乙烯酮的降解效果；
图4为盐浓度对菌株JH-1降解效果的影响；
图5为温度对菌株JH-1降解效果的影响；
图6为菌株JH-1在处理实际化工废水时对双乙烯酮的降解效果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
变形假单胞菌的分离筛选及鉴定：
取某化工企业污水处理厂生化池中的活性污泥10mL，加入含200mg/L双乙烯酮的无机盐培养基中，30℃，160rpm条件下恒温振荡培养；培养5天后，以5%的接种量接入到新鲜无机盐培养基中，每次转接培养基中双乙烯酮浓度增加200mg/L，连续富集转接5次，使无机盐培养基中双乙烯酮浓度达到1200mg/L，获得富集液。
取1mL富集液用无菌水稀释至不同浓度梯度（10-3~10-7），取不同浓度梯度的稀释液0.2mL，涂布在含200mg/L双乙烯酮的R2A琼脂培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落进行划线分离纯化。将纯化后的菌株再次转接到无机盐液体培养基中30℃，160rpm培养3天，筛选到变形假单胞菌。
无机盐培养基组分为：NaCl 1.0g/L、（NH4）2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5 g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L和水1L，pH 7.0，固体培养基中加入 2% 的琼脂，培养基121℃灭菌20min。
R2A培养基组分为：葡萄糖0.5g/L、可溶性淀粉0.5g/L、酪蛋白0.5g/L、酵母提取物0.5g/L、胰蛋白胨0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.05g/L、KH2PO4 0.3g/L、丙酮酸钠 0.3g/L和水1L，pH 7.2，培养基中加入 2% 的琼脂，培养基121℃灭菌20min。
经分离纯化，筛选到一株能够高效降解化工中间体双乙烯酮的菌株，菌落形态如图1所示。菌株JH-1在LB平板上的菌落呈白色透明状，中间微凸出，边缘不规则，表面湿润，显微镜下为短杆状，革兰氏染色阴性。并于2022年7月18日保存于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.25342。
实施例2
菌株JH-1对双乙烯酮的降解效果：
挑取实施例1中获得的降解菌株JH-1单菌落接种于100mL LB液体培养基中，LB液体培养基的组分为：蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。于30℃、160rpm条件下培养至OD600=1.0，所得菌液于4℃、8000g离心5min，收集菌体，用无菌水洗涤三次后，等体积重悬于无菌水中作为种子液。
将所得种子液以5％接种量接种至以双乙烯酮为唯一碳源的无机盐培养基中，无机盐培养基中：双乙烯酮的初始浓度为1g/L、NaCl 1.0g/L、（NH4）2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L，pH 7.0，每隔4h取样，测定OD600值及培养液中双乙烯酮浓度，结果如图2所示。
由图2可知，菌株JH-1能以双乙烯酮作为唯一碳源生长，24h时对双乙烯酮的降解率可达96％。
实施例3
菌株JH-1对不同浓度双乙烯酮的降解效果：
配置无机盐液体培养基，使培养基中双乙烯酮浓度分别为 0.05g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L，取实施例2中菌株JH-1的种子液，以5%的接种量接到含不同浓度双乙烯酮的无机盐培养基中，无机盐培养基组分：NaCl 1.0g/L、（NH4）2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L，pH 7.0，在30℃、160rpm摇床中培养，24h后测定双乙烯酮含量，结果如图3所示。
由图3可知，菌株JH-1对浓度为0.05~2g/L双乙烯酮的降解率均在95%以上，表明该菌株可有效降解废水中的双乙烯酮。
实施例4
盐浓度对菌株JH-1降解效果的影响：
调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为 1.0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，取实施例2中菌株JH-1的种子液，以5%的接种量接到双乙烯酮浓度为1g/L的无机盐培养基中，无机盐培养基组分：NaCl 1.0g/L、（NH4）2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L，pH 7.0，在30℃、160rpm摇床中培养，24h后测定双乙烯酮含量，结果如图4所示。
由图4可知，盐浓度在1~20g/L范围内菌株JH-1对双乙烯酮的降解率在90%左右；以上结果表明该菌株对废水盐浓度具有高耐受性。
实施例5
温度对菌株JH-1降解效果的影响：
配置双乙烯酮浓度为1g/L 的无机盐液体培养基，无机盐培养基组分：NaCl 1.0g/L、（NH4）2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L，pH 7.0，以5%的接种量接种实施例2中菌株JH-1的种子液，分别于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，160rpm条件下振荡培养24h后，检测降解效果，结果如图5所示。
由图5可知，在10~35℃下，菌株JH-1均能有效降解双乙烯酮，降解率在90%以上。
实施例6
降解菌剂的制备：
将本发明斜面保存的菌株JH-1，接种至LB固体培养基于30℃活化培养；活化后挑取单菌落接种至LB液体培养基， LB液体培养基中蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L，30℃、160rpm振荡培养至对数生长期，然后离心收集菌体细胞；将收集的菌体细胞用无菌水洗涤3次后，等体积悬浮在无菌水中，作为种子液；将所得种子液以10％的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基组成为：葡萄糖8 g/L、酵母提取物5 g/L、K2HPO4 1 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4 0.2 g/L、双乙烯酮0.5g/L，pH值7.2~7.5，然后通入无菌空气，无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1：0.8，于发酵温度30℃，搅拌速度为220rpm的条件下发酵培养96h，使发酵液中活菌数CFU/mL为108~109个，发酵结束后所得发酵液即为微生物降解菌剂。发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例7
菌剂在实际化工废水中的降解应用：
处理水质来源于某化工企业生产废水，废水pH 8.2，全盐浓度10g/L，双乙烯酮浓度为1260mg/L。取生产废水5L，将菌株JH-1制备的菌剂按照10%的投加量投加至废水中，加入曝气头，曝气处理使其溶氧为2mg/L，每隔4h取样，测定污染物浓度，结果如图6所示。
如图6所示，废水中的双乙烯酮在12h之内浓度从1260mg/L降到了580mg/L，降解率为54%，经过24h，浓度下降到106g/L，降解率已达到92%。以上实验数据表明，菌株JH-1在实际化工中间体废水中具有良好的应用效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种化工中间体降解菌株，其特征在于，所述降解菌株为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida），菌株名为JH-1，于2022年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.25342。
2.一种权利要求1所述的降解菌株降解高盐化工废水中双乙烯酮的应用，其特征在于，所述化工废水中的盐含量为1~20g/L，双乙烯酮含量为0.05~2g/L；降解温度为10~35℃。
3.一种利用权利要求1所述的降解菌株制备的菌剂。
4.一种权利要求3所述的菌剂降解高盐化工废水中双乙烯酮的应用，其特征在于，所述化工废水中的盐含量为1~20g/L，双乙烯酮含量为0.05~2g/L；降解温度为10~35℃。
5.一种利用权利要求3所述的菌剂降解高盐化工废水的方法，其特征在于，具体步骤为：将菌剂按照1%~10%的投加量投加至高盐化工废水中，曝气处理，进行降解。
6.一种权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1、将斜面保存的菌株JH-1接种至LB固体培养基中进行活化培养；
S2、将活化后的菌株JH-1挑取单菌落接种至LB液体培养基，培养至对数生长期，然后离心收集菌体细胞，菌体细胞用无菌水洗涤，将收集的细菌细胞重悬在等体积无菌水中，作为种子液；
S3、将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养至对数生长期，发酵结束后所得发酵液即为降解菌剂。
7.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，LB固体培养基的组分为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和琼脂2%；培养条件为：温度25~35℃，时间12~24h。
8.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，LB液体培养基的组分为：双乙烯酮0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L；培养条件为：温度30~35℃，转速160~180rpm，时间12~24h。
9.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，发酵培养基的组份为：葡萄糖8g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO4 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4 0.2 g/L和双乙烯酮0.5g/L，pH值7.2~7.5；发酵培养条件为：无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1：0.6~1.2，搅拌速度为180~240rpm，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h。
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