CN114214233A - 一株苯乙烯降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株苯乙烯降解菌及其应用。本发明所涉及的苯乙烯降解菌剂经过16S rDNA鉴定为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，该菌株已于2021年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.22757。该菌剂在最佳条件下对初始浓度为60000mg/L的苯乙烯24h降解率99.97％，对苯乙烯的最大耐受浓度达100000mg/L。本发明所涉及的苯乙烯降解菌剂，能够减轻苯乙烯对生化处理体系的冲击，提高了含苯乙烯废水的治理效率，具有显著的经济和环保效益。同时，可将该菌株应用于苯乙烯污染废水及土壤或含苯乙烯有机废气的治理领域。

Description

一株苯乙烯降解菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株苯乙烯降解菌及其应用。
背景技术
苯乙烯是石化行业的重要基础原料，广泛用于塑料、合成橡胶、树脂及医药品等生产中，还可用于制药、燃料、农药及选矿等行业，是一种有重要价值的化合物。苯乙烯系列树脂的产量在世界合成树脂中居第三位，仅次于PE、PVC。苯乙烯的均聚物-聚苯乙烯是五大通用热塑性合成树脂之一，广泛用于注塑制品、挤出制品及泡沫制品3大领域，近年来需求发展增长旺盛。苯乙烯、丁二烯和丙烯腈共聚而成的ABS树脂是用量最大的大宗热塑性工程塑料，是苯乙烯系列树脂中发展与变化最大的品种，在电子电器、仪器仪表、汽车制造、家电、玩具、建材工业等领域得到了广泛应用。丁苯橡胶是丁二烯与苯乙烯共聚，是最大的通用合成橡胶品种，也是最早实现工业化生产的橡胶之一。丁苯胶的年耗量占合成橡胶的首位。
苯乙烯为无色透明油状液体，是苯取代乙烯的一个氢原子形成的有机化合物，乙烯基的电子与苯环共轭，易燃，有毒，难溶于水，能溶于醇类及醚类，暴露于空气中逐渐发生聚合及氧化。在苯乙烯的生产、使用、运输、贮藏过程中会有较大量苯乙烯进入大气和水体，造成大气和水的污染，同时对人体健康有害。苯乙烯有毒，毒性比苯弱，苯乙烯具有引人发笑的臭味，随浓度升高，刺激性增强，对眼和上呼吸道有刺激和麻醉作用，可刺激皮肤，对血液和肝有轻度损害作用，在通风不良的室内进食时会刺激胃黏膜，高浓度时有麻醉作用，吸入1％的蒸汽数分钟即失去知觉。
苯乙烯污染修复的方式主要包括物理法、化学法及生物法，物化方法修复周期较短，过程风险性较大，易造成二次污染，修复成本较高，随着国家环保力度的不断加大，生物法作为一种安全环保的修复方法在有机污染物修复领域的重要性日渐凸显，通过微生物代谢作用将苯乙烯转化为二氧化碳和水，以安全、环保、高效的方式实现了有毒有害物质的降解。
高效苯乙烯降解菌株的筛选是生物修复的关键，苯乙烯降解菌剂相关专利不多，且均未表明菌株的降解性能及应用推广，高效降解菌株的筛选及降解性能优化是生物修复的关键因素，对菌剂的推广应用及苯乙烯污染的修复至关重要。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一株苯乙烯降解菌及其应用。经过研究鉴定该菌株为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，对苯乙烯具有非常好的降解能力，可应用于化工行业含苯乙烯废水的生物法治理中。该变形假单胞菌在最佳条件下对初始浓度为60000mg/L的苯乙烯24h降解率99.97％，对苯乙烯的最大耐受浓度达100000mg/L。应用该菌株能够减轻苯乙烯对生化处理体系的冲击，提高含苯乙烯废水的治理效率，具有显著的经济和环保效益。同时，可将该菌株应用于苯乙烯污染废水及土壤或含苯乙烯有机废气的治理领域。
本发明的技术方案包括：
首先，本发明提出了一株苯乙烯降解菌，经过研究鉴定该菌株为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，该菌株于2021年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22757。
上述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)由某橡胶公司废水处理装置周围土壤及体系污泥中分离纯化得到，该菌株苯乙烯降解效率高、易于培养且有稳定的传代特性。
本发明所述的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)属革兰氏阴性，直或弯的杆菌，不产芽孢，以单极毛或数根极毛运动，罕见不运动者，需氧，不产生黄素色素；该菌株在普通营养琼脂上形成近圆形中等的乳白色菌落，边缘不整齐，菌落扁平，有褶皱。
其16SrDNA核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列；该16SrDNA序列经过BLAST比对显示，该菌株的16SrDNA的核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomons adaceae)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的菌株有100％的同源性。
本发明进一步提供了含有上述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的菌剂，可以为液体菌剂，也可以为固体菌剂。
具体的菌剂制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：将保存于4℃的变形假单胞菌菌种取出，置于室温下活化3-8h，由于菌种保藏于试管斜面营养琼脂培养基上，活化过程无需补加营养；
(2)液体种子制备：在无菌操作台中，用移液枪取10ml无菌水加入菌种保藏管内，并利用移液器反复吹打制备菌悬液，然后将菌悬液接种至50-500ml液体LB培养基中，振荡培养15-20h，培养条件为：温度28-38℃，振荡转速100-200r/min；
(3)高密度发酵：将变形假单胞菌液体种子按体积比1％-5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体深层发酵；发酵条件为：通无菌空气保持罐压0.02-0.05MPa，温度28-38℃，转速200-400r/min，溶解氧≧20％，培养时间为15-20h，得到液体菌剂。
步骤(3)高密度发酵的培养基为：葡萄糖1.8％-2.0％、豆粕2％-4％、硫酸铵0.01％-0.02％、硫酸镁0.03％-0.05％、氯化钠0.01％-0.03％、硫酸亚铁0.002-0.005％、氯化钙0.01％-0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
(4)干燥粉碎：将上述发酵得到的液体菌剂的菌体进行吸附、干燥、粉碎，得到固体菌剂，其有效活菌数10亿/g以上；
上述步骤(4)中的吸附、干燥、粉碎均采用本领域常规技术完成即可，在此不再进行赘述。
本发明更进一步的公开了上述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的应用，具体为降解苯乙烯方面的应用。
应用方法包括：将本发明所述的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)或其制备的菌剂加入到含苯乙烯废水中。优选的，苯乙烯浓度100000mg/L以下。
优选的，所述变形假单胞菌的应用条件为：溶解氧1-6mg/L，温度20-35℃，pH6-8。溶解氧过高不利于菌种分裂繁殖，应用过程中溶解氧过高还会将好氧池活性污泥打碎，不利于菌剂附着，同时还会伴随浮泥、跑泥，导致整个生化系统瘫痪。
更为优选的，应用时，变形假单胞菌的初始有效活菌数为≥5000cfu/mL.
其中应用固体菌剂时，优选先进行固体菌剂活化，具体为：将固体菌剂:水＝1:3-10的质量比混合均匀，于搅拌容器内搅拌活化16-24h；更优选的，水中含有葡萄糖1-3％，硫酸铵0.02-0.05％，氯化钠0.02-0.05％。
综上所述，利用本发明提供的苯乙烯降解菌剂及使用方法，解决了化工废水苯乙烯污染物治理难题，大大提高了含苯乙烯废水的生化处理效率，且不会对环境造成二次污染。
保藏信息
保藏时间：2021年6月23日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.22757
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名：变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)
附图说明
图1为实施例2苯乙烯降解菌剂耐受实验结果图；
图2为实施例5苯乙烯降解菌剂应用结果图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
实施例1苯乙烯降解菌剂的制备
(1)菌种活化：将保存于4℃的变形假单胞菌菌种取出，置于室温下活化3h，由于菌种保藏于试管斜面营养琼脂培养基上，活化过程无需补加营养；
(2)液体种子制备：在无菌操作台中，用移液枪取10ml无菌水加入菌种保藏管内，并利用移液器反复吹打制备菌悬液，然后将菌悬液接种至200ml液体培养基中，振荡培养20h，培养条件为：温度35℃，振荡转速170r/min；
(3)高密度发酵：将变形假单胞菌液体种子按体积比1.5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体深层发酵；发酵条件为：温度35℃，转速200r/min，培养时间为20h；
高密度培养基配方：葡萄糖2.0％、豆粕2.5％、硫酸铵0.01％、硫酸镁0.03％、氯化钠0.02％、硫酸亚铁0.003％、氯化钙0.01％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
高密度发酵条件：罐压0.02MPa，温度35℃，转速200r/min，溶解氧30％，培养时间为20h；
(4)干燥粉碎：将上述发酵得到的菌体进行吸附、干燥、粉碎，得到固体苯乙烯降解菌剂；
通过平板计数法检测，所得苯乙烯降解菌剂有效活菌数为15.5亿cfu/g。
实施例2苯乙烯降解菌剂的耐受性试验
分别建立苯乙烯浓度为5000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、150000mg/L的无机盐培养基体系，设置不加苯乙烯的空白体系，菌剂接种量1％，30℃、110r/min恒温震荡24h，24h后进行OD600的测定。
结果如图1所示，随着苯乙烯浓度的增大OD600呈现先增大后下降的趋势，浓度为100000mg/L时OD600达到最大，表明该浓度下菌株繁殖速度较快，浓度超过100000mg/L时菌株生长表现出一定的抑制性。
实施例3苯乙烯降解效果试验
具体验证方法如下：将保存的变形假单胞菌在超净工作台中接入无菌的LB液体培养基中，35℃、180rpm震荡培养16-20h，培养好的菌液以体积比为5％的接种量接入含有苯乙烯60000mg/L的LB液体培养基内，30℃、110r/min恒温震荡24h，每隔12h取样检测摇瓶内剩余苯乙烯的质量浓度，计算得出本发明变形假单胞菌对苯乙烯的降解率。
结果如表1所示，本发明变形假单胞菌对含60000mg/L苯乙烯的溶液24h降解率达99.97％。
表1菌株对苯乙烯降解效果验证
Figure BDA0003426019340000051
实施例4苯乙烯降解效果中试
将实施例1所制备的固体菌剂进行应用于某橡胶废水生化处理现场中试装置，具体方法如下：
(1)固体菌剂活化：将固体菌剂:水＝1:3-10的质量比混合均匀，于搅拌容器内搅拌搅拌活化16-24h；
(2)投加：菌剂活化完成后，计算污水处理系统曝气池有效池容(或保有水量)及苯乙烯污染物浓度，苯乙烯降解菌剂按投加后初始有效活菌数≥5000cfu/mL投加入曝气池内；
(3)调试检测：菌剂投加完成后，调试曝气池参数：溶解氧1-6mg/L，温度20-35℃，pH6-8，并每间隔10-24h取曝气池出水检测污染物指标；
该橡胶废水中苯乙烯浓度为61832.65mg/L，现场中试生化处理装置处理量50t/d，设计总停留时间80h，按照以上使用方法投加苯乙烯降解菌剂后，检测装置出水苯乙烯浓度为0mg/L，逐步缩短体系停留时间至20h，如表2所示好氧出水中苯乙烯浓度一直维持在10mg/L以下。
表2橡胶废水中试出水
Figure BDA0003426019340000061
实施例5苯乙烯降解菌剂在化工废水治理中的应用
山东某橡胶厂于2021年10月中旬发生助剂泄漏事故，导致大量苯乙烯随废水进入厂区废水生化预处理装置，曝气池苯乙烯检测浓度达50000mg/L左右，对生化系统造成严重冲击，导致出水指标COD、氨氮均不达标。因此，紧急投加苯乙烯降解菌剂(同实施例1菌剂)，具体使用方法如下：
(1)固体菌剂活化：将固体菌剂:水＝1:5的质量比混合均匀，于搅拌容器内搅拌活化16h；(水中含有葡萄糖1-3％，硫酸铵0.02-0.05％，氯化钠0.02-0.05％)
(2)投加：菌剂活化完成后，计算污水处理系统曝气池有效池容(或保有水量)及苯乙烯污染物浓度，苯乙烯降解菌剂按300ppm投加入曝气池内；
(3)调试检测：菌剂投加完成后，调试曝气池参数：溶解氧4mg/L，温度26℃，pH6.5，并每间隔24h取曝气池出水检测污染物指标；
跟踪检测15d，结果如图2所示好氧出水中苯乙烯浓度呈直线下降趋势，跟踪6d时出水苯乙烯浓度由最初的43200mg/L降至10mg/L以下，后期稳定在5mg/L以下。
综上所述，本发明所提供的菌株对于苯乙烯有明显的降解效果。
序列表
<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120> 一株苯乙烯降解菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1396
<212> DNA
<213> 变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicidaPseudomonasplecoglossicida)
<400> 2
tgcagtcgag cggatgaggg gtgcttgcac tctgattcag cggcggacgg gtgagtaatg 60
cctaggaatc tgcccgatag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac 120
gtcctacggg agaaagtggg ggatcttcgg acctcacgct atcggatgag cctaggtcgg 180
attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg 240
atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc 360
ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggctgtcgg ctaataccct gcagttttga 420
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tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttca gcaagttgga 540
tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctactgagct agagtacggt 600
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caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt caactagctg ttgggttcct 780
tgagaactta gtagcgaagc taacgcgata agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840
gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900
gaagcaacgc gaagaacctt acctggcctt gacatgctga gaactttcca gagatggatt 960
ggtgccttcg ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgttatggt 1080
gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140
tcatggccct tacggccagg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggttgcca 1200
agccgcgagg tggagctaat ctcacaaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260
cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca gaagtagcta 1380
gtctaacctt cggggg 1396

Claims (10)

1.一株苯乙烯降解菌，其特征在于，该菌株为变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22757。
2.权利要求1所述苯乙烯降解菌的应用，其特征在于，应用于降解苯乙烯。
3.权利要求1所述苯乙烯降解菌的应用方法，其特征在于，将该变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)或其制备的菌剂加入到含苯乙烯废水中；所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
4.根据权利要求3所述的苯乙烯降解菌的应用方法，其特征在于，苯乙烯浓度100000mg/L以下。
5.根据权利要求3所述的苯乙烯降解菌的应用方法，其特征在于，应用条件为：溶解氧1-6mg/L，温度20-35℃，pH6-8。
6.根据权利要求3或4或5所述的苯乙烯降解菌的应用方法，其特征在于，应用时，变形假单胞菌的初始有效活菌数为≥5000cfu/mL。
7.根据权利要求3所述的苯乙烯降解菌的应用方法，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂时，先进行固体菌剂活化，具体为：将固体菌剂:水＝1:3-10的质量比混合均匀，于搅拌容器内搅拌活化16-24h。
8.根据权利要求7所述的苯乙烯降解菌的应用方法，其特征在于，所述的水中含有葡萄糖1-3％，硫酸铵0.02-0.05％，氯化钠0.02-0.05％。
9.权利要求1所述苯乙烯降解菌的菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将保存于4℃的变形假单胞菌菌种取出，置于室温下活化3-8h，由于菌种保藏于试管斜面营养琼脂培养基上；
(2)液体种子制备：在无菌操作台中，取10ml无菌水加入菌种保藏管内，并利用移液器反复吹打制备菌悬液，然后将菌悬液接种至50-500ml液体LB培养基中，振荡培养15-20h，培养条件为：温度28-38℃，振荡转速100-200r/min；
(3)高密度发酵：将变形假单胞菌液体种子按体积比1％-5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体深层发酵；发酵条件为：通无菌空气保持罐压0.02-0.05MPa，温度28-38℃，转速200-400r/min，溶解氧≧20％，培养时间为15-20h，得到液体菌剂；
步骤(3)高密度发酵的培养基为：葡萄糖1.8％-2.0％、豆粕2％-4％、硫酸铵0.01％-0.02％、硫酸镁0.03％-0.05％、氯化钠0.01％-0.03％、硫酸亚铁0.002-0.005％、氯化钙0.01％-0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水。
10.根据权利要求9所述苯乙烯降解菌的菌剂制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(4)干燥粉碎：将上述发酵得到的液体菌剂的菌体进行吸附、干燥、粉碎，得到固体菌剂，其有效活菌数10亿/g以上。
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