CN107828692B - 一株陶厄氏菌及其微生物菌剂制备与应用 - Google Patents

一株陶厄氏菌及其微生物菌剂制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株陶厄氏菌及其微生物菌剂制备与应用。该陶厄氏菌的分类命名为Thauerasp.GSS10，保藏编号为GDMCCNo.60067。该菌株为革兰氏阴性菌，兼性好氧，棒状，菌体大小为0.6‑0.8×1.0‑2.0μm。在琼脂固体培养基平板上好氧培养3d后，菌落圆形，黄色，中央突起，菌落直径为1.2mm。生长温度为10‑45℃，在盐浓度范围为0～9％条件下均能生长与增殖；能够利用乙酸、丙酸、戊酸、3‑羟基丁酸、对羟基苯甲酸、3‑羟基苯甲酸、L‑脯氨酸、麦芽糖、苹果酸等作为唯一碳源，具有有机污染物快速降解及环境修复等多重功效，可以制备成为用于降解有机污染物、环境修复的微生物制剂。

Description

一株陶厄氏菌及其微生物菌剂制备与应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及陶厄氏菌及其微生物菌剂制备与应用。
背景技术
微生物是土壤生态系统的重要生命体，能通过氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，在促进土壤有机质分解和养分转化的同时，加速土壤物质循环。微生物能以有机污染物为唯一碳源和能源或与其他有机物进行共代谢而将其降解。因此，微生物在促进土壤物质循环的同时，还具有潜在的环境污染修复功能。
微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物(主要有土著微生物、外来微生物和基因工程菌)，在人为优化的适宜条件下，促进微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或将其降解成无毒物质而达到修复受污染环境的技术。如一些假单胞杆菌可降解DDT、艾氏剂、毒杀酚和敌敌畏，一些细菌能够通过分泌代谢产物及吸附、氧化还原作用等，实现重金属的固定及钝化。
陶厄氏属细菌是Betaproteobacteria纲下的一类革兰氏阴性细菌。现有研究发现，在反硝化条件下陶厄氏属细菌大部分能够利用苯酚、多酚、卤代苯甲酸盐及甲苯等作为碳源进行生长与繁殖，具有广泛的芳香族化合物降解能力。因此，陶厄氏属细菌被认为是一类广泛存在于自然界中并具有多种污染物降解能力的重要功能类群。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有腐殖质还原能力的新菌种：Thauera sp.GSS10。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在腐殖质还原中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种腐殖质还原和硝酸盐还原微生物制剂
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了一株陶厄氏菌，其分类命名为Thauera sp.GSS10，系从广东四会地下古森林沉积土样品中分离得到。已于2016年8月25日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏中心的地址为广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼。保藏中心给予的保藏编号为：GDMCC No.60067，提议的分类学名称为Thauera sp.，并于2016年9月1日检测确定菌株存活。
本发明的有益效果是：
本发明提供的Thauera sp.GSS10菌株为革兰氏阴性菌，兼性好氧，棒状，菌体大小为0.6-0.8×1.0-2.0μm。在琼脂固体培养基平板上好氧培养3d后，菌落圆形，黄色，中央突起，菌落直径为1.2mm。生长温度为10-45℃，在盐浓度范围为0～9％条件下均能生长与增殖。
本发明提供的Thauera sp.GSS10能够利用乙酸、丙酸、戊酸、3-羟基丁酸、对羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、L-脯氨酸、麦芽糖、苹果酸等作为唯一碳，具有有机污染物快速降解及环境修复等多重功效。
本发明的陶厄氏菌Thauera sp.GSS10可以制备成为用于降解有机污染物、环境修复的微生物制剂。
附图说明
图1为Thauera sp.GSS10的系统发育树。
具体实施方式
Thauera sp.GSS10的培养、分离、筛选及鉴定
1.1菌株的培养、分离
本发明的Thauera sp.GSS10是通过对四会地下森林沉积土富集培养进行分离纯化得到的。
具体分离纯化方法包括以下步骤：
1)称取地下森林沉积土样品5g浸泡于50mL液体富集培养基中，液体富集培养基的组成是：NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，NaHCO3 2.94g，Na2CO3 1.59g，维生素溶液10.0mL，微量元素溶液10.0mL。其中，维生素溶液是每升去离子水中含生物素2.0mg，叶酸2.0mg，维生素VB6 10.0mg，硫胺素5.0mg，核黄素5.0mg，烟酸5.0mg，泛酸钙5.0mg，维生素B12 0.1mg，对氨基苯甲酸5.0mg，硫辛酸5.0mg。微量元素溶液是每升去离子水中含氨三乙酸1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl1.0g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·6H2O0.1g，CaCl2 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.01g，AlK(SO4)2·12H2O 0.01g，H3BO30.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g；灭菌后添加1g葡萄糖和16g AQDS分别作为电子供体和电子受体；
2)往已接种的富集培养基中充混合气(N2/CO2＝80/20)30min，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况；当培养液颜色从无色变为橙黄色时，以10％的接种量将培养液转接至另一新鲜的液体富集培养基，厌氧操作及厌氧培养条件同2)，如此富集培养三次；
3)将第四代反应后的培养液采用稀释平板法进行梯度稀释，将稀释后的培养液0.1mL均匀涂布于TSA培养基上，置于厌氧工作站，30℃培养48h，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化，其中，TSA培养基的组成是：胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，D(+)-葡萄糖2.5g，NaCl 5.0g/L，K2HPO4 2.5g，琼脂粉20g/L，pH调节至7.2。
1.2菌体形态特性
采用常规的细菌电子显微镜观察，该菌株为革兰氏阴性菌，棒状，兼性好氧，菌菌体大小为0.6-0.8×1.0-2.0μm。生长温度为12-45℃，在盐浓度范围为0-9％条件下能生长与增殖。
1.3菌落形态特性
在TSA固体培养基平板上好氧培养3d后，菌落圆形，黄色，中央突起，菌落直径为1.2mm。
1.4生理生化特征
对菌株GSS10进行生理生化特征的鉴定，其结果见表1。
表1.菌株生理生化鉴定结果
Figure BDA0001485349660000031
表中：+表示为阳性，-表示为阴性
由鉴定结果(表1)可知：菌株GSS10兼性好氧，能在0-9％NaCl培养液中生长，而最适NaCl为1.0％；生长温度为12-45℃，最适生长温度为37℃；pH值为5-9.0，最适pH为7.0；接触酶阳性，氧化酶阳性；具有脲酶及七叶灵水解活性。菌株GSS10能够利用乙酸、丙酸、戊酸、3-羟基丁酸、对羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、L-脯氨酸、麦芽糖、苹果酸作为唯一碳源；G+C含量为61.6％。
1.5分子生物学特征
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24：1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用16S rRNA通用引物F27和R1492R扩增细菌的16S rRNA，将PCR扩增产物回收后进行测序。将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(Blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。GSS10的系统发育树结果见图1。
根据比对结果发现，该菌株与芽孢杆菌Thauera aminoaromatica S2T(AMXD01000247)的16S rRNA序列具较高同源性，相似度为98.06％；分子杂交结果显示，该菌株与T.aminoaromatica S2TDNA-DNA相关性为51.5％。
综上所述，16S rRNA同源序列比对可以确定本发明菌株Thauera sp.GSS10属于Thauera属。但由于本发明菌株Thauera sp.GSS10具有许多与现有Nitratireductor属菌显著不同的表型特征，加上DNA-DNA杂交和分子生物学分析结果表明本发明菌株不属于Thauera属的已有任何种。因此，根据现有数据，可以判定本发明菌株为Thauera属的一个新种，并于2016年8月25日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，编号为：GDMCC No.60067。
Thauera sp.GSS10利用不同底物进行腐殖质还原的效果
液体培养基配方：每升去离子水中含柠檬酸铁2.25g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同分离培养基)，于121℃灭菌20分钟，灭菌后添加不同电子供体(如：甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇、蔗糖等)1.0g，混合。从保存Thauera sp.GSS10的斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃，180min/rpm摇床活化菌体9h，使细菌数量达到指数生长期。以10％的接种量接种活化菌液于液体培养基中，厌氧工作站(N2/CO2＝80/20)下30℃静置培养；同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况。每隔一定时间(约5～10天)取4mL培养液，采用紫外-可见分光光度计在450nm处测定氧化态的AQDS含量，以450nm处的吸光度为指标，验证菌株的电子供体利用谱。实验结果如表2所示：
表2.Thauera sp.GSS10菌株利用电子供体还原AQDS(OD450)
甲酸 乙酸 丙酸 乳酸 乙醇 蔗糖
未加菌对照 0.0224 0.0238 0.0232 0.0226 0.0238 0.0231
加菌 0.1542 0.1235 0.1619 0.1711 0.1243 0.878
从表2结果可知，体系中加菌处理的OD450明显高于对照，说明Thauera sp.GSS10能够利用以上电子供体还原AQDS，使处理样品颜色逐渐加深。
微生物菌剂的制备
1)摇瓶培养：从Thauera sp.GSS10斜面上挑取菌苔一环接入装有100mL TSA培养基的锥形瓶中，37℃、200rpm/min摇床震荡培养24h。所述的TSA培养基配方为：胰蛋白胨15.0g，胰蛋白胨5.0g柠檬酸铁0.1g，NaCl 30.0g，水1000mL，pH 7.2；
2)种子罐发酵：将上述培养好的Thauera sp.GSS10发酵液接入10L发酵罐中，37℃、200rpm/min发酵培养36h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基；
3)发酵罐发酵：将上述培养好的Thauera sp.GSS10发酵液接入发酵罐中，37℃、200rpm/min发酵培养48h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基；
4)菌剂制备：将上述发酵液加入固体辅料中，固体辅料与发酵液的质量比为1.5∶1，搅拌均匀，28℃烘干，粉碎，经40目过筛，包装装袋。固体辅料含有活性碳60％，硅藻土40％。
制得的脱氮微生物菌剂成品经活菌计数，总菌数达到5亿/克以上。
Thauera sp.GSS10微生物菌剂的土壤修复效果
实验采用水稻盆栽试验。共设计2个处理，每个处理设3个重复，完全随机设计，共6盆。处理1为施用微生物菌剂Thauera sp.GSS10，施用量为1.0g/kg，处理2为对照，即不施用微生物菌剂。苯酚、甲苯及对羟基苯甲酸以外源添加方式加入，终浓度为200mg/kg。肥料与微生物菌剂以基肥方式一次性施入，肥料成分为尿素0.36g/kg、过磷酸钙(P2O5)0.28g/kg和氯化钾(K2O，20％)0.59g/kg。其余栽培及田间管理措施均按常规措施处理。每隔1d取土壤样品进行有机污染物测定，其降解率计算方式为：降解率(％)＝(200-样品中有机污染物浓度)/200×100。实验结果如表3所示。
表3有机污染物降解率的变化(％)
处理 0d 5d 10d 15d 20d
苯酚 0 50.25 75.37 86.49 92.15
甲苯 0 47.36 73.24 85.49 89.36
对羟基苯甲酸 0 36.29 65.38 81.24 86.35
结果表明，随着时间的推移，施用Thauera sp.GSS10微生物制剂后土壤中有机污染物含量明显下降。20d后，有机污染物降解率可达80％以上，说明Thauera sp.GSS10微生物菌剂能够加速有机污染物降解，可用于土壤修复。

Claims (10)

1.一株陶厄氏菌，其分类命名为Thauera sp.GSS10，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60067。
2.权利要求1所述陶厄氏菌在制备有机污染物降解剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：有机污染物为含苯环的有机污染物。
4.权利要求1所述陶厄氏菌在制备土壤修复剂中的应用。
5.一种微生物制剂，包括辅料和活性微生物，其特征在于：活性微生物包括权利要求1所述的陶厄氏菌。
6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于：陶厄氏菌的总活菌数不低于5亿/克。
7.根据权利要求5或6所述的微生物制剂，其特征在于：辅料为固体辅料。
8.根据权利要求7所述的微生物制剂，其特征在于：固体辅料为活性炭和硅藻土的混合物。
9.一种土壤修复方法，包括在污染土壤中施用权利要求1所述的陶厄氏菌或权利要求5～8任一项所述的微生物制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：陶厄氏菌或微生物制剂和肥料以基肥的方式一次性施入污染土壤中。
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