CN110577909A - 一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法 - Google Patents

一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境微生物领域，具体为一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，经分类鉴定为附球菌(Epicoccum sorghinum)，本发明是将铜尾矿土与无菌水混合培养，筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；重复培养六次；吸取第四、五、六次培养液，分别加入到含有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，挑取菌落数多的培养皿，在含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，筛选解磷圈明显的菌落；培养纯化结果进行摇床培养，最终筛选纯化获得耐重金属解磷菌株；本发明从污染地筛选耐受重金属的高效解磷真菌，能够调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤，促进植被生长，提高作物对重金属污染耕地土壤磷的利用率，减少化肥的使用。

Description

一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制备方法。
背景技术
磷是植物必需的营养元素之一，我国有74％的耕地土壤缺磷。土壤中95％以上的磷为无效形式，即为难溶性磷的化合物，植物很难直接吸收利用。施入的磷肥当季作物利用率为5％-25％，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+等金属离子结合，形成难溶性磷酸盐。因此，提高磷的利用率一直是农学家及生态学家关注的问题。影响土壤磷的利用效率的因素有很多，其中，微生物对土壤磷的转化和有效性影响很大。大量的研究结果证明:土壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的难溶性磷转化为可吸收利用的可溶性磷的形态，增强植物对土壤中磷元素的摄取。目前，对解磷微生物的研究主要集中在解磷细菌方面，解磷真菌方面的研究相对较少，真菌中的半知菌亚门更不见有报道。
金属矿山开采造成矿区大片植被和耕地被破坏，同时还产生大量矿业矿渣，严重影响土壤质地和土壤理化性质。矿山开采所产生的大量酸性矿井水和尾砂矿是造成矿区及其周围地区生态系统重金属污染的主要原因之一，成为环境中重金属污染的主要污染源。近年来，国内外关于矿区土地复垦和生态重建的研究十分活跃，其中适生优良先锋植物种类的筛选和培育是一种行之有效的方法。但是矿区复垦地除了存在重金属污染的问题外，复垦地土壤的肥力低尤其是有效磷含量低的问题，是限制矿区复垦地植被重建的重要因素。
本发明涉及的菌种是从铜尾矿场基质中分离筛选出的一株高效解磷附球菌，而且该菌株对Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cr2+、Cu2+等重金属具有很强的抗性。目前关于高效解磷附球菌及其耐重金属方面的研究在国内还未见相关报道，尤其对于此类半知菌的研究和开发利用甚少。因此，从矿区污染地筛选耐受重金属的高效解磷真菌，对调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤肥力，促进当地植被生长；提高作物对重金属污染耕地土壤磷的利用率，减少化肥的使用都具有重要意义。
发明内容
针对土壤磷素利用率低的问题，本发明的目的在于提供一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，包括以下步骤：
(1)从土壤中提取混合菌株：首先将铜尾矿土与无菌水混合后震荡培养，离心后弃去上清液；
(2)按比例向沉淀中分别加入Pb、Zn、Cu、Cd、Cr得到重金属无菌混合溶液，进行振荡培养，得到培养液。
(3)吸取步骤(2)所得的培养液，再次等浓度梯度加入步骤(2)中的重金属无菌混合液，进行振荡培养；
(4)多次重复步骤(3)直至筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；
(5)按照步骤(4)筛选出的重金属无菌混合溶液进行菌耐重金属培养，重复培养六次；
(6)分别吸取步骤(5)中第四次、第五次和第六次培养的培养液各1ml，分别加入到含有有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，并在30℃下培养一周；
(7)从步骤(6)的培养结果中挑取菌落，选择菌落数多的培养皿，然后在步骤(6)所述的含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，并在30℃下培养一周，筛选出解磷圈明显的菌落；
(8)分别对步骤(7)的培养纯化结果进行含有机磷与无机磷液体180r/min摇床培养，定量复筛得到解磷效果好的耐重金属解磷菌株；分别将得到的耐重金属解磷菌株在含有机磷与无机磷培养基中进行培养检验，在30℃下培养一周，最终纯化获得耐重金属解磷菌株；
(9)将步骤(8)纯化获得的耐重金属解磷菌株的18SrDNA ITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAS下比对，结果表明，该菌株与附球菌属同源性很高，相似度为98.24％，结合形态特征、培养特征及18SrDNA ITS序列分析，该菌株确定为附球菌(Epicoccum sorghinum)；
(10)将筛选得到的耐重金属解磷菌株进行斜面接种于冰箱中保存。
优选的，所述步骤(1)中的铜尾矿土与无菌水按照1:10的体积比混合，在30℃恒温振荡培养24h，离心后弃去上清液。
优选的，所述步骤(2)中向沉淀中加入含重金属无菌培养液的体积比为：沉淀：重金属无菌培养液＝1:10，在30℃恒温培养24h。
优选的，所述步骤(4)中重金属无菌混合液浓度为Cd：0.005g/L、Pb：0.5g/L、Cr：2g/L、Zn：2g/L、Cu：2g/L。
优选的，所述重金属无菌混合液成分包括：10g/L葡萄糖、0.3g/L NaCl、0.005g/LCdCl、0.5g/L PbCl2、2g/L CrCl3、2g/L ZnSO4、2g/L CuSO4、0.3g/L KCl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·4H2O、酵母浸粉0.5g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
优选的，所述有机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、1.0g/LCaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
优选的，所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、5.0g/L Ca3(PO4)2、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
优选的，所述有机磷液体培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、1.0g/LCaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
优选的，所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、5.0g/L Ca3(PO4)2、pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
本发明从污染地筛选耐受重金属的高效解磷附球菌优点在于：
1:具有耐铜离子，镉离子，铅离子等多种离子的复合型耐重金属的解菌；
2:菌种在筛选过程中相较于大多数所用的土壤悬浊液直接涂在加有重金属的平板筛选的方式，本发明采用的是先将土壤中所有的菌种用培养液震荡培养，离心去上清，然后多次重复加入含有多种重金属离子的混合液对菌种进行耐重金属的筛选，使土壤中所有的菌种得到充分的筛选；
3：无机磷培养基中的不溶性无机磷是灭菌后将不溶性无机磷浊液与其他培养基中成分按比例进行混合，避免了培养基中磷在灭菌过程中的沉淀，导致最终无机磷在培养基中混合不均的问题；
本发明技术方案对调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤肥力，促进当地植被生长；提高作物对重金属污染耕地土壤磷的利用率，减少化肥的使用都具有重要意义。
附图说明
图1为在不溶性无机磷培养基中培养10天的附球菌落；
图2为附球菌落周围解磷圈；
具体实施方式
为进一步描述本发明的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，下面对其作进一步说明。
实施例1
一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，包括以下步骤：
(1)从土壤中提取混合菌株：首先将铜尾矿土与无菌水按照1:10的体积比混合后震荡培养，在30℃恒温振荡培养24h，离心后弃去上清液；
(2)按比例向沉淀中分别加入pb、Zn、Cu、Cd、Cr得到重金属无菌混合溶液，进行振荡培养，得到培养液，向沉淀中加入含重金属无菌培养液的体积比为：沉淀:重金属无菌培养液＝1:10，在30℃恒温培养24h。
(3)吸取步骤(2)所得的培养液，再次等浓度梯度加入步骤(2)中的重金属无菌混合液，进行振荡培养；
(4)多次重复步骤(3)直至筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；重金属无菌混合液浓度为Cd：0.005g/L、Pb：0.5g/L、Cr：2g/L、Zn：2g/L、Cu：2g/L。
(5)按照步骤(4)筛选出的重金属无菌混合溶液进行菌耐重金属培养，重复培养六次；
(6)分别吸取步骤(5)中第四次、第五次和第六次培养的培养液各1ml，分别加入到含有有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，并在30℃下培养一周；
(7)从步骤(6)的培养结果中挑取菌落，选择菌落数多于30的培养皿，然后在步骤(6)所述的含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，并在30℃下培养一周，筛选出解磷圈明显的菌落；
(8)分别对步骤(7)的培养纯化结果进行含有机磷与无机磷液体180r/min摇床培养，定量复筛得到解磷效果好的耐重金属解磷菌株；分别将得到的耐重金属解磷菌株在含有机磷与无机磷培养基中进行培养检验，在30℃下培养一周，最终纯化获得耐重金属解磷菌株；
(9)将步骤(8)纯化获得的耐重金属解磷菌株的18SrDNA ITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAS下比对，结果表明，该菌株与附球菌属同源性很高，相似度为98.24％，结合形态特征、培养特征及18SrDNA ITS序列分析，该菌株确定为附球菌(Epicoccum sorghinum)；
(10)将筛选得到的耐重金属解磷菌株进行斜面接种于冰箱中保存。
所述重金属无菌混合液成分包括：10g/L葡萄糖、0.3g/L NaCl、0.005g/L CdCl、0.5g/L PbCl2、2g/L CrCl3、2g/L ZnSO4、2g/L CuSO4、0.3g/L KCl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·4H2O、酵母浸粉0.5g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
所述有机磷液体培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、1.0g/L CaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、5.0g/L Ca3(PO4)2、pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
该耐重金属解磷菌株的主要生物学特征:该菌接种于无机磷固体培养基上，培养一周后，菌落直径可达10mm-30mm；菌落颜色在生长初期时为白色，之后逐渐变为淡青色、青色，反面则由无色变为淡黄色或黄色；菌落具辐射状沟纹，并为丝绒状质地，无渗透液产生，菌落生长过程中菌落周围会明显出现透明的溶磷圈。
上述耐重金属解磷菌株在溶解难溶性无机磷酸盐中的作用:在液体摇瓶实验中，该耐重金属解磷菌株对难溶性磷酸盐(过磷酸三钙和磷酸钙)具有极强的溶解效果。对上述两种难溶性无机磷的解磷效果为接种量为1％时培养5天后有效磷增加量为144.44μg/ml。
上述耐重金属解磷菌株对重金属耐性方面的作用:本发明耐重金属解磷菌株除了具有很强的无机盐解磷特性，还对Pb2+、Zn2+、Mn2+、Cr2+多种重金属具有耐性。将该耐重金属解磷菌株分别接种于含有重金属的液体培养液中，对上述重金属均具有一定的耐受性，特别是对Pb2+、Zn2+、Mn2+、Cr2+的耐受浓度达到Cd 5mg/L、Pb 500mg/L、Cr 2000mg/L、Zn2000mg/L、Cu 2000g/L以上。因此，该耐重金属解磷菌株在重金属污染矿区土壤的生物修复中具有广阔的应用潜力。
实施例2
本实施例2与实施例1区别在于：
所述有机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、1.0g/L CaCO3、卵磷脂0.5g(7克吐温80)、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、5.0g/L Ca3(PO4)2、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
实施例3:
解磷真菌的筛选和鉴定：
本实施方式的附球菌株从铜尾矿区表层5cm-20cm土壤样中分离筛选出来的。筛选按以下步骤进行:将采集的土壤立即带回实验室，置于-20℃冰箱保存，取其中10g过筛后的土壤放于带有玻璃珠的100ml无菌水中，制成土壤悬液，此悬液浓度为10-1，将悬液放于恒温振荡器上以150r/min充分震荡30min，取出离心后弃去上清液，从该样品菌悬液中取10ml加入到90ml的无菌水中，制成菌悬液的浓度为10-2，再以此方法进行10倍梯度稀释，直至稀释液的浓度为10-4为止。取10-4浓度的菌悬液1ml，放在选择性的改良有机磷培养基平板上(培养基组成(g/L):(NH4)2SO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.3g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO4 0.03g、MnSO4 0.0204g、酵母粉0.5g、葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5g、琼脂20g、pH7.0的蒸馏水1000ml)，置于30℃培养箱中培养5天，挑取溶磷圈(即透明圈)较大的菌落作进一步筛选及菌株纯化。得到的解磷菌经形态学、培养特征以及18SrDNA的ITS序列测序分析，鉴定该菌株为附球菌Epicoccum sorghinum。
将上述菌株接种到PDA平板上，培养5d后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为5.0×107个孢子/ml，按每瓶1ml接种量接种到装有50ml解磷培养基的100ml三角瓶中，以加入相同体积的解磷培养基不接种为对照(CK)，每个处理三瓶重复。置于28℃摇床中，180rpm振荡培养，培养一周后，发酵液于4℃，20000r/min离心10min，用钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从土壤中提取混合菌株：首先将铜尾矿土与无菌水混合后震荡培养，离心后弃去上清液；
(2)按比例向沉淀中分别加入Pb、Zn、Cu、Cd、Cr得到重金属无菌混合溶液，进行振荡培养，得到培养液；
(3)吸取步骤(2)所得的培养液，再次按等浓度梯度加入步骤(2)中的重金属无菌混合液，进行振荡培养；
(4)多次重复步骤(3)直至筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；
(5)按照步骤(4)筛选出的重金属无菌混合溶液进行菌耐重金属培养，重复培养六次；
(6)分别吸取步骤(5)中第四次、第五次和第六次培养的培养液各1ml，分别加入到含有有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，并在30℃下培养一周；
(7)从步骤(6)的培养结果中挑取菌落，选择菌落数多的培养皿，然后在步骤(6)所述的含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，并在30℃下培养一周，筛选出解磷圈明显的菌落；
(8)分别对步骤(7)的培养纯化结果进行含有机磷与无机磷液体180r/min摇床培养，定量复筛得到解磷效果好的耐重金属解磷菌株；分别将得到的耐重金属解磷菌株在含有机磷与无机磷培养基中进行培养检验，在30℃下培养一周，最终纯化获得耐重金属解磷菌株；
(9)将步骤(8)纯化获得的耐重金属解磷菌株的18SrDNA ITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAS下比对，结果表明，该菌株与附球菌属同源性很高，相似度为98.24％，结合形态特征、培养特征及18SrDNA ITS序列分析，该菌株确定为附球菌(Epicoccum sorghinum)；
(10)将筛选得到的耐重金属解磷菌株进行斜面接种于冰箱中保存。
2.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)中的铜尾矿土与无菌水按照1:10的体积比混合，在30℃恒温振荡培养24h，离心后弃去上清液。
3.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述步骤(2)中向沉淀中加入含重金属无菌培养液的体积比为：沉淀：重金属无菌培养液＝1:10，在30℃恒温培养24h。
4.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述步骤(4)中重金属无菌混合液浓度为Cd：0.005g/L、Pb：0.5g/L、Cr：2g/L、Zn：2g/L、Cu：2g/L。
5.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述重金属无菌混合液成分包括：10g/L葡萄糖、0.3g/L NaCl、0.005g/L CdCl、0.5g/L PbCl2、2g/L CrCl3、2g/L ZnSO4、2g/L CuSO4、0.3g/L KCl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.03g/L FeSO4·7H2O、0.03g/L MnSO4·4H2O、酵母浸粉0.5g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
6.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述有机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、1.0g/L CaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
7.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、5.0g/L Ca3(PO4)2、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
8.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述有机磷液体培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、1.0g/L CaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
9.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/L NaCl、0.71g/L K2SO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.0204g/L MnSO4、0.03g/L FeSO4、5.0g/L Ca3(PO4)2、pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。
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