CN112094786A - 一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法 - Google Patents

一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，包括以下步骤：(1)、菌种富集；(2)、菌种筛选；(3)菌种驯化；(4)扩大培养；(5)取磷矿粉和解磷菌体按照质量比1～4:1混合作为复合菌剂，复合菌剂以河沙质量0.5％的用量添加并混匀。本发明的解磷菌与磷矿粉联用后可以减少植物富集重金属，并促进植物生长。本发明采用从磷矿粉中分离纯化并驯化的解磷泛菌属解磷细菌，具有良好的分解无机磷的功能，将该菌与其分离来源的磷矿粉进行复配，减少了植物对河沙中的重金属Pb、Cd的吸收。这种方法使用的外源化学物质少，环境友好，是一种可以借鉴的在重金属污染河沙上种植植物的方法。

Description

一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法
技术领域
本发明属于污染治理技术领域，具体涉及一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法。
背景技术
河沙来源广泛，土质疏松，保水性不强，可反复使用，传统在建筑，装修方面有着不可替代的作用。近年来河沙的用途不断拓展，利用河沙种植经济作物番茄，突破了传统番茄不能重茬的缺点，极大地节省了成本。作为种植基质的河沙，与其他类型土壤一样具有重金属污染的风险，例如河流流经重金属矿藏时，可能导致河沙中含有重金属。目前关于降低植物对重金属吸收的技术主要通过使用螯合剂，生物质炭，重金属叶面阻控剂等方法，但是这些方法仍会使用例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙基三胺五乙酸(DTPA)，乙二醇双四乙酸(EGTA)，有机酸类，鼠李糖脂等化学物质，对环境存在潜在风险。
利用土壤调理剂(至少由生物质炭和耐镉菌菌液组成)和叶面阻控剂，可以减弱镉污染土壤中小青菜对镉的吸收。在镉污染土壤中施入土壤调理剂并混匀，之后在镉污染土壤中播种小青菜种子；播种后喷施至少一次阻控剂，应用于降低土壤和植株重金属含量，通过生物质炭与耐镉菌进行联合修复，增强耐镉菌对土壤重金属镉的修复功能，降低植株对重金属镉的吸收。
生物质炭需要裂解炉进行700℃高温碳化秸秆，而且目前市面上常用的叶面阻控剂主要是含硅叶面阻控剂，是以石英砂与纯碱或者苛性钾为原料，通过高温熔融反应，制得硅酸钠或者硅酸钾，成本高，能耗大。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，通过从磷矿粉中筛选具有良好解磷功能的泛菌属细菌，并进行重金属铅(Pb)镉(Cd)的驯化培养，制备磷矿粉和解磷菌的复合制剂，通过在重金属Pb，Cd污染的河沙中种植植物进行重金属迁移实验，建立了磷矿粉和解磷菌促进植物生长的菌剂组合，降低了植物对重金属的吸收，并促进了植物的生长，外源化学物质添加少。说明使用该复合制剂，能够降低河沙植物中的重金属Pb，Cd的含量，可以促进植物生长。
具体的技术方案为：
一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，包括以下步骤：
(1)菌种富集：取5g磷矿粉，加入到100mL灭菌后的LB液体培养基中，28℃、160r/min培养2d，得到富集菌液；
(2)菌种筛选：采用溶磷固体培养基，灭菌；将富集菌液用无菌水稀释，选取10-3、10-5、10-7稀释后的菌液各150μL涂布于平板上，将平板于28℃恒温培养箱中培养5d，观察并记录菌落生长情况及透明圈大小；5d后挑取透明圈较大的菌落划线于新的平板上，28℃培养5d，重复操作纯化3次，挑取单菌落用LB液体培养基活化16h，甘油保存于-80℃；
(3)菌种驯化：先采用溶磷液体培养基，灭菌，然后冷却至室温，将配好的Pb(NO3)2、Cd(NO3)2溶液用0.22μm无菌滤膜过滤后加入到溶磷液体培养基中，调整出不同级别Pb2+、Cd2 +浓度的培养基；
取1mL活化后的菌液加入到100mL含有Pb2+、Cd2+浓度最低的培养基中，于28℃、160r/min摇床培养驯化7d；
取1mL菌液转移至100mL含有Pb2+、Cd2+浓度高一级的培养基中；于28℃、160r/min摇床培养驯化7d；
如此重复操作多次进行驯化，每次培养时的Pb2+、Cd2+浓度递增；
驯化结束后取1mL菌液加入到灭菌后的LB液体培养基中进行活化；
(4)扩大培养：按溶磷液体培养基配方称取各组分后，使用超纯水定容至1L，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，封口膜封口，灭菌，冷却后备用；取驯化后的菌种用LB液体培养基活化14h，然后用无菌水洗涤3次，每300mL的LB液体培养基中加入3mL无菌水洗涤后的菌液，培养48h待用；
(5)取磷矿粉和解磷菌体按照质量比1～4:1混合作为复合菌剂，复合菌剂以河沙质量0.5％的用量添加并混匀。
进一步的，步骤(5)所述的复合菌剂中还加入腐殖酸，取磷矿粉、解磷菌体和腐殖酸按照质量比1～4:1:0.5～1混合。
其中，所述的LB液体培养基，由以下原料按照比例制成：NaCl 10.0g、酵母粉5.0g、胰蛋白胨10.0g、蒸馏水1L。
所述的溶磷固体培养基，由以下原料按照比例制成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2g、酵母粉0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.3g、MnSO4·4H2O0.03g、Ca3(PO4)2 5g、蒸馏水1L、琼脂粉20.0g。
所述的溶磷液体培养基，由以下原料按照比例制成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2g、酵母粉0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.3g、MnSO4·4H2O0.03g、Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水定容至1L。
进一步的，所述的灭菌条件为，温度115℃，时间30min。
所述的步骤(3)，不同级别Pb2+、Cd2+浓度的培养基的Pb2+、Cd2+浓度分别依次为：
Pb2+：0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L；
Cd2+：0.05mg/L、0.5mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L。
本发明的解磷菌与磷矿粉联用后可以减少植物富集重金属，并促进植物生长。本发明采用从磷矿粉中分离纯化并驯化的解磷泛菌属解磷细菌，具有良好的分解无机磷的功能，将该菌与其分离来源的磷矿粉进行复配，减少了植物对河沙中的重金属Pb，Cd的吸收，并降低了河沙中Pb，Cd浓度。这种方法使用的外源化学物质少，环境友好，是一种可以借鉴的在重金属污染河沙上种植植物的方法。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体技术方案。
具体包括以下过程：
(1)培养基的配置
溶磷液体培养基，由以下原料按照比例制成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2g、酵母粉0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.3g、MnSO4·4H2O 0.03g、Ca3(PO4)25g，蒸馏水定容至1L。
溶磷固体培养基，由以下原料按照比例制成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2g、酵母粉0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.3g、MnSO4·4H2O 0.03g、Ca3(PO4)25g、蒸馏水1L、琼脂粉20.0g。
LB液体培养基，由以下原料按照比例制成：NaCl 10.0g、酵母粉5.0g、胰蛋白胨10.0g、蒸馏水1L。
(2)菌种富集：取5g磷矿粉，加入到100mL灭菌后的LB液体培养基中，28℃、160r/min培养2d，得到富集菌液。
(3)菌种筛选：配制溶磷固体培养基，115℃灭菌30min。将富集的菌液用无菌水稀释，选取10-3、10-5、10-7各150μL涂布于平板上，将平板于28℃恒温培养箱中培养5d，观察并记录菌落生长情况及透明圈大小。5d后挑取透明圈较大的菌落划线于新的平板上，28℃培养5d，重复操作纯化3次，挑取单菌落用LB液体培养基活化16h，甘油保存于-80℃。
(4)菌种驯化：先将溶磷液体培养基在115℃下灭菌30min，然后冷却至室温，将配好的Pb(NO3)2、Cd(NO3)2溶液用0.22μm无菌滤膜过滤后加入到溶磷液体培养基中，此培养基最终的Pb2+、Cd2+浓度分别为0.1mg/L、0.05mg/L。取1mL活化后的菌液加入到100mL上述培养基中，于28℃、160r/min摇床培养驯化7d，取1mL菌液转移至100mL含Pb2+1mg/L、Cd2+0.5mg/L溶磷液体培养基中。如此重复操作，每次培养时的Pb2+、Cd2+浓度递增，依次为Pb2+：10mg/L、100mg/L、500mg/L；Cd2+：5mg/L、10mg/L、50mg/L。驯化结束后取1mL菌液加入到灭菌后的LB液体培养基中进行活化。
(5)扩大培养：按上述步骤(1)中的溶磷液体培养基配方称取各组分后，使用超纯水定容至1L，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，封口膜封口，放入高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，冷却后备用。取驯化后的菌种用LB液体培养基活化14h，然后用无菌水洗涤3次，每300mL培养基中加入3mL无菌水洗涤后的菌液，培养48h待用。
(6)制备磷矿粉-解磷菌的复合菌剂，复合菌剂以河沙质量0.5％的用量添加并混匀。
本实施例采用铅镉污染的河沙为研究材料，加入铅含量500mg/kg，镉含量50mg/kg。河沙来源于自河南信阳市固始县，经测试河沙pH值为7.15，有机质含量为0.41％，碱解氮为73.5％，速效磷含量4.4mg/kg，速效钾含量为13.7mg/kg，电导率为0.16ms/cm。
重金属平衡后60d后，在2kg河沙中播种小白菜种子2.5g，种子来源于为北京中蔬种业科技有限公司的速生1号。
制备耐铅镉解磷菌菌体：将泛菌属细菌菌株放入牛肉膏蛋白胨培养液制成菌悬液，28℃振荡培养18h，离心取沉淀待用。
磷矿粉检测：磷矿粉理化性质如表1所示：
表1.供试磷矿粉基本理化性质表
Figure BDA0002742112310000041
将土壤样品过1mm筛，每盘装土约2kg，作8组处理，每组处理重复3次，8组处理具体如下：
对照组：不添加解磷菌和磷矿粉的铅镉污染河沙；
耐铅镉解磷菌组：添加河沙质量0.5％的菌体混匀；
实验组1：取磷矿粉和解磷菌体以4:1混合，以河沙质量0.5％的用量添加并混匀；
实验组2：取磷矿粉和解磷菌体以2:1混合，以河沙质量0.5％的用量添加并混匀；
实验组3：取磷矿粉和解磷菌体以1:1混合，以河沙质量0.5％的用量添加并混匀；
实验组4：取磷矿粉、解磷菌体和腐殖酸以4:2:1混合，以河沙质量0.5％的用量添加并混匀；
实验组5：取磷矿粉、解磷菌体和腐殖酸以1:1:1混合，以河沙质量0.5％的用量添加并混匀；
调解水分含量至田间持水量的15％-20％，将各组处理后的河沙样品分别混匀置于大棚中，使土壤各组分达到平衡60d后，播种小白菜种子，30d后收获小白菜；
通过以下方法对样品进行采集和测定：
采集河沙样品，将采集的河沙，经风干待用。
采集小白菜样品，30d采集小青菜样品，将采收的小白菜全植株，用自来水和蒸馏水充分洗净，测定根长和株高后，控干水分、装入纸袋于105℃杀青15min，65℃下烘干至恒量，粉碎并储存于密封袋内备用。
河沙中全镉和全铅的测定采用王水-高氯酸消-原子吸收光谱法；土壤pH采用水提玻璃的电极法测定，河沙和磷矿粉理化性状的测定采用常规分析方法进行。采用相关统计软件R处理数据，利用Tukey's(HSD)进行显著性统计分析。
其中不同处理30d后河沙中重金属铅镉的含量如表2.所示：
表2.河沙中重金属铅镉的含量
Figure BDA0002742112310000051
从表2.可以看出，添加具有复配成分的实验组1、实验组2、实验组3、实验组4和实验组5相比于添加单一成分的耐铅镉解磷菌组，对河沙中镉和铅的固定作用都更为显著，磷矿粉与耐铅镉菌菌的复配质量比在(4:1)-(1:1)的范围内。在复配质量比(4:1)-(2:1)范围内，对河沙种重金属铅的固定效果更佳。将实验组4和实验组2相比，实验组5和实验组3相比，添加腐殖酸相比于仅包含磷矿粉和耐铅镉解磷菌体的土壤调理剂具有更好的铅钝化效果。对河沙中镉的钝化效果，在磷矿粉与耐铅镉菌菌体的复配质量比为(4:1)-(2:1)范围内钝化效果更好，腐殖酸对其影响不显著。
不同处理对小白菜中的铅镉含量和植株根长、株高的影响如表3所示：
表3.不同处理后对小白菜中铅镉含量和根长株高的影响
Figure BDA0002742112310000052
Figure BDA0002742112310000061
注：右上角字母为HSD0.05统计结果。
实验对照组由于为仅添加重金属铅镉的河沙，没有添加磷矿粉，解磷菌和腐殖酸，有机质含量极低，小白菜的发芽率很低，因此检测的植株数量少，铅镉含量低。从表3.可以看出，不同处理后，经HSD方差分析，添加具有复配成分的河沙调理剂的实验组1、实验组2、实验组3相比于添加单一成分的解磷菌组，小白菜的铅镉含量更低，磷矿粉与耐铅镉解磷菌的复配质量比在(4:1)-(1:1)的范围内，对植株中铅镉含量的降低均有显著的效果。在磷矿粉、解磷菌体和腐殖酸以4:2:1比例混合时，小白菜株高显著高于其它实验组。在磷矿粉与耐铅镉解磷菌菌体的复配质量比在(4:1)-(1:1)的范围内，根长均显著高于对照组和仅添加解磷菌的实验组。
本说明书中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了磷矿粉、耐铅镉解磷菌、腐殖酸等，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (7)

1.一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、菌种富集：取5g磷矿粉，加入到100mL灭菌后的LB液体培养基中，28℃、160r/min培养2d，得到富集菌液；
(2)、菌种筛选：采用灭菌溶磷固体培养基；将富集菌液用无菌水稀释，选取10-3、10-5、10-7稀释后的菌液各150μL涂布于平板上，将平板于28℃恒温培养箱中培养5d，观察并记录菌落生长情况及透明圈大小；5d后挑取透明圈较大的菌落划线于新的平板上，28℃培养5d，重复操作纯化3次，挑取单菌落用LB液体培养基活化16h，甘油保存于-80℃；
(3)菌种驯化：先采用灭菌溶磷液体培养基；将配好的Pb(NO3)2、Cd(NO3)2溶液用0.22μm无菌滤膜过滤后加入到溶磷液体培养基中，调整出不同Pb2+、Cd2+浓度的培养基；
取1mL活化后的菌液加入到100mL含有Pb2+、Cd2+浓度最低的培养基中，于28℃、160r/min摇床培养驯化7d；
取1mL菌液转移至100mL含有Pb2+、Cd2+浓度高一级的培养基中，于28℃、160r/min摇床培养驯化7d；
如此重复操作多次进行驯化，每次培养时的Pb2+、Cd2+浓度递增；
驯化结束后取1mL菌液加入到灭菌后的LB液体培养基中进行活化；
(4)扩大培养：按溶磷液体培养基配方称取各组分后，使用超纯水定容至1L，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，封口膜封口，灭菌，冷却后备用；取驯化后的菌种用LB液体培养基活化14h，然后用无菌水洗涤3次，每300mL的LB液体培养基中加入3mL无菌水洗涤后的菌液，培养48h待用；
(5)取磷矿粉和解磷菌体按照质量比1～4:1混合作为复合菌剂，复合菌剂以河沙质量0.5％的用量添加并混匀。
2.根据权利要求1所述的一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，步骤(5)所述的复合菌剂中还加入腐殖酸，取磷矿粉、解磷菌体和腐殖酸按照质量比1～4:1:0.5～1混合。
3.根据权利要求1所述的一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，所述的LB液体培养基，由以下原料按照比例制成：NaCl 10.0g、酵母粉5.0g、胰蛋白胨10.0g、蒸馏水1L。
4.根据权利要求1所述的一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，所述的溶磷固体培养基，由以下原料按照比例制成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2g、酵母粉0.5g、NaCl0.3g、KCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.3g、MnSO4·4H2O 0.03g、Ca3(PO4)2 5g、蒸馏水1L、琼脂粉20.0g。
5.根据权利要求1所述的一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，所述的溶磷液体培养基，由以下原料按照比例制成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2g、酵母粉0.5g、NaCl0.3g、KCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·7H2O 0.3g、MnSO4·4H2O 0.03g、Ca3(PO4)25g，蒸馏水定容至1L。
6.根据权利要求1所述的一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，所述的所述的灭菌条件为，温度115℃，时间30min。
7.根据权利要求1所述的一种降低河沙中植物重金属铅镉的方法，其特征在于，所述的步骤(3)，不同级别Pb2+、Cd2+浓度的培养基的Pb2+、Cd2+浓度分别依次为：
Pb2+：0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L；
Cd2+：0.05mg/L、0.5mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L。
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