CN110283845A - 一种转基因植物复合体系应用于污染土壤的植物修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因植物及其应用在被污染土壤的植物修复。转基因植物通过植物转化载体的构建、植物遗传转化等步骤获得。转基因植物可用于对重金属污染的土壤和水体进行植物修复。本发明转基因植物表现出对铅、镉等不同重金属的超积累特性和抗性，可以广泛的应用于被重金属污染的土壤的植物修复，并且对污染土壤有高效的修复效率。本发明对矿山开采造成的污染土壤以及周边堆土场场地土壤污染；电镀厂废弃厂址以及周边的污染土壤，如Cd、Cr、Cu、Pb、Zn和Ni等多种复合金属污染土壤。本发明在复合污染土壤修复种具有适应性强，环境友好等多重优点，具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及土壤修复领域，特别是通过外源基因在修复植物中的特异性表达的方法和应用于污染土壤的重金属修复技术。
背景技术
土壤是人类赖以生存的自然环境和农业生产的重要资源，世界面临的各种粮食、资源和环境问题都与土壤密切相关。上世纪年代以来，采矿、冶金业的不断发展，各种化学产品、农药及化肥的广泛使用，导致重金属土壤和地下水污染问题随之出现。土壤重金属污染是指由于人类活动将重金属带入到土壤中，致使土壤组成及理化性质发生变化，造成土壤质量退化、生态恶化的现象。目前，世界各国土壤存在不同程度的污染。在欧洲，受重金属污染的农田有数百万公顷；在日本受Cd、Cu、As等污染的农田面积为7224公顷。随着我国工业化进程的不断加快，环境污染也不断加剧，治理人类赖以生存的土壤及大气污染已经迫在眉睫。除了严格控制污染物的排放外，研究开发适合我国国情的环境污染治理技术具有重要的意义。环境污染包括重金属污染、农药和持久性有机化合物污染、化肥施用污染等。随着人口增加及经济发展，大量未经处理的废弃物向农田转移，我国面临的土壤及水体污染问题越来越严重。近年来我国的土壤污染正在向不同尺度的区域性发展，并对各种农产品品质产生严重影响。据不完全统计，我国重金属污染的土壤面积达2000万公顷，占总耕地面积的1/60因工业“三废”污染的农田近700万公顷，使粮食每年减产100亿公斤。在一些地区汞、砷、铜、锌等元素的超标面积占污染总面积的一半左右。重金属污染物在土壤系统中具有长期性、隐蔽性和不可逆性的特点，容易通过食物链途径在植物、动物和人体内积累，对生态环境、食品安全和人体健康构成严重威胁。因此，农田土壤重金属污染己成为当前日益严重的环境问题。
污染环境的生物修复技术与传统的物理和化学污染治理方法相比，具有成本低，不造成二次污染等优点，因此近年来得到了很快的发展。生物修复主要包括微生物修复（microbial remediation）和植物修复(phytoremediation)两大类。微生物修复治理污染仅仅局限于某些污染如水体的治理，而且经过近20年的研究与实践，其治理污染的能力十分有限。因此，生物修复逐渐从微生物修复技术转向植物修复技术。植物修复是指利用绿色植物来吸收、固定、转移、转化污染物的一种环境治理技术，其中包括植物萃取、根际过滤、植物固定和植物挥发等。目前国内外共发现超富集植物约 450 余种，包括烟草、龙葵、印度芥菜、水花生、拟南芥等等，此外，木本植物、蔬菜和农作物对重金属也有一定的富集能力，利用草本与木本的联合修复可有效提高重金属提取和修复效率，缩短修复周期。
近年来，转基因植物通过改变植物对土壤中重金属的耐受性和积累成为研究修复土壤和地下水重金属污染的热点。例如，Gasic和Korban（2007）将表达编码植物螯合肽合酶（PCS）的拟南芥AtPCS1插入到印度芥菜中。Balestrazzi（2009）将金属硫蛋白PsMT（A1）基因插入到白杨中，发现其具有较强的抵抗重金属毒性的能力，尤其是对铜离子的修复效率较高。在我国，贾翠翠等（2014）将LcGS基因转入烟草，发现转基因植株对重金属的耐逆性比对照组更强。厉芳（2017）将金属硫蛋白基因MT基因导入到紫花苜蓿。发现其抗性显著提高。钟活权（2017）发现过表达AtRD22和过表达AtRD22的BURP结构域的转基因拟南芥对Cu2+胁迫的抗性强于野生型植株,而敲除AtRD22的转基因植株RDi对Cu2+胁迫的抗性明显弱于野生型植株。姚启超（2013）对转柽柳eIF1A基因的T2代烟草进行Cd胁迫研究，发现hmbp转基因拟南芥对镉具有很高的抗逆性。张路（2017）发现MIR156可以增强伴矿景天对Cd的耐受性。
此外，在生物修复过程中，联合动物-微生物协同作用能够提高修复效率。例如，蚯蚓作为主要的大型土壤动物类群,对Zn和Cd的富集系数大于1,对Cd富集作用十分明显（唐浩, 2013；王兴明, 2012）。微生物如芽孢杆菌，弗兰克氏菌，假单胞菌和球菌等的修复效果也十分显著。例如，杨文浩（2014）结合细菌和东南景天对污染土壤进行修复，取得较好效果。张艳峰（2011）发现ACC脱氨酶植物内生细菌对重金属Cu、Cd、Pb和Ni都具有一定的抗性。徐军等（2012）筛选得到4株植物促生性能较强的菌株,协同玉米进行实验，发现其不仅能促进玉米的生长，也能通过显著增加土壤中各种交换态的铜离子的活性，进而来增加铜的生物有效性。
目前，我国在植物修复领域的研究起步较晚，与国外相比差距较大，特别是目前可供用于污染物修复的超富集植物资源很少，而通过转基因植物进行污染环境的治理方面的研究则更是处于起步阶段，通过转基因植物进行污染环境修复的大规模试验也较少。大多只是针对性的转入特定基因进行基因沉默或基因过表达，通常只对单独修复重金属污染物具有一定效果，而不能修复复合污染物，且对土壤污染程度、土壤均匀性和渗透性要求较高。同时，结合转基因植物辅以土壤微生物和动物对土壤进行修复的研究较少，大多只是针对性的转入特定基因进行基因沉默或基因过表达，通常只对单独修复重金属污染物具有一定效果，而不能修复复合污染物，且对土壤污染程度、土壤均匀性和渗透性要求较高。为此，提出一种结合植物修复与微生物修复联合修复的方式对土壤进行修复，不仅能够实现土壤肥力的可持续恢复，也是土壤绿色修复的必要要求。因此，本研究具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：基于以上背景，我们克隆合成出相关的基因，并构建不同启动子表达的Znt1基因，转入不同植物并且高效的表达出来，得到一种可以高效率修复被重金属污染过的土壤的转基因植物，从而为针对土壤污染修复提供一条新途径。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种转基因植物,其质粒命名为p3301-121-Znt1质粒（其结构见图1）。
本发明进一步公开了转基因植物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）转化载体的构建：
将源于十字花科天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）的Znt1基因，用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ进行酶切，然后连接到用相同酶双酶切后的质粒表达载体即植物双元转化载体p3301-121上，命名为p3301-121-Znt1质粒，通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105中；
（2）植物遗传转化：
通过农杆菌介导的叶盘转化方法，将重组的表达载体p3301-121-Znt1转入到目标植物叶片中，之后放在含有卡那霉素的MS培养基上筛选获得小苗，放于生根培养基上诱导生根，待根系健壮后放入温室培养获得完整的目标植物转化苗；其中所述的植物是龙葵，烟草，油菜，紫花苜蓿，印度芥菜。
本发明更加详细的转基因植物的制备方法，其具体步骤如下：
（1）将过夜培养的带有p3301-121-Znt1质粒的农杆菌离心，菌体用液体MS 1/10培养基悬浮；
（2）将植物叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，一部分放入带有p3301-121-Znt1质粒菌液的MS液体培养基中浸泡15~20分钟，一部分放入普通液体MS培养基中浸泡15~20分钟，用滤纸吸干多余的菌液或液体后，放在MS培养基上共培养三天，然后转到筛选培养基上；
（3）同时，把用液体MS培养基（成分：MS粉+3%蔗糖+无菌超纯水）浸泡的叶片一部分转到正常培养基上，用作以后转基因植物抗重金属的对照植株，一部分转移到选择培养基上作为转化叶片的对照，28℃, 16h光照培养进行初步筛选，每十天更换一次培养基；
（4）再生的小苗转至生根培养基生根，进过20~30天获得转基因植物转化苗；其中的筛选培养基是MS+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA+50mg/L Kan+250mg/L Rif；正常培养基是MS+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA；生根培养基是MS+0.05mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+50mg/L Kan+200mg/L Rif。
本发明更进一步公开了所述转基因植物制备方法在用于废弃矿山土壤和废弃电镀厂场地土壤修复方面的应用；该方案应用于某矿山土壤修复，土壤取自华北地区河北省承德境内某小型废弃的铅锌矿，该矿区持续向周围释放重金属元素，对当地农田和水体造成严重污染。停止生产后，该矿区矿山排水中仍然含有大量重金属元素，这些重金属元素对周围环境造成持续的破坏。同时也公开了用于对电镀厂废弃厂址及周边土壤修复方面的应用。污染土壤取自天津市武清区某废弃电镀厂原厂址及其周边土壤，所述的重金属污染指的是Cd金属。
（美国科学家Bennett等人利用植物遗传转化方法将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）、谷胱甘肽合成酶（GS）或ATP硫酸化酶（APS）基因通过遗传转化转入印度芥菜，并得到相应的转基因印度芥菜，从而就比较了分别表达三种基因的印度芥菜对重金属污染土壤的修复效果，2003）；所述的重金属污染指的是Cd、Cr、Cu、Pb和Ni多种复合金属。实验结果显示：表达γ-ECS或GS的植株，植物体内鳌合肽和谷胱甘肽的水平显示
出增加的迹象，与此同时对Cd的耐受力和积累量也提高了；研究发现含有ATP硫酸化酶的植株，该植株内的谷胱甘肽和硫醇的含量均有不同程度的增加；表达γ-ECS和GS的植株茎叶的重金属累积量显著高于野生株，转基因后，新型植株体内的镉是野生型的1.5倍，锌是野生型的1.5-2倍；Cr、Cu、Pb的累积量，表达γ-ECS的新型植株为野生型的2.4-3倍；不论哪种转基因植株把土壤中清除重金属的能力均显著高于野生型的，土壤中Cd、Zn的减少量分别为25%和6%，因而转γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）、谷胱甘肽合成酶（GS）或ATP硫酸化酶（APS）印度芥菜对于不同重金属污染土壤有良好的修复效果。
本发明更加详细的描述如下：
转基因植物通过如下步骤获得：
（1）将源于十字花科天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）的Znt1基因（由GenBank上检索得到天蓝遏蓝菜的Znt1 cds序列，经过南京一道生物科技有限公司化学合成Znt1目的基因片段，然后经过PCR扩增得到），用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ进行酶切，然后连接到用相同酶双酶切后的质粒表达载体即植物双元转化载体p3301-121上，命名为p3301-121-Znt1质粒，通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105中；
（2）植物遗传转化：
通过农杆菌介导的叶盘转化方法，将重组的表达载体p3301-121-Znt1转入到目标植物叶片中，之后放在含有卡那霉素的MS培养基上筛选获得小苗，放于生根培养基上诱导生根，待根系健壮后放入温室培养获得完整的目标植物转化苗。以上转基因植物应用于复合重金属污染土壤的植物修复。
本发明公开的转基因植物复合体系应用于污染土壤的植物修复方法，具有如下优点:
（1）Znt1基因在植物龙葵的组织进行特异性表达，不仅能够提高污染物从地下部分运输到地上部分的能力，提高了修复效率，而且能使植物龙葵抗性更强，生物量更大，进一步提高了转化植物对土壤重金属污染物的吸收和富积能力。
（2）转基因植物表现出对镉、铅、锌等不同重金属的超积累特性和抗性。
（3）本发明的转基因植物对环境的适应性强，同时不会造成二次污染，属于环境友好型，并且可长期修复，有利于生态环境水土保持。
（4）本发明实际应用于重金属污染土壤的修复具有很好效果，尤其是可以广泛应用于复合金属污染土壤的植物修复中。天蓝遏蓝菜Znt1基因序列如下：
atggcttca tctcccacga aaatcctctg tgatgctggcgaatcagacc tctgtcgagacgatgcagct gcatttctac tcaaattcgt agccattgca tcaatcctcc tagccggagc tgcaggtgtagccatacctc tcatcggcaa gaaccgccgg
ttccttcaaa ccgaaggaaa tctctttgta gctgctaaag ccttcgcagccggtgtcatactcgccactg gcttcgtcca tatgcttgca ggcggcacgg aagctctgaccaatccgtgcttaccggatt atccgtggtc taagtttccc tttcccggct tctttgcaatggtggctgctttgataactc tgcttgtgga tttcatgggg acacagtact atgagagtaa gcaacagagg
aacgaggttg ctggtggtgg tgaagcagct gttgttgagg agacatcatctgttcttcccgtggttgtgg aaagagggaa tgatagcaaa gcctttggtg aagaagacggtggagggatgcatattgttg gcattcgtgc tcatgcagct caccataatc atagtcactctaatgctcatggtacattcg atggacatgc tcatggacaa tcacacggac atgtacatgt tcacgggagt
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ctaaccgcac cgattgggat cgggattgga accgcggtgg cctcgtctttcaactcgcatagccctggag ctttggtcac tgaagggata ctagactcgc tctcggctgggatactgacgtacatggctc tggtggacct aatcgcagct gattttctaa gcaagaggatgagttgtaatgtgaggcttc aagttgtgtc ttatgtcatg ttgttccttg gagctggact tatgtccgca
ctcgccattt gggcttag
附图说明：
图1.构建的植物转化载体示意图；
图2. 叶盘转化法进行组织培养实物图（a 叶片；b，靠近根部的茎；c，上部茎；d，茎和叶片）；
图3.转化植物龙葵在离体培养条件下愈伤组织及其分化图；
图4.转化植物龙葵在离体培养条件下在不同铅、镉浓度下生长的实物图（部分）；
图5.水花生在离体培养条件下根系及植株生长情况实物图；
图6.转基因龙葵和野生型龙葵在复合型重金属土壤中的生长情况；
图7.转化植物龙葵对不同浓度重金属镉的富积示意图；
图8.转化植物龙葵对不同浓度重金属铅的富积示意图；
图9.在土培、不同浓度条件下转化龙葵地上部分对重金属镉富积示意图；
图10.在土培、不同浓度条件下转化龙葵根部对重金属镉富积示意图；
图11.在土培、不同浓度条件下转化龙葵地上部分对重金属铅富积示意图；
图12.在土培、不同浓度条件下转化龙葵根部对重金属铅富积示意图；
图13. 土壤中重金属去除效率，其中A: 只种植非转基因作物; B: 只种植转基因作物;C: 转基因作物+投放蚯蚓;D: 转基因作物+微生物复合菌剂；
图14. 植物地上部分重金属富集效果（mg/kg），其中A: 只种植非转基因作物; B: 只种植转基因作物;C: 转基因作物+投放蚯蚓;D: 转基因作物+微生物复合菌剂；
图15. 矿区周边土壤初始重金属浓度箱型图（mg/kg）；
图16.土壤重金属元素的各化学形态含量和形态分布（mg/kg）；
图17. 土壤初始重金属Zn、Pb、Cd、Cu和Ni浓度（mg/kg）随距离变化图；
图18. 不同修复方案下土壤残余重金属浓度（mg/kg），其中C0为对照组，C1为单独种植转基因龙葵；C2为转基因龙葵+投放蚯蚓； C3为丛枝菌根真菌+施氏假单胞菌+投放蚯蚓；C4为转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图19.修复前后矿山污染土壤中金属化学形态及其占比（%），其中其中C0为对照组，C1为单独种植转基因龙葵；C2为转基因龙葵+投放蚯蚓； C3为丛枝菌根真菌+施氏假单胞菌+投放蚯蚓；C4为转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图20.实验期间温度和土壤含水量变化（SWC），其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图21.不同 Cd 浓度处理条件下植株地上部生物量，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图22. 不同 Cd 浓度处理条件下植株根系长度图，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图23.不同土壤重金属镉（Cd）污染物浓度下，修复完成后植物体内总重金属浓度（mg/kg），其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图24.不同土壤重金属镉（Cd）污染物浓度下，四种修复体系下植物体内重金属浓度（mg/kg）随时间变化图，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；
图25.不同土壤重金属镉（Cd）污染物浓度下，四种修复体系下土壤残余重金属浓度（mg/kg）随时间变化图，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中的Znt1基因来源：十字花科天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）的Znt1基因（由在NCBI网站中的GenBank上检索得到天蓝遏蓝菜的Znt1 cds序列（GenBank：AF133267.1），经过南京一道生物科技有限公司化学合成Znt1目的基因片段，然后经过PCR扩增得到；农杆菌菌株来源：由北京农学院提供；质粒空载体p3301-121来源：由北京农学院提供。
实施例1
转化载体的构建和植物的转化：
1.转化载体的构建：
将Znt1基因（来源于十字花科天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）Znt1基因，由申请人在GenBank上检索得到天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）的Znt1 cds序列，经过南京一道生物科技有限公司化学合成Znt1目的基因片段，然后经过PCR扩增得到），用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ进行酶切后，连接到用相同酶双酶切后的质粒表达载体即植物转化载体p3301-121上，并命名为p3301-121-Znt1质粒（其结构见图1），通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105；
2.植物遗传转化：
将过夜培养的带有p3301-121-Znt1质粒的农杆菌离心，菌体用液体MS 1/10培养基悬浮（图2）。以龙葵（Solanum nigrum L.）为例，将龙葵叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，一部分放入带有p3301-121-Znt1质粒的菌液中浸泡15~20分钟，一部分放入液体MS培养基浸泡15~20分钟，用滤纸吸干多余的菌液或液体后，放在MS培养基（成分：MS粉+3%蔗糖+0.8%琼脂+无菌超纯水）上共培养三天，然后转到筛选培养基: MS+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA+50mg/LKan+250mg/L Rif，同时，把用液体MS培养基浸泡的叶片一部分转到正常培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA)上，用做以后转基因龙葵获基因Znt1抗重金属的对照植株，一部分转移到选择培养基上作为转化叶片的对照，28℃, 16h光照培养进行初步筛选，每十天更换一次培养基。再生的小苗转至生根培养基(MS+0.05mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+50mg/L Kan+200mg/L Rif)生根 （图3）。
实施例2
转基因植物对重金属铅和镉的抗性：
材料选择及其实验步骤：选用PCR呈阳性的转基因龙葵株系的叶片作为材料，通过植物组织培养的方法对所选叶片进行大量繁殖，培养基中需要加入抗生素(50mg/L Kan+250mg/L Rif )进行筛选，当再生植株长有5-6片叶时，选择大小一致的植株，将其切除根后分别转移到含有不同镉和铅离子浓度的生根培养基上进行生长观察，在培养基中分别加入CdSO4(10mg/ml ), PbCl2 (10mg/ml)溶液，使培养基中镉离子浓度分为五个水平(0, 50, 100,150, 200 µmol/L)，铅离子浓度分为五个水平(0, 25, 50, 75, 100 µmol/L)，每个水平三次重复，28℃, 16h光照培养，一个月后收获茎叶和根，并用蒸馏水洗干净，然后将收获的茎叶和根在80℃条件下烘干并且粉碎，采用硝酸~高氯酸(4:1)湿法消化，称取0.1g，加入4ml硝酸和1ml高氯酸，放置过夜，在红外硝化炉上500℃消煮至无色，转移到25ml容量瓶定容，龙葵植株中的重金属含量的分析通过采用原子吸收光谱法得到测定，数据结果取3次结果的平均值。所分析的结果见附图3和图4。其中在含有不同镉浓度和铅浓度的培养基上生长2周后植物吸附量结果见附图7-8。
实施例3
转化龙葵在不同基质条件下对重金属的富积效果：
土培:将转p3301-121-Znt1基因龙葵和野生型龙葵移栽到装有500g土壤的花盆中培养生长一个月左右，期间每周用MS营养液浇一次，一个月后开始对土壤中加入不同重金属浓度的CdSO4(10mg/ml)和PbCl2 (10mg/ml)溶液，其中Cd2+浓度分为五个水平(0, 80, 160,240,320µmol/L)，Pb2+浓度分为五个水平(( 0, 50, 100, 150, 200µmol/L )，每个水平三次重复，将龙葵培育生长一个月后分开收获地上部茎叶和根，用蒸馏水洗干净，然后将其进行80℃烘干并且粉碎待测。龙葵组织中重金属含量的分析采用原子吸收光谱法测定，其测定并分析的结果见图8-图10。其中图8和图9为转化龙葵地上部分和根部的镉富积示意图，图10和图11是转化龙葵地上部分和根部的铅富积示意图。
实施例4
从受重金属严重污染的待修复土壤（来自河北省某废弃锌铁矿）取得受试土壤，土壤pH为7.24，有机质含量2.36%—3.62%，土壤中重金属镉、铅含量分别为4.380×103mg/kg和1.65×103mg/kg中的四个地点采集土样，经过原子吸收光谱测其重金属镉，铅，锌等的含量比对照土壤超标2-5倍。具体修复过程如下：
1.转化载体的构建及植物转化
将转基因植株在生根培养基中培养两周，所述的生根培养基指的是MS培养基（成分：MS粉+3%蔗糖+0.8%琼脂+无菌超纯水），培养基中需要加入抗生素(50mg/L Kan+250mg/L Rif)进行筛选，当再生植株长有5-6片叶时，选择大小一致的植株，将其切除根后分别转移到含有不同土壤进行生长观察。
2. 转化植物对重金属污染土壤修复效果
修复土壤来自河北省某废弃锌铁矿，土壤pH为7.24，有机质含量2.36%—3.62%，土壤中重金属镉、铅含量分别为4.380×103mg/kg和1.65×103mg/kg。
（1）将经过消毒处理的不同株系的转基因龙葵为例移栽至装有500g污染的土壤中，进行初步培养，观察幼苗的长势和大小，半个月以后，向土壤中投放蚯蚓，定期浇水，保持土壤含水量在40%±5%左右；采用的蚯蚓为红色爱胜蚯蚓，蚯蚓的投放量为80-90条/m3。
（2）向表层土壤20cm左右的土壤中掺入微生物复合菌剂，搅拌均匀。微生物复合菌剂加入量为4kg/m3。辅助修复的微生物复合菌剂为丛枝菌根真菌与施氏假单胞菌，比例为2:1。
（3）在植物生长周期结束后，测定重金属镉、铅含量，土壤检测依据GB/T 17141-1997，植物重金属含量依据GBT 5009.15-2003，利用ICP和原子吸收分光光度计对土壤和重金属中的镉、铅含量进行检测。重金属镉、铅含量分别为46.17-64.23 mg/kg,38.28-52.17mg/kg。
3. 设置对照实验
对照组1，在污染土壤中，只种植非转基因作物：烟草、龙葵、马铃薯、番茄、甜菜、花椰菜、水花生、印度芥菜其中一种或几种，进行重金属修复；
对照组2，在污染土壤中，只种植转基因作物：烟草、龙葵、马铃薯、番茄、甜菜、花椰菜、水花生、印度芥菜其中一种或几种，进行重金属修复；
对照组3，在污染土壤中，只种植转基因作物：烟草、龙葵、马铃薯、番茄、甜菜、花椰菜、水花生、印度芥菜其中一种或几种，进行重金属修复；向土壤中投放蚯蚓，采用的蚯蚓为红色爱胜蚯蚓，蚯蚓的投放量为80-90条/m3;
对照组4，在污染土壤中，只种植转基因作物：烟草、龙葵、马铃薯、番茄、甜菜、花椰菜、水花生、印度芥菜其中一种或几种，进行重金属修复；辅助修复的微生物复合菌剂为丛枝菌根真菌与施氏假单胞菌，比例为2:1。
在植物生长周期结束后，收获其地上部分，将土壤样品和植物地上部分分别处理，测定重金属镉、铅含量，土壤检测依据GB/T 17141-1997，植物重金属含量依据GBT5009.15-2003，利用ICP和原子吸收分光光度计对土壤和重金属中的镉、铅含量进行检测。结果如图13和图14所示。
4.实验结果
转化与野生型龙葵分别栽种在污染土壤中的生长效果见图12；图12上是转化Znt1基因龙葵，图12下是野生型龙葵。结论说明：在含有Cd与Pb的污染土壤中，转Znt1基因的龙葵就清除土壤中的污染物能力要显著高于野生型龙葵（图12）。总体上，转基因龙葵对土壤中的Cd和Pb的积累量是野生型龙葵积累量的1.2-1.5倍，而其中不同Cd浓度下（0~36mg/kg）转化龙葵与野生型龙葵的地上部分和根部的Cd含量变化趋势相同，并且野生型低于转化龙葵的积累量：不同Pb浓度（0~20mg/kg）下二者的地上与根部Pb含量变化趋势与Cd相同。同时转化龙葵在污染的复合土壤中的耐受性高于野生型龙葵。如图13所述，经转基因植物-蚯蚓-微生物修复后，土壤中重金属镉、铅含量与未经污染土壤重金属镉、铅含量相比，可以看出，转基因植物-蚯蚓-微生物对土壤中镉、铅去除最高，可达68.12%,远大于对照组1，2，3，4。如图14所述，不同处理条件下转基因植物-蚯蚓-微生物修复后，植物中重金属镉、铅含量效果差异较大，可以看出，转基因植物富集效率远大于对照组1，2，3，4。
实施例5
本发明进一步公开了利用转基因植物修复重金属污染土壤方法在用于对矿山污染土壤以及周边堆土场场地污染修复方面的应用；所述的重金属污染指的是Zn、Cd、Cr、Pb、Cu和Ni多种复合金属，所用转基因植物为烟草、龙葵、马铃薯、番茄、甜菜、花椰菜、水花生、印度芥菜中的一种（优选作物为转基因龙葵），所述微生物复合菌剂为丛枝菌根真菌与施氏假单胞菌；蚯蚓品种为红色爱胜蚓，其投放量为90条/m3。
具体步骤如下：
（1）选定调查区域（5km2），按照《地质环境监测管理办法》、《城市环境水文地质规范》、《固体矿产地质勘察规范总则》以及《环境监测技术规范及测定方法标准》等要求，通过“梅花”布点对矿区内多个地点进行土壤取样（n=44，m=500 g），搜集典型矿区复合污染物分布信息，调查不同采样距离下矿区周边的土壤复合污染情况。根据步骤（2）和（3）获取不同污染物浓度数据。其中，图1为采样点重金属污染物浓度箱型图，图2为采样点重金属污染物浓度随距离变化图。
（2）化学分析，将收集的土壤剔除植物根系、石头等大颗粒组分，过200目筛，取0.2g土壤加入10mL 混酸（HNO3-HCl-HF），然后在微波消解仪中进行微波消解，根据消解要求对消解仪进行程序升温（4h），消解完成后，将液体过0.45μm的微孔过滤膜，烧杯收集澄清液体，放置于电热板加热至近干，然后加入5 mL1%的稀硝酸（HNO3）加热溶解。静置后，利用耦合电感光谱仪（ICP-MS）对土壤中的重金属元素进行化学分析。此外，为了分析重金属污染物（Cu、Zn、Cd、Ni、Pb）的赋存形态，利用Tessier五步提取法对土壤样本进行提取，然后耦合电感光谱仪（ICP-MS）对土壤中的总重金属元素进行化学分析，并且根据地球化学土壤参考物质（GBW07430：GSS-16）在75-120％的可接受回收率范围内测定的重金属回收率为82.1％-108.25％。
（3）为了确保所有土壤样品的验证结果准确性，实施质量保证/质量控制（QA /QC），主要涉及仪器校准和平行样品实验。在用空白和适当的校准标准分析样品之前，应用1、10、50和100μg/ L的校准标样校准仪器，仅接受0.999以上的R2。用10μg/ L和50μg/ L标准品验证校准，然后用合适的内标（即Zn，Pb，Cr，Cu，Hg和Cd）进行标定。平行样品一式三份，数据以平均值±标准偏差（SD）表示。当一式三份的样品中的百分比差异和百分比误差低于10％时，认为数据是可接受。低于检测限（BDL）的数据依靠EPA指南进行拟合处理。此外，3份土壤样本被送到其他实验室进行分析，以进一步确保结果的有效性。
（4）结合场地调查数据，设计不同污染物浓度实验，
将几种具有不同降解功能和具有吸附效应的微生物按适当的比例组合配制复合修复体系（C1：转基因龙葵；C2：转基因龙葵+投放蚯蚓； C3：丛枝菌根真菌+施氏假单胞菌+投放蚯蚓；C4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌），测定不同修复体系对复合重金属污染物的降解效率（图18），着重考虑土壤中金属污染物的赋存状态（可溶态、铁锰氧化态、残渣态、碳酸盐态、有机结合体态等）对多介质复合污染物的残余浓度变化及降解的影响（图16）。具体内容如下：
首先，将转基因龙葵苗圃在温室中进行萌发，2周后，选择具有发育良好的根系和相同大小（约7-8cm高）的龙葵幼苗进行移植。
其次，分别取10kg分装、晾晒、静置2个月后的矿山污染土壤，置于直径为80cm的花盆中，喷洒适量水分，待用。
再次，设计不同比例组的复配修复体系（C1：转基因龙葵；C2：转基因龙葵+投放蚯蚓； C3：丛枝菌根真菌+施氏假单胞菌+投放蚯蚓；C：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌），测定不同修复体系对重金属镉（Cd）污染物的降解效率（图14）。供试龙葵品种为茄科一年生草本植物，少花龙葵（Solanum nigrum L. ），着重考虑不饱和包气带中Cd、Pb、Zn和Cu的初始污染物浓度（图15），土壤重金属元素的各化学形态含量和形态分布（mg/kg）（图16），和土壤初始重金属Zn、Pb、Cd、Cu和Ni浓度（mg/kg）随距离变化（图17），在实验期间，测试不同修复方案下土壤残余重金属浓度（mg/kg）（图18）。
然后，种植30天后收获每种方案的整株植物。将转基因龙葵植物的叶，茎和根用自来水冲洗并清洗，然后用去离子水洗涤三次。将之置于105℃的烘箱中0.5小时（杀青），然后在90℃下干燥（24-48h）至恒重。收集10g不同土壤层（0-80cm）的根际土壤样本，烘干研磨后过200目筛，待用。
最后，化学分析与数据统计，利用SPSS对数据进行统计，绘制重金属含量曲线。然后，利用利用耦合电感光谱仪（ICP-MS）对土壤中的重金属元素进行化学分析，具体步骤参考（2）和 （3）。
研究结果表明：矿山土壤中的重金属铅、锌、镉浓度明显超过国家土壤二级标准（国标，1995），其中土壤中5种重金属元素中含量最高的是Zn，达到523.81±17.04 mg/kg，Pb离子浓度为342.15±16.23 mg/kg，Cu离子浓度为156.17±14.30 mg/kg，Ni离子浓度为51.24±6.19 mg/kg，Cd离子浓度为5.47±0.20 mg/kg（图18），对土壤样品中的Zn、Pb、Cu、Ni、Cd等5种重金属元素的各化学形态含量和形态分布进行分析（图19），土壤中重金属Pb、Zn、Cu、Ni以残渣态为主，占比＞60%。其中，Zn离子的弱酸态、还原态、氧化态的含量分别为11.77%、10.58%和11.22%。说明其具有一定的活跃性，对土壤和生态风险产生威胁。与之相比，土壤中的Ni和Cu具有较低的迁移性和生物可利用性。土壤中的Cd形态分布与Zn基本一致，主要以弱酸态和可还原态的形态存在，Cd离子的弱酸态和还原态的占比分别为22.87%和30.17%，这与张康等人（2019）的研究一致。金属的酸溶态是迁移性最强的化学形态，5种金属酸溶态的含量从高到低的顺序为：Cd（22.87%）>Zn（11.77%）>Pb （4.78%）>Cu（4.76）>Ni（4.22%）。这说明Cd、Zn和Pb具有较高的迁移性和植物可利用性，容易被植物吸收或进入地下水中导致环境污染，在修复过程中应该予以重点关注。
矿区周边土壤污染物分布特征如图17所示，研究显示了采矿口附近土壤中铜，铬，镉，铅，锌浓度随着距矿区的距离的变化。说明采矿活动导致周围空气、水体和土壤中Cd，Cu，Pb和Zn的积累和污染。具体说来，当距离为0-2km时，土壤中污染物浓度下降迅速，随后浓度缓慢下降，当研究距离扩大到5km，土壤中的重金属浓度与当地背景值相差不大（河北省土壤重金属含量背景值）（图21）。这种现象及颗粒迁移速率与自然因素（包括风，降水，地表径流等）具有重要的相关性。其中，废弃矿井的排水仍然含有高水平的微量金属元素，这些水体排入到附近的溪流，溪水夹带矿井排水通过流入地表径流，进而水中的小颗粒尾矿运输到在远离采矿区的土壤中（图21）。而且，恶劣的天气因素也会对重金属元素的扩散有一定影响。例如，夏季降雨事件、冰雹和飓风会导致采矿源运输到邻近农田的微量元素的大量释放。然而，取样区域中Ni的含量较低且与距离的相关性较小（图21），这可能是因为土壤中的Ni主要是来源于成土母质而不是矿化作用导致的来解释。
随着修复的完成，土壤中的重金属总量呈现明显下降趋势（图22）。总的来说，利用转基因植物的自然生长实现了对受污染土壤中的重金属进行吸附、吸收、挥发、稳定和降解等作用，从而降低土壤重金属浓度。与C0对照组相比，单独种植转基因龙葵（C1）对重金属Cd、Zn具有较好的去除作用。重金属Cd浓度从5.82 mg/kg下降到3.02 mg/kg，重金属Zn浓度从523.76 mg/kg下降到358.76 mg/kg，重金属Pb浓度从356.22 mg/kg下降到268.44 mg/kg，重金属Cu浓度从161.40 mg/kg下降到105.22 mg/kg。C2为转基因龙葵+投放蚯蚓；加入蚯蚓后，土壤中的残余重金属含量明显下降，特别是对Cu离子。其浓度从161.40 mg/kg下降到97.22 mg/kg，与C0相比，降低了8.23%。这是因为，蚯蚓可通过自身的直接作用( 吸收、转化和分解) 或间接作用( 改善土壤理化性质、提高土壤肥力、促进植物和微生物的生长)修复污染土壤，尤其对铜离子具有较好的富集作用， 同时蚯蚓粪还能促进铜离子向地上部分迁移，促进植物形成更好的富集效果（图22）。C3为丛枝菌根真菌+施氏假单胞菌+投放蚯蚓；菌类的存在能够将土壤中的活性重金属钝化，转化为残渣态重金属，从而降低其生物利用度（图22），但与植物修复相比，其总重金属浓度下降效果不明显。C4为转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌，该组合较好的利用了各个组分的优势，修复完成后，土壤中Cd、Zn、Pb、Cu和Ni的含量分布为3.02、237.21、204.22、92.77和45.23 mg/kg。满足国家土壤二级标准，说明了该方法的有效性。
图23为修复前后矿山污染土壤中金属化学形态及其占比（%），其中C0为对照组，C1为单独种植转基因龙葵；C2为转基因龙葵+投放蚯蚓； C3为丛枝菌根真菌+施氏假单胞菌+投放蚯蚓；C4为转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌。研究结果显示，C1-C4四种处理方式下，可溶态Cd占比变化不大，而弱酸态浓度排序为C1（0.70 mg/kg）> C2(0.63 mg/kg)> C4 (0.61 mg/kg) > C3 (0.52 mg/kg) （图23）。说明丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌降低了Cd的生物可利用度。四种处理下还原态Cd含量在0.76-0.85mg/kg，氧化态Cd含量在0.22-0.41 mg/kg，说明处理方式对Cd的各个赋存形态均一定影响（图23）。通过金属硫化物、金属磷酸盐沉淀、细菌胞外多聚体以及真菌分泌物实现对重金属离子的赋存形态转化。从Zn的赋存形态来看，各处理组(C1-C4)的可溶态范围为 2.99~6.35 mg/kg，弱酸态为21.87- 44.88 mg/kg ，还原态为21.61-31.46 mg/kg，氧化态为20.83-47.39 mg/kg，残渣态为178.43 -373.02 mg/kg（图23）。其中，相对处理组 C0，处理组C1、C2的生物可利用态（可溶态、弱酸态和还原态）有所增加。另外，可氧化态Zn含量也相对较高，这是因为该土壤中含有大量风化的硫化锌矿石颗粒，其中的Zn离子与土壤中的有机质和硫化物结合，可以被植物间接利用。C3的残渣态Zn含量最高，说明丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌的投放能降低Zn的迁移转化能力（图19）。与Cd、Zn离子类似，土壤中的氧化态Pb离子在20.87-38.56mg/kg，弱酸态为8.68- 14.90 mg/kg ，还原态为16.58-27.19mg/kg，氧化态为20.87-36.27mg/kg，残渣态为148.18 -219.66 mg/kg。说明土壤中的生物可利用Pb含量明显下降，且残渣态Pb含量占比提高（图23）。土壤中的Cu离子具有明显降低，但Ni离子变化不大，这可能是因为土壤中固有的Ni含量不高，且多为残渣态，吸附、富集作用不明显（图23）。
实施例6
本发明同时也公开了利用转基因植物修复重金属污染土壤方法在用于对电镀厂废弃厂址及周边土壤修复方面的应用；所述的重金属污染以Cd污染为主。实验土壤取自天津市武清区某废弃的电镀厂，在每个取样点通过不锈钢土壤螺旋钻收集土壤样品（0-25cm）并包装在聚乙烯塑料袋（1kg）中。然后将样品自然风干，混合并通过2mm筛网筛分用于温室实验。实验土壤的物理化学性质如下：密度为1.38 g/cm3。土壤pH值为7.12。土壤成分含有87.22mg/kg的N，8.21 mg/g的P，168.92 mg/kg的K，14.68％的有机碳。污染物以镉离子为主，其浓度在0.02-16.47 mg/kg。随后根据本底调查结果，设计不同污染物浓度梯度实验进而确定最优种植方案，盆栽实验于2019年5月到6月在北京农学院产业园进行。具体步骤如下：
(1)将转基因龙葵苗圃在温室中进行萌发，2周后，选择具有发育良好的根系和相同大小（约7-8cm高）的龙葵幼苗进行移植。
(2)将混合配置好的实验土壤(10kg)置于直径为80cm的花盆中，一式三份，然后喷洒不同浓度的[(CH3COO)2Cd·3H2O],共计4个镉浓度梯度（0.2、5.0、10、15和20 mg/kg）。
(3)设计不同比例组的复配修复体系（S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓；S3：转基因龙葵+丛枝菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌/施氏假单胞菌），测定不同修复体系下土壤重金属镉（Cd）污染物的去除率（图6），着重考虑不饱和包气带中Cd迁移转化效率以及植物的富集系数（图7）。在不同时间间隔内（5、10、15、20、25、30天），一式三份的收获植株。将转基因龙葵植物的叶，茎和根用自来水冲洗并清洗，然后用去离子水洗涤三次。105℃杀青15min，然后80℃烘干至恒重。收集10g不同土壤层（0-80cm）的根际土壤样本，烘干研磨后过200目筛，进行化学分析。
（4）在实验期间，通过便携式水分测试仪测量每日土壤含水量（SWC）（图8），并记录植物生物量和植物根长(cm)、平均直径(mm)、根表面积(cm2)、根体积（cm3）等参数（图9）。
（5） 种植30天后，收获每种方案的整株植物。将转基因龙葵植物的叶，茎和根用自来水冲洗并清洗，然后用去离子水洗涤三次。将之置于105℃的烘箱中0.5小时（杀青），然后在90℃下干燥（24-48h）至恒重。收集10g不同土壤层（0-80cm）的根际土壤样本，烘干研磨后过200目筛，进行化学分析。
（6）化学分析，将收集的土壤、植物根系、茎和叶片研磨，过200目筛，取0.2g土壤加入10mL 混酸（HNO3-HCl-HF），然后在微波消解仪中进行微波消解，根据消解要求对消解仪进行程序升温（4h），消解完成后，将液体过0.45μm的微孔过滤膜，烧杯收集澄清液体，放置于电热板加热至近干，然后加入5 mL1%的稀硝酸（HNO3）加热溶解。静置后，利用耦合电感光谱仪（ICP-MS）对土壤中的重金属元素进行化学分析。
（7）为了确保所有土壤样品的验证结果准确性，实施质量保证/质量控制（QA /QC），主要涉及仪器校准和平行样品实验。在用空白和适当的校准标准分析样品之前，应用1、10、50和100μg/ L的校准标样校准仪器，仅接受0.999以上的R2。用10μg/ L和50μg/ L标准品验证校准，然后用Cd内标液（μg/ L）进行标定。平行样品一式三份，数据以平均值±标准偏差（SD）表示。当一式三份的样品中的百分比差异和百分比误差低于10％时，认为数据是可接受。低于检测限（BDL）的数据依靠EPA指南进行拟合处理。此外，3份土壤样本被送到其他实验室进行分析，以进一步确保结果的有效性。
实验结果显示：
图20 实验期间温度和土壤含水量变化（SWC），其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌。从图中可以看出，几种条件下土壤含水量变化不大，且均能保持土壤湿润状态，有利于植物的正常生长。
图21显示了不同 Cd 浓度处理条件下植株地上部生物量，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌。从图中可以看出，随着Cd浓度的升高，转基因植株地上部干重逐渐下降，当土壤中浓度超过30 mg/kg时，4种条件下（S1-S4）地上部干重均明显下降。与S1相比，其下降幅度分别为38.46%、43.35%、29.03%和28.80%，说明植物的生长受到严重胁迫作用。而当土壤Cd浓度升高至60 mg/kg，与S1相比，其地上部干重下降幅度分别为40.48%、38.28%、37.50%和38.80%，说明植物的生长受到严重胁迫作用。
图22 显示了不同 Cd 浓度处理条件下植株根长（cm）、平均直径（mm）、跟体积（cm3）和根表面积（cm2），其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌/施氏假单胞菌。与植物生物量结果类似，随着土壤Cd浓度的增加，植株根长（cm）、平均直径（mm）、根体积（cm3）和根表面积（cm2）均呈现降低趋势。从外表特征上看当污染物浓度大于30mg/kg时，根系开始表现出明显受毒害症状。对照组S1相比，S3的4组的植株的根长(cm)下降了49.13%、44.53%、46.75%和43.54%；平均直径（mm）下降了20.00%、13.16%、10.26%和15.00%；根体积（cm3）下降了26.24%、26.51%、27.46%和25.03%；根表面积下降了56.27%、53.21%、54.24%和52.70%。数据结果显示，相同浓度下，四种实验方案（S1-S4）下植株根系指标有所差异，但差异并不显著。而当改变浓度时，根系指标则具有显著。说明浓度是影响根系正常生长的主要因素。
不同土壤重金属镉（Cd）污染物浓度下，修复完成后植物体内总重金属浓度（mg/kg）具有较大差异，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌（图23）。随着处理浓度的上升，植物体内累积的重金属浓度呈现明显上升趋势（图23）。当污染浓度为0.2 mg/kg，植物的吸附量仅为0.42-0.62 mg/kg。当土壤中Cd浓度升高至30 mg/kg，植物吸附量升高至76.22 -91.32 mg/kg。而当土壤中Cd浓度升高至60 mg/kg，植物吸附量升高至134.45 -167.38 mg/kg。其中，加入菌剂（丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌）并投放蚯蚓，可以有效的提高土壤重金属的迁移效率，同时提高植物的吸附量。研究结果表明，当土壤中Cd污染物浓度为20、30、60 mg/kg，S2中三组植物的吸附量较对照组S1中三组植物的吸附量分别提高了4.43%、13.11%和8.75%（图23）。当土壤中Cd污染物浓度为20、30、60 mg/kg，S3中三组植物的吸附量较对照组S1中三组植物的吸附量分别提高了17.05%、16.47%和15.22%（图19）。该结果表明加入菌剂（丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌）对植物吸附量的影响大于加入蚯蚓对植物吸附量的影响。而当两者联合时，其效果更为显著。如图所示（图23），当土壤中Cd污染物浓度为60 mg/kg，S4中植物的吸附量比对照组S1中植物的吸附量提高了19.81%、18.32%和24.49%。值得注意的是，联合使用两种方法能够明显提高植物的吸附性能，但二者并非是单独的加和作用，而是蚯蚓的新陈代谢和菌类微生物的消化反应协同作用的结果。
图24显示了不同土壤重金属镉（Cd）污染物浓度下，四种修复体系下植物体内重金属浓度（mg/kg）随时间变化图，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌。研究结果表明随着修复时间的延长，植物体内重金属含量呈现上升趋势。如图所示，四种情形下，植物在生长前期Cd积累量差异并不显著。这是因为前期植物主要是以生长为主，对微量元素的需求量较低，且根系不发达，难以吸收过量的Cd元素。当修复时间为10天，四种情形下植物的吸附量分别为0.11-0.21 mg/kg，6.77-8.78 mg/kg、8.57-13.53mg/kg、11.44-26.41mg/kg和27.11-38.78 mg/kg。说明浓度越高，四种组合方案吸附量的差距越大。而当修复期增长到20天，四种情形下植物的吸附量分别为0.26-0.41 mg/kg，14.21-19.37 mg/kg、32.77-36.45 mg/kg、58.77-62.11 mg/kg和76.69-84.76 mg/kg。当修复时间为25天，植物的吸附量显著上升，四种情形下植物的吸附量分别为0.32-0.55 mg/kg，27.54-34.54 mg/kg、56.78-60.25 mg/kg、78.25-88.29 mg/kg和97.25-123.77 mg/kg。而当修复期完成，四种情形下植物的吸附量达到最大值。事实上，当修复时间过长（>45天），土壤和植物之间可以交换大量的镉，进而导致植物中的Cd产生外排趋势。同时，根系分泌物的产生也可能导致镉吸附量的降低，进一步导致烟草中镉的流出。考虑到此处主要是进行植物修复，关于外排机制问题并未进行深入研究。
4种方案对土壤重金属的去除效果见图25，即不同土壤重金属镉（Cd）污染物浓度下，四种修复体系下土壤残余重金属浓度（mg/kg）随时间变化图，其中S1：转基因龙葵；S2：转基因龙葵+投放蚯蚓； S3：转基因龙葵+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌；S4：转基因龙葵+投放蚯蚓+丛枝菌根真菌/施氏假单胞菌。研究结果表明，随着修复时间的增加，土壤中Cd含量呈显著下降趋势，且污染物浓度与土壤深度呈线性关系。土壤层（0-40cm）的重金属含量显著下降，而当土壤层深度为60-80cm，土壤中Cd浓度下降趋势不明显。这与根系部分情况是一致的。即转基因龙葵的根系主要分布在0-40cm土壤，随着土壤深度的增加，根系密度下降，导致其吸附能力降低。然后，值得注意的一点是，蚯蚓的存在提高了土壤中Cd的迁移效应（S2），与未添加蚯蚓的组(S1、S3、S4)相比，根系土壤中Cd吸附量明显下降。
序列表
<110> 中国科学院地理科学与资源研究所
<120> 一种转基因植物复合体系应用于污染土壤的植物修复方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggcttcat ctcccacgaa aatcctctgt gatgctggcg aatcagacct ctgtcgagac 60
gatgcagctg catttctact caaattcgta gccattgcat caatcctcct agccggagct 120
gcaggtgtag ccatacctct catcggcaag aaccgccggt tccttcaaac cgaaggaaat 180
ctctttgtag ctgctaaagc cttcgcagcc ggtgtcatac tcgccactgg cttcgtccat 240
atgcttgcag gcggcacgga agctctgacc aatccgtgct taccggatta tccgtggtct 300
aagtttccct ttcccggctt ctttgcaatg gtggctgctt tgataactct gcttgtggat 360
ttcatgggga cacagtacta tgagagtaag caacagagga acgaggttgc tggtggtggt 420
gaagcagctg ttgttgagga gacatcatct gttcttcccg tggttgtgga aagagggaat 480
gatagcaaag cctttggtga agaagacggt ggagggatgc atattgttgg cattcgtgct 540
catgcagctc accataatca tagtcactct aatgctcatg gtacattcga tggacatgct 600
catggacaat cacacggaca tgtacatgtt cacgggagtc atgatgtcga aaatggagct 660
aggcatgttg ttgtttctca gatattggag cttgggattg tgtcacactc aatcatcatc 720
ggtttatccc tcggtgtatc gcagtctccg tgcacgatca ggcctctcat tgcagctcta 780
tcatttcacc agttcttcga agggtttgcg ttaggaggct gcatctccca agcacagttt 840
aagaacaaat cagccatcat aatggcttgc ttctttgccc taaccgcacc gattgggatc 900
gggattggaa ccgcggtggc ctcgtctttc aactcgcata gccctggagc tttggtcact 960
gaagggatac tagactcgct ctcggctggg atactgacgt acatggctct ggtggaccta 1020
atcgcagctg attttctaag caagaggatg agttgtaatg tgaggcttca agttgtgtct 1080
tatgtcatgt tgttccttgg agctggactt atgtccgcac tcgccatttg ggcttag 1137
Claims (9)
1.一种转基因植物,其质粒命名为p3301-121-Znt1质粒。
2.一种转基因植物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）转化载体的构建：
将源于十字花科天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）的Znt1基因，用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ进行酶切，然后连接到用相同酶双酶切后的质粒表达载体即植物双元转化载体p3301-121上，命名为p3301-121-Znt1质粒，通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105中；
（2）植物遗传转化：
通过农杆菌介导的叶盘转化方法，将重组的表达载体p3301-121-Znt1转入到目标植物叶片中，之后放在含有卡那霉素的MS培养基上筛选获得小苗，放于生根培养基上诱导生根，待根系健壮后放入温室培养获得完整的目标植物转化苗；其中所述的植物是龙葵，烟草，油菜，紫花苜蓿，印度芥菜。
3.权利要求2所述的转基因植物的制备方法，其具体步骤如下：
（1）将过夜培养的带有p3301-121-Znt1质粒的农杆菌离心，菌体用液体MS 1/10培养基悬浮；
（2）将植物叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，一部分放入带有p3301-121-Znt1质粒菌液中浸泡15~20分钟，一部分放入液体MS培养基中浸泡15~20分钟，用滤纸吸干多余的菌液或液体后，放在MS培养基上共培养三天，然后转到筛选培养基上；
（3）同时，把用液体MS培养基浸泡的叶片一部分转到正常培养基上，用作以后转基因植物抗重金属的对照植株，一部分转移到选择培养基上作为转化叶片的对照，28℃, 16h光照培养进行初步筛选，每十天更换一次培养基；
（4）再生的小苗转至生根培养基生根，进过20~30天获得转基因植物转化苗；其中的筛选培养基是MS+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA+50mg/L Kan+250mg/L Rif；正常培养基是MS+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA；生根培养基是MS+0.05mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+50mg/L Kan+200mg/L Rif。
4.权利要求1所述转基因植物制备方法在用于废弃矿山土壤和废弃电镀厂场地土壤修复方面的应用；所述的重金属污染指的是Cd、Cr、Cu、Pb和Ni多种复合金属。
5.一种利用转基因植物修复重金属污染土壤的方法，其特征在于将可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，获得可修复重金属污染的转基因植物，在污染土壤种植转基因植物，辅以蚯蚓和微生物复合菌剂对污染土壤进行修复；其中可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一：来源于大肠杆菌Znt或天蓝遏蓝菜Znt1；所述微生物复合菌剂为丛枝菌根真菌与施氏假单胞菌，体积比为2:1；蚯蚓品种为红色爱胜蚓，其投放量为80-90条/m3。
6.权利要求5所述的一种利用转基因植物修复复合重金属污染土壤的方法，其特征在于：所述的植物为以下植物中的一种：烟草、龙葵、马铃薯、番茄、甜菜、花椰菜、水花生、印度芥菜。
7.权利要求5所述的一种利用转基因植物修复复合重金属污染土壤的方法，其特征在于：所述的污染土壤含水量为36-46%，重金属污染程度为中、轻度污染。
8.权利要求5所述利用转基因植物修复重金属污染土壤方法用于对矿山污染土壤以及周边堆土场场地污染修复方面的应用。
9.权利要求5所述的利用转基因植物修复重金属污染土壤方法在用于对电镀厂废弃厂址及周边土壤修复方面的应用。
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