CN110386671A - 一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法。其特征在于：1.针对中、轻度污染水体常规植物难以生长的特点，利用吸附效率高、抗逆性强的转基因植物将水体中的富营养元素及重金属元素转移并固定到底泥中。2.通过微地形改造结合植物配置的方式，划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，保障转基因植物生长的初始条件，提高被污染河道水体的修复效率。本发明在强化河道湖泊污染水体原位修复种具有适应性强，环境友好等多重优点，具有广泛应用前景。

Description

一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法
技术领域
本发明涉及河道治理修复领域，特别是涉及利用转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法。
背景技术
水是自然环境和农业生产的重要资源，目前我国许多河道湖泊都面临着不同程度的水质污染问题，尤其是水体重金属含量过高而导致的水生生态系统失衡。特别是工业废水和生活污水的排放导致大量有机物、P、N元素以及重金属离子进入水体，导致浮游生物、藻类生物死亡，水质恶化，鱼虾及其他生物死亡，影响生态循环。近年来，随着可持续发展、环境保护、生态意识的增强，河道生态系统的修复问题受到社会各界的广泛关注。在河道湖泊的水质改善治理过程中，为达到既美化又净化环境的目的，引种去污能力强且具有观赏价值水生植物具有成本低、处理效果好、生态环保等优点，成为受损河道修复的一种新措施。
近年来，针对不同水生植物进行河道湖泊修复的效果已经有所报道。例如，金树权等（2010）选取10种水生植物水罂粟、黄花水龙、大聚藻、香菇草、水芹、大薸、凤眼莲、美人蕉、黄菖蒲和鸢尾，对其吸收氮、磷和净化水质的能力进行了比较研究。王谦和成水平（2010）对4种生活型水生植物(挺水、漂浮、浮叶和沉水)对重金属的蓄积效果进行了分析。曾小平（2018）发现大叶皇冠草的光合氮利用效率（20.31±0.30）是鸢尾草的3倍之多。而美人蕉、水罂粟、风车草和香蒲的光合氮利用效率值均较高,且差异不明显。然而，大多数植物是采用传统水生生物，其富集能力与抗逆性有限，对水体营养物质含量、水流速度以及其他生长环境要求较高，限制其应用。
因此，为了解决水生植物其富集能力与抗逆性有限，对水体营养物质含量、水流速度以及其他生长环境要求较高的问题，本技术引用转基因植物对水体进行修复。
发明内容
为了解决水生植物其富集能力与抗逆性有限，对水体营养物质含量、水流速度以及其他生长环境要求较高的问题，本技术引用转基因植物对水体进行修复。
本发明针对中、轻度污染水体常规植物难以生长的特点，利用水生植物对水体和底泥中元素进行选择性吸收、积累的特性，选取吸附效率高、抗逆性强的转基因植物将水体中的富营养元素及重金属元素转移并固定到底泥中。然后，通过微地形改造结合植物配置的方式，划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，控制水流速度；添加药剂降低沉积区淤泥中营养物质及重金属物质含量，构建植物生长的初始条件，用来种植转基因植物。此外，随着转基因植物的生长，沉积区沉积物中的淤泥不断增加，需要人为清理，保证植物正常生长，从而转移河道湖泊系统中污染物的目的。
基于以上内容，本发明的技术方案主要有以下内容：
一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）通过吸附效率高、抗逆性强的转基因植物将水体中的富营养元素及重金属元素转移并固定到底泥中；所述的植物为以下植物中的一种或多种：水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草；可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一：来源于转运硫蛋白MT1、MerA、MerB基因；
（2）通过微地形改造结合植物配置的方式，划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，控制水流速度；添加药剂降低沉积区淤泥中营养物质及重金属物质含量，构建植物生长的初始条件，用来种植转基因植物；所述的药剂指的PLEXON-2210，投加量为2.5±0.02mg/m3；
（3）随着转基因植物的生长，沉积区沉积物中的淤泥不断增加，人为加以清理，保证转基因植物正常生长；
本发明所述构建侵蚀区和沉积区的浅层为15-25cm对有机C、N、P、Cd、Pb、Ni呈富集作用。
本发明所述的方法，其中污染河道和湖泊水体和底泥的重金属污染程度为中、轻度污染。
本发明进一步公开了转基因植物的制备方法，按如下的步骤进行：
（1）构建植物表达载体
（a）根据NCBI数据库查询Znt1序列，由南京一道生物科技有限公司化学合成Znt1基因片段，将含有表达载体p3301-121-Znt1的大肠杆菌液划线培养至含卡那霉素（Kan）的LB（Luria-Bertani）培养基中，37℃下过夜培养至OD600=0.4-0.6；
（b）使用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒法提取大肠杆菌液中的扩繁载体，收集过夜培养的目标大肠杆菌菌液（DH5α），对目标菌体进行重悬、裂解、中和操作之后，向吸附柱中央加入65℃的Elution Buffer，在13000rpm下离心1分钟后静置，将收集的目标载体存于-40℃冰箱；
（c）将含有目的基因的植物表达载体p3301-121-Znt1导入农杆菌EHA105中，获得用于植物遗传转化的工程菌；首先制备感受态农杆菌，并保存于-80℃冰箱；将纯化后质粒DNA加入解冻后的农杆菌液，将混合物在2.5kV、25uF条件下进行脉冲电转化，重悬细胞震荡培养后涂布于含有卡那霉素（Kan）+利福平（Rif）的YEB培养基；
（2）构建转基因植株
（a）受体材料预培养：将无菌植物叶片剪为1cm×1cm的小块，茎段纵向切为1cm的切断，置于愈伤组织培养基上进行预培养2-3d，切口开始膨大时进行侵染、
（b）农杆菌液预培养：平板上挑取单菌落接种至含有Kan+Rif的YEB液体培养液中，室温下180rpm震荡培养至OD600=0.2-0.5后即可用于转化、
（c）将菌液置于20ml无菌离心管中，6000rpm离心10分钟后弃上清液，向离心管中加入MS培养液，震荡至沉淀消失，无菌操作台上将预处理后的植物叶片及茎段加入MS重悬液，倒置数次后静置，共培养20分钟，侵染后的外植体植株移至MS固体培养基中培养2-3d后移至含有Kan+Rif的愈伤组织培养基中。
本发明所述的植物为以下植物中的一种或多种：水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草。
本发明所述的YEB培养基是酵母提取物 6g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、MgSO40.4938g/L、pH=7.2，固体培养基含琼脂15g。
本发明所述的愈伤组织培养基是MS+2,4D（2mg/L）+6BA（1mg/L）+Kan（50mg/L）+Rif（200mg/L）。
本发明同时也公开了采用转基因植物质粒p3301-121-ZnT1对污染废水进行修复方法在用于对废水重金属污染进行修复方面的应用，所述的重金属指的是：Cd、Pb、Zn。实验结果显示随着转基因植物的种植，溶液中的Pb和Zn浓度显著下降，而植物体内的重金属浓度随着时间的增长也有显著提高。
本发明进一步公开了转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法在提高重金属去除率方面的应用。特别是加入药剂后去除率可提高至92%以上，满足国家二类土壤重金属含量标准以及水体V类重金属含量标准。
本发明更加详细的描述如下：
（1）通过吸附效率高、抗逆性强的转基因植物将水体中的富营养元素及重金属元素转移并固定到底泥中；
（2）通过微地形改造结合植物配置的方式，划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，控制水流速度；添加药剂降低沉积区淤泥中营养物质及重金属物质含量，构建植物生长的初始条件，用来种植转基因植物；
（3）随着转基因植物的生长，沉积区沉积物中的淤泥不断增加，人为加以清理，保证植物正常生长；所述的转基因植物指的是转基因水生生物，如水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草。可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一：来源于转运硫蛋白MT1、MerA、MerB基因；所述的药剂指的PLEXON-2210，投加量为2.5±0.02mg/m3。本发明所述构建侵蚀区和沉积区的浅层为15-25cm对有Cd、Pb、Zn呈富集作用。所述的污染河道和湖泊水体和底泥的重金属污染程度为中、轻度污染。
本发明进一步公开了转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法在用于提高被污染河道水体的修复效率方面的应用，借助微地形改造结合植物配置的方式，划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，控制水流速度；添加药剂降低沉积区淤泥中营养物质及重金属物质含量，构建植物生长的初始条件，用来种植转基因植物。同时随着转基因植物的生长，沉积区沉积物中的淤泥不断增加，需要人为清理，保证植物正常生长，从而达到转移河道湖泊系统中污染物，实现净化水体的目的。实验结果显示:随着转基因植物的种植，河道周围生态环境明显改善。与修复前相比，0-40cm土壤中的锌离子（Zn）含量从781±45.22 mg/kg下降至254.32±21.76 mg/kg，土壤中的铅离子浓度从65±0.22mg/kg，下降至37.38±0.44mg/kg。土壤中的镉（Cd）从1.37±0.42mg/kg，下降至0.26±0.05mg/kg。满足国家二级土壤重金属含量标准（SEPA，1995）。修复前水体中的Cd， Pb和Zn的平均浓度分别为0.028, 0.120和12.0mg/L， pH值介于6.81-6.92。溪流中Cd的浓度是V类地表水国家标准的1.5倍，这意味着地表水不能满足农业灌溉的要求（SEPA 2002）。种植转基因作物并投放药剂一年后，水体中的Cd， Pb和Zn的平均浓度下降为0.012, 0.025和4.52mg/L，说明该方法具有较好的修复效果。
在本发明中的一个较佳实施例中，可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一：来源于转运硫蛋白基因（MT1、MerA、MerB）（步骤3）。在本发明中的一个较佳实施例中，其特征在于：所述的植物为以下植物中的一种或多种：水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草。
在本发明中的一个较佳实施例中，其特征在于：所述通过微地形改造结合植物配置的方式，构建侵蚀区和沉积区的浅层15-25cm的底泥对Cd、Pb、Zn具有明显的富集作用。且污染河道和湖泊水体和底泥的重金属污染程度为中、轻度污染。本发明通过吸附效率高、抗-逆性强的转基因植物将水体中的富营养元素及重金属元素转移并固定到底泥中，底泥中的Cd， Pb和Zn含量从1.28±0.21, 112.65±3.85和687.52 ±56.78 mg/L下降至0.18±0.11, 56.65±1.85和265.52 ±21.78 mg/L。
本发明主要解决了中、轻度重金属污染河道和湖泊水体和底泥的修复问题，重点考察了转基因植物联合化学药剂法在修复中、轻度重金属污染河道和湖泊水体和底泥上的应用效果，主要的难点在于确定最优种植方案和最优药剂加入量使得修复效率达到最优。
本发明公开的转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
本发明旨在提高重金属以及水体中重金属铅、锌、镉的去除效率，改善水体的营养物质和污染物质的分布，综合运用转基因植物的富集作用，结合近自然的手法实现河道生态系统的恢复、景观美学价值的提升，既能够实现河道湖泊水质的净化，操作简单，施工成本低，具有明显景观生态效应。
附图说明
图1 水花生继代幼苗在第7、15、21天的生长情况；
图2 野生型水花生愈伤组织；
图3 构建的植物转化载体示意图；
图4 转基因水花生叶片在Kam培养基上诱导出的愈伤组织；
图5 愈伤组织长出再生芽；
图6 植物修复所用植株的重金属（Zn、Pb和Cd）积累量（mg/kg）；
图7 修复前后水中重金属（Zn、Pb和Cd）含量（mg/L）；
图8 修复前后底泥中重金属（Zn、Pb和Cd）含量（mg/kg）。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用试剂均有市售。其中德国爱氏特种化学品公司生产的PLEXON-2210，有市售。
实施例1
转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其中转基因植物的制备方法，按如下的步骤进行：
1.植物组织培养体系建立
取野生水花生植株，清水冲洗5-10min后，截取长出胚芽的较短茎段与带有腋芽的较短茎段。在无菌操作台上用75%的乙醇消毒1min,1%NaClO消毒8min后将消毒后的茎段用无菌水清洗6-7次,无菌滤纸上去除残余水分，之后分别置于愈伤组织诱导培养基（MS+2mg/L2,4D+1mg/L6BA+20mg/L蔗糖）与芽诱导培养基（1/2 MS+2mg/L6BA+ 0.1mg/LNAA +30mg/L蔗糖）培养基上培养,直至生长成愈伤组织及继代幼苗（如图1-2）。长出腋芽的茎段在无菌环境中无性繁殖后的产物作为组织培养的原始材料。
2.构建目标载体并转入植物：
（1）目标载体的构建：
Genebank中检索ZNT1基因序列（AF133267.1），委托南京一道生物科技有限公司化学合成ZnT1目的基因片段，将ZNT1基因（由申请人在GenBank上检索得到ZNT1 cds序列，经过生物公司化学合成ZNT1目的基因片段，然后经过PCR扩增得到），用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ进行酶切后，连接到用相同酶双酶切后的质粒表达载体即植物转化载体p3301-121上，并命名为p3301-121-Znt1质粒（其结构见图2），通过电转化法转入农杆菌菌株EHA105；
天蓝遏蓝菜Znt1基因序列如下：
ATGGCTTCATCTCCCACGAAAATCCTCTGTGATGCTGGCGAATCAGACCTCTGTCGAGACGATGCAGCTGCATTTCTACTCAAATTCGTAGCCATTGCATCAATCCTCCTAGCCGGAGCTGCAGGTGTAGCCATACCTCTCATCGGCAAGAACCGCCGGTTCCTTCAAACCGAAGGAAATCTCTTTGTAGCTGCTAAAGCCTTCGCAGCCGGTGTCATACTCGCCACTGGCTTCGTCCATATGCTTGCAGGCGGCACGGAAGCTCTGACCAATCCGTGCTTACCGGATTATCCGTGGTCTAAGTTTCCCTTTCCCGGCTTCTTTGCAATGGTGGCTGCTTTGATAACTCTGCTTGTGGATTTCATGGGGACACAGTACTATGAGAGTAAGCAACAGAGGAACGAGGTTGCTGGTGGTGGTGAAGCAGCTGTTGTTGAGGAGACATCATCTGTTCTTCCCGTGGTTGTGGAAAGAGGGAATGATAGCAAAGCCTTTGGTGAAGAAGACGGTGGAGGGATGCATATTGTTGGCATTCGTGCTCATGCAGCTCACCATAATCATAGTCACTCTAATGCTCATGGTACATTCGATGGACATGCTCATGGACAATCACACGGACATGTACATGTTCACGGGAGTCATGATGTCGAAAATGGAGCTAGGCATGTTGTTGTTTCTCAGATATTGGAGCTTGGGATTGTGTCACACTCAATCATCATCGGTTTATCCCTCGGTGTATCGCAGTCTCCGTGCACGATCAGGCCTCTCATTGCAGCTCTATCATTTCACCAGTTCTTCGAAGGGTTTGCGTTAGGAGGCTGCATCTCCCAAGCACAGTTTAAGAACAAATCAGCCATCATAATGGCTTGCTTCTTTGCCCTAACCGCACCGATTGGGATCGGGATTGGAACCGCGGTGGCCTCGTCTTTCAACTCGCATAGCCCTGGAGCTTTGGTCACTGAAGGGATACTAGACTCGCTCTCGGCTGGGATACTGACGTACATGGCTCTGGTGGACCTAATCGCAGCTGATTTTCTAAGCAAGAGGATGAGTTGTAATGTGAGGCTTCAAGTTGTGTCTTATGTCATGTTGTTCCTTGGAGCTGGACTTATGTCCGCACTCGCCATTTGGGCTTAG
（2）农杆菌叶盘转化法转入目的基因
受体材料选用：将由实验（4）培育得到的无菌植物叶片剪为1cm×1cm的小块，茎段纵向切为1cm的切断，置于愈伤组织培养基上进行预培养2-3d，切口开始膨大时准备进行侵染；平板上挑取实验（3）中YEB固体培养基上单菌落，接种至含有Kan+Rif的YEB液体培养液中，室温下180rpm震荡培养至OD600=0.2-0.5后准备用于转化。
植物组织培养基菌液共培养：将菌液置于20ml无菌离心管中，6000rpm离心10分钟后弃上清液，向离心管中加入MS培养液，震荡至沉淀消失。无菌操作台上将预处理后的植物叶片及茎段加入MS重悬液，倒置数次后静置，共培养20分钟。侵染后的外植体植株移至MS固体培养基中培养2-3d后移至含有Kan（50mg/L）+Rif（200mg/L）的愈伤组织培养基中。
（3）水花生愈伤的筛选与再生
将上一步培养后的植物外植体移至MS+20mg/L蔗糖+400mg/L羧苄霉素的液体培养基中进行冲洗，冲洗5-10min后，使用无菌水冲洗3-4次，并用无菌滤纸吸干残余水分。将清洗后的外植体移至MS+2mg/L2,4D+1mg/L6BA+400mg/L羧苄霉素（Crb）+4mg/L草铵膦（ppt）的固体培养基中，进行愈伤组织的诱导（如附图4-5），待形成2-3cm的抗性小芽后，将再生芽移至生根培养基诱发生根，留用。
实施例2
转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，具体技术方案如下：
1.水体及污泥中营养物质和重金属元素的转移
利用转基因植物水花生对水体进行修复，其中，可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一：ZNT1基因，转基因植物为以下植物中的一种或多种：水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草。以水花生为例，最优初始生物量为2.6±0.05 g/m3。
2.通过微地形改造结合植物配置的方式
划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，控制水流速度（0.05-0.1m/s）。针对侵蚀区和沉积区的浅层15-25cm的底泥，添加重金属耐受植物降低沉积区淤泥中营养物质及重金属物质含量，根据植物在不同重金属元素影响下的生长状况，测定相关的生理性状指标，并分析重金属在植物不同部位的积累情况，从而判断各植物对重金属的耐性程度。
人为养护
随着沉积区的沉积物中的淤泥不断增加，需要人为养护，保证植物正常生长，本实施例中按照每2周一次的频率，进行从而达到转移河道湖泊系统中污染物，实现净化水体的目的。
实验效果：所选污染水体为天津市潮白河流域的某段受重金属污染河道，监测水体的pH为6.4，呈弱酸性，河流流动缓慢；重金属含量 Cd 的含量为39.41μg/L，Zn的含量为425.42。Cd、Zn 含量均低于国家2级标准值，达到II类水质标准，污染河道和湖泊水体和底泥的重金属污染程度为中、轻度污染。底泥中重金属含量为Zn、Pb和Cd的积累量分别为92.69 mg/kg、102.57 mg/kg、58.66 mg/kg，是水体重金属修复的优势物种，能够有效实现了重金属的固定（图3）。
实施例3
一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法：
1.挑选出生长基本一致的转基因植株，以转基因Znt1水花生为例（高20 cm左右），用蒸馏水洗净根部泥土，将植物移入含污染水体的黑色小桶中，每桶3株，小桶规格为2 L，每桶含纯净水1.8 L（分析纯）。预培养10天后，将转基因植物分别进行不同梯度的重金属处理实验，Pb2+、Zn2+、Cd2+供源来自分析纯 Pb(NO3)2、Zn SO4∙7H2O和CdCl2∙2.5H2O，以不投加重金属的处理为对照（CK1），每个处理设3次重复（图1）。处理2周后收获植物。将植株剪短、洗净、45℃烘干后，取0.2 g植物根系、茎和叶片样本，加入10 ml 的HCl-HNO3-HF进行消化处理，然后利用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测试植物体内重金属元素（铅、锌、镉）含量。修复结束后，利用微孔过滤膜（0.45μm）对水体进行过滤处理。随后，利用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测试水中重金属元素（铅、锌、镉）含量（图2）。
2.根据（1）的实验结果，确定转基因植物的最大耐受浓度（ug/L）。然后，挑选出生长基本一致的转基因植株，在固定浓度下进行预培养（10天）。然后投加不同比例的化学修复药剂（PLEXON-2210），以不投加药剂的处理为对照（CK2），每个处理设3次重复（图3）。处理2周后收获植物。将植株剪短、洗净、45℃烘干后，取0.2 g植物根系、茎和叶片样本，加入10ml 的HCl-HNO3-HF进行消化处理，然后利用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测试植物体内重金属元素（铅、锌、镉）含量。修复结束后，利用微孔过滤膜（0.45μm）对水体进行过滤处理。随后，利用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测试水中重金属元素（铅、锌、镉）含量。
3.水体和植物体内元素分析结果显示，药剂（PLEXON-2210）试剂处理效果较好，随着试剂增加，污染物检出浓度有所降低。与单独加入药剂）相比，利用转基因植物修复结合药剂修复，在不同污染物浓度梯度下，转基因植物修复结合药剂修复方案均优于单独加药系统，其吸附效率提高10%-15%。现场生产性试验结果显示，添加药剂（PLEXON-2210，投加量为2.5±0.02 mg/m3）时修复效果最好。此时，底泥中的Zn离子浓度从480.21mg/kg下降至234.52mg/kg，Pb离子浓度从540mg/kg下降至247.82 mg/kg，Cd离子浓度从0.5mg/kg下降至0.23mg/kg (图2)。水体中的Zn离子浓度从0.20 mg/L下降至0.12 mg/L，Pb离子浓度从0.21mg/L下降至0.13 mg/L，Cd离子浓度从0.05 mg/L下降至0.03 mg/L（图3）。
本发明设计并应用了一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，综合运用转基因植物的生物富集作用和药剂的钝化作用，结合河道修复工程实际案例进行规划设计，不仅能够实现水体净化，满足生态修复的相关要求。同时，改善了河道的生态环境，有效的降低了重金属（Zn、Pb和Cd）浓度，该发明不仅能够修复了河道景观，实现河流自我调节功能，同时，在城市生态环境维护和改善方面起到重要作用。
序列表
<110> 中国科学院地理科学与资源研究所
<120> 一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggcttcat ctcccacgaa aatcctctgt gatgctggcg aatcagacct ctgtcgagac 60
gatgcagctg catttctact caaattcgta gccattgcat caatcctcct agccggagct 120
gcaggtgtag ccatacctct catcggcaag aaccgccggt tccttcaaac cgaaggaaat 180
ctctttgtag ctgctaaagc cttcgcagcc ggtgtcatac tcgccactgg cttcgtccat 240
atgcttgcag gcggcacgga agctctgacc aatccgtgct taccggatta tccgtggtct 300
aagtttccct ttcccggctt ctttgcaatg gtggctgctt tgataactct gcttgtggat 360
ttcatgggga cacagtacta tgagagtaag caacagagga acgaggttgc tggtggtggt 420
gaagcagctg ttgttgagga gacatcatct gttcttcccg tggttgtgga aagagggaat 480
gatagcaaag cctttggtga agaagacggt ggagggatgc atattgttgg cattcgtgct 540
catgcagctc accataatca tagtcactct aatgctcatg gtacattcga tggacatgct 600
catggacaat cacacggaca tgtacatgtt cacgggagtc atgatgtcga aaatggagct 660
aggcatgttg ttgtttctca gatattggag cttgggattg tgtcacactc aatcatcatc 720
ggtttatccc tcggtgtatc gcagtctccg tgcacgatca ggcctctcat tgcagctcta 780
tcatttcacc agttcttcga agggtttgcg ttaggaggct gcatctccca agcacagttt 840
aagaacaaat cagccatcat aatggcttgc ttctttgccc taaccgcacc gattgggatc 900
gggattggaa ccgcggtggc ctcgtctttc aactcgcata gccctggagc tttggtcact 960
gaagggatac tagactcgct ctcggctggg atactgacgt acatggctct ggtggaccta 1020
atcgcagctg attttctaag caagaggatg agttgtaatg tgaggcttca agttgtgtct 1080
tatgtcatgt tgttccttgg agctggactt atgtccgcac tcgccatttg ggcttag 1137

Claims (8)

1.一种转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）通过吸附效率高、抗逆性强的转基因植物将水体中的富营养元素及重金属元素转移并固定到底泥中；所述的植物为以下植物中的一种或多种：水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草；可增强植物重金属污染效率的外源基因和可提高多种金属耐受力和积累量的外源基因为以下基因之一：来源于转运硫蛋白MT1、MerA、MerB基因；
（2）通过微地形改造结合植物配置的方式，划分污染河段和湖泊地貌景观，人为构建侵蚀区和沉积区，控制水流速度；添加药剂降低沉积区淤泥中营养物质及重金属物质含量，构建植物生长的初始条件，用来种植转基因植物；所述的药剂指的PLEXON-2210，投加量为2.5±0.02mg/m3；
（3）随着转基因植物的生长，沉积区沉积物中的淤泥不断增加，人为加以清理，保证转基因植物正常生长。
2.权利要求1所述转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其中转基因植物的制备方法，按如下的步骤进行：
（1）构建植物表达载体
（a）根据NCBI数据库查询Znt1序列，由南京一道生物科技有限公司化学合成Znt1基因片段，将含有表达载体p3301-121-Znt1的大肠杆菌液划线培养至含卡那霉素（Kan）的LB（Luria-Bertani）培养基中，37℃下过夜培养至OD600=0.4-0.6；
（b）使用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒法提取大肠杆菌液中的扩繁载体，收集过夜培养的目标大肠杆菌菌液（DH5α），对目标菌体进行重悬、裂解、中和操作之后，向吸附柱中央加入65℃的Elution Buffer，在13000rpm下离心1分钟后静置，将收集的目标载体存于-40℃冰箱；
（c）将含有目的基因的植物表达载体p3301-121-Znt1导入农杆菌EHA105中，获得用于植物遗传转化的工程菌；首先制备感受态农杆菌，并保存于-80℃冰箱；将纯化后质粒DNA加入解冻后的农杆菌液，将混合物在2.5kV、25uF条件下进行脉冲电转化，重悬细胞震荡培养后涂布于含有卡那霉素（Kan）+利福平（Rif）的YEB培养基；
（2）构建转基因植株
（a）受体材料预培养：将无菌植物叶片剪为1cm×1cm的小块，茎段纵向切为1cm的切断，置于愈伤组织培养基上进行预培养2-3d，切口开始膨大时进行侵染、
（b）农杆菌液预培养：平板上挑取单菌落接种至含有Kan+Rif的YEB液体培养液中，室温下180rpm震荡培养至OD600=0.2-0.5后即可用于转化、
（c）将菌液置于20ml无菌离心管中，6000rpm离心10分钟后弃上清液，向离心管中加入MS培养液，震荡至沉淀消失，无菌操作台上将预处理后的植物叶片及茎段加入MS重悬液，倒置数次后静置，共培养20分钟，侵染后的外植体植株移至MS固体培养基中培养2-3d后移至含有Kan+Rif的愈伤组织培养基中。
3.权利要求2所述转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其中的植物为以下植物中的一种或多种：水花生、芦苇、菖蒲、水葫芦、金鱼藻、美人蕉、凤眼莲、黑藻、苦草、水芹和灯心草。
4.权利要求2所述转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其中所述的YEB培养基是酵母提取物 6g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、MgSO40.4938g/L、pH=7.2，固体培养基含琼脂15g。
5.权利要求2所述转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法，其中所述的愈伤组织培养基是MS+2,4D（2mg/L）+6BA（1mg/L）+Kan（50mg/L）+Rif（200mg/L）。
6.权利要求1所述的修复方法，其特征在于：所述构建侵蚀区和沉积区的浅层15-25cm对有机C、N、P、Cd、Pb、Ni呈富集作用。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于：污染河道和湖泊水体和底泥的重金属污染程度为中、轻度污染。
8.权利要求1所述的转基因植物强化河道湖泊污染水体原位修复的方法在提高重金属去除率方面的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283845A (zh) * 2019-07-29 2019-09-27 中国科学院地理科学与资源研究所 一种转基因植物复合体系应用于污染土壤的植物修复方法
CN112553360A (zh) * 2020-11-17 2021-03-26 上海太和水环境科技发展股份有限公司 苦草鉴定相关snp标记及其用途
CN115010265A (zh) * 2022-07-01 2022-09-06 成都理工大学 一种利用植物及其附着生物膜去除水体中抗生素及抗性基因的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101310882A (zh) * 2007-05-25 2008-11-26 青岛科技大学 一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法
US20140213455A1 (en) * 2011-05-09 2014-07-31 Paul Brian Larsen Method and compositions to promote plant growth in metal contaminated environments
CN105750311A (zh) * 2016-03-23 2016-07-13 河北省农林科学院农业资源环境研究所 一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法
CN106477727A (zh) * 2016-11-04 2017-03-08 南大（常熟）研究院有限公司 一种河道基底修复的方法
CN109943571A (zh) * 2019-04-11 2019-06-28 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 一种金属硫蛋白基因mt20、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101310882A (zh) * 2007-05-25 2008-11-26 青岛科技大学 一种利用转基因植物修复重金属和有机物复合污染土壤的方法
US20140213455A1 (en) * 2011-05-09 2014-07-31 Paul Brian Larsen Method and compositions to promote plant growth in metal contaminated environments
CN105750311A (zh) * 2016-03-23 2016-07-13 河北省农林科学院农业资源环境研究所 一种铅镉复合污染土壤综合生物修复方法
CN106477727A (zh) * 2016-11-04 2017-03-08 南大（常熟）研究院有限公司 一种河道基底修复的方法
CN109943571A (zh) * 2019-04-11 2019-06-28 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 一种金属硫蛋白基因mt20、其编码得到的金属硫蛋白及其表达和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
史宇等: ""重金属污染环境的植物修复及其分子机制"", 《植物生理与分子生物学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283845A (zh) * 2019-07-29 2019-09-27 中国科学院地理科学与资源研究所 一种转基因植物复合体系应用于污染土壤的植物修复方法
CN112553360A (zh) * 2020-11-17 2021-03-26 上海太和水环境科技发展股份有限公司 苦草鉴定相关snp标记及其用途
CN115010265A (zh) * 2022-07-01 2022-09-06 成都理工大学 一种利用植物及其附着生物膜去除水体中抗生素及抗性基因的方法
CN115010265B (zh) * 2022-07-01 2023-10-24 成都理工大学 一种利用植物及其附着生物膜去除水体中抗生素及抗性基因的方法

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