CN107931326A - 基于丁香假单胞杆菌的植物重金属富集促进剂制作方法 - Google Patents

基于丁香假单胞杆菌的植物重金属富集促进剂制作方法 Download PDF

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CN107931326A CN201711117692.8A CN201711117692A CN107931326A CN 107931326 A CN107931326 A CN 107931326A CN 201711117692 A CN201711117692 A CN 201711117692A CN 107931326 A CN107931326 A CN 107931326A
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欧晓彬
燕晓娟
张文杰
王东
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    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
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    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明涉及基于丁香假单胞杆菌的植物重金属富集促进剂制作方法，其特征在于，所述植物重金属富集促进剂包含：丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)、亚硫酸氢钾和表面活性剂。并在番茄和烟草上进行了初步试验。结果表明：（1）本制剂能够显著促进植物对重金属镉（Cd）、铅（Pb）及铜（Cu）的富集作用，在测试植株中可使其富集能力至少提高2倍以上；（2）本制剂能够显著促进番茄体内与重金属转运相关蛋白基因：LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1表达提高。综上，本发明所提供一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，是一种高效的促进植物富集重金属的新制剂，并具有广阔的应用前景。

Description

基于丁香假单胞杆菌的植物重金属富集促进剂制作方法
技术领域
本发明涉及基于丁香假单胞杆菌的植物重金属富集促进剂制作方法，属于生物技术领域。
背景技术
重金属污染是全球主要环境危害之一，并可能通过农作物进入人类食物链，严重威胁着人类的生命和健康。植物修复是一种环境友好、廉价的重金属污染治理方法，但修复效果尚不理想，推广应用难度大。富集效果是制约重金属污染植物修复的关键因素。虽然超富集植物的重要性和广阔的应用前景正逐渐被更多的人士所认同，但当前在大范围的生产实践中发挥其修复土壤污染的作用仍受到一定限制。主要是由于超富集植物是在重金属胁迫环境下长期诱导、驯化的一种适应性突变体，往往生长缓慢、生物量低、干物质积累少，在单位时间内所能吸收的重金属量，被限制在一个低水平上，直接限制了修复效果。因此，促进植物提高富集重金属效率的技术研究成为当前研究的热点，并具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，是一种高效的，适宜大规模应用的促进植物富集重金属的新制剂。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，在一个方面，本发明提供的基于丁香假单胞杆菌的植物重金属富集促进剂，包含丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)、亚硫酸氢钾和表面活性剂。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：所述植物重金属富集促进剂可以包含1010-1012 CFU/L的丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)、1~5 g/L的亚硫酸氢钾和100～500 ppm表面活性剂。此外所述植物重金属富集促进剂还可以包含水。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：所述植物重金属富集促进剂还包含水。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：丁香假单胞杆菌可以为丁香假单胞番茄叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato，PstDC3000)。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：表面活性剂用于促进丁香假单胞杆菌侵染植物，可以为选自Silwet L-77和 Tween-80中的至少一种。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：所述植物为番茄或烟草。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：亚硫酸氢钾的作用是打开植物的气孔，起到气孔开启剂的作用，从而有利于丁香假单胞杆菌的摄入。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：所述植物为番茄或烟草，优选的是，基于1L所述植物重金属富集促进剂，其包含丁香假单胞杆菌1010-1012 CFU，亚硫酸氢钾2 g，Tween-80 200 μL，水1 L。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂的制备：（1）丁香假单胞杆菌的制备，Pst DC3000菌株培养基均为低盐LB培养基；配方：每升培养基中包含：蛋白胨 10 g；酵母浸出粉 5 g；氯化钠5 g；将-80 ℃贮存的DC3000菌株从超低温冰箱中取出，划线到含适量抗生素的的低盐LB固体培养基上，28 ℃培养36-48 h；挑取单菌落，接种至10 ml种子管中，在恒温摇床上28 ℃，120 rpm培养约10 h；按照1：100的比例将新鲜的培养物接种到含有适量抗生素的低盐LB液体培养基中，继续在恒温摇床上28 ℃，120 rpm过夜培养至OD600≈0.8；将终产物转入离心管，1500 g离心20 min，弃上清，将沉淀的菌体用无菌水重新溶解，最终稀释至1010 CFU/L备用；（2）在1010 CFU/L的菌悬液中加入亚硫酸氢钾和Tween-80，其终浓度分别为丁香假单胞杆菌1010 CFU/L，亚硫酸氢钾：2 g/L，Tween-80：200 ppm。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试土壤:采自甘肃省庆阳市郊区未受污染的麦田表层土壤（0-20 cm）：有机质含量为10.58 g·kg−1，全氮0.82 g·kg−1，碱解氮52.45 mg·kg−1，全磷0.659 g·kg−1，速效磷11.24 mg·kg−1，速效钾152.88 mg·kg−1，总镉：0.039 mg.kg-1；参照我国《土壤环境质量标准，1995》，本实施例共设2个镉水平， Cdl (1 mg/kg土壤)和Cd3 ( 3 mg/kg土壤)，分别模拟农田土壤轻、中度镉污染，并通过人为添加3CdSO4.8H2O溶液而实现的；各个镉水平充分搅拌混匀的土壤20kg，分别装入塑料周转箱中，周转箱的尺寸是42 cm (长) X 32 cm (宽) X 16 cm (高)；为了稳定土壤的各种吸附平衡特性，土壤加水保持田间持水量的60%，自然条件下平衡1个月后备用。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试植物：番茄（品种名：霞光），播种前用55 ℃热水烫种进行种子消毒，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8 株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜，整个试验期间没有添加任何肥料；随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：植株移栽至周转箱2个月后，收获。土壤中镉的残留量，采用火焰原子吸收光谱法测定[flame atomicabsorption spectroscopy (FAAS)] ( Shimadzu，AA6650，日本 )。结果表明，施用本发明植物重金属富集促进剂，在Cd1和Cd3两种污染水平上均能显著提高番茄植株富集重金属镉的能力，其提取能力较对照分别提高2.6倍和2.3倍，且差异极显著（p <0.001），结果见附图1。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试植物：烟草（品种名：云烟-87），烟草种子播种前用3% H2O2浸泡10分钟,然后用自来水冲洗3次，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8 株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜，整个试验期间没有添加任何肥料。随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：植株移栽至周转箱2个月后，收获。土壤中镉的残留量，采用火焰原子吸收光谱法测定[flame atomicabsorption spectroscopy (FAAS)] ( Shimadzu, AA6650，Japan )。结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂，在Cd1和Cd3两种污染水平上均能显著提高烟草植株富集重金属镉的能力，其提取能力较对照分别提高6.6倍和3.1倍，且差异极显著（p <0.001），结果见附图2。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试土壤:采自甘肃省庆阳市宁县长庆桥镇受污染的表层土壤（0-20 cm）。经检测，土壤中总铜（Cu）含量154.3士20.3 mg/Kg；总镉（Cd）含量3.1±0.23 mg/Kg；总铅（Pb）含量272.2±15.9 mg/Kg；土壤中可交换态金属的含量：铜(Cu) 4.6±1.07 mg/Kg；镉 (Cd) 0.31士0.02 mg/Kg；铅(Pb) 2.6士0.76 mg/Kg，土壤20 kg，分别装入塑料周转箱中，周转箱的尺寸是42 cm(长) X 32 cm (宽) X 16 cm (高)。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试植物：番茄（品种名：霞光）。播种前用55℃热水烫种进行种子消毒，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜，整个试验期间没有添加任何肥料。随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：植株移栽至周转箱2个月后，收获。植物体内的重金属含量采用等离子质谱仪[Inductively coupledplasma mass spectrometry (ICP-MS ) ] ( Agilent G3271A，日本)测定；结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂，能显著提高烟草植株富集重金属铅、镉和铜的能力，使其在植株体内的含量提高2倍以上，尤其是根部，且差异均极显著（p <0.001），结果见图4。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：叶面喷施细菌或水（作对照）24小时后，取根作为试验材料，利用Qiagen RNA提取试剂盒（QiagenRNAeasy Kit，德国）提取总RNA，随后利用Promega反转录试剂盒（GoScript™ ReverseTranscription Syste，美国）反转录成cDNA，采用荧光定量PCR法[qPCR]（RocheLightCycler 480，美国）
，以番茄肌动蛋白基因ACT 作内参，检测植物重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1相对表达情况。相关引物如下：LeNRAMP1：5`-ggccaatttatcatgcaaggatttc-3 `和5`-ttgtggcaatggaatatcagcaagat-3`。LeNRAMP3：5`-tgttggcggatagattactcgagg-3` 和5`-ggtaattccccgtgaaatgaggtatac-3`。LeIRT1：5`-gcactttgctttcatcaaatgtttg-3` 和 5`-ttgcaactcccaataggtcatgaag-3`。ACT:5`-cggtgaccactttccgatct-3`和5`-tcctcaccgtcagccatttt-3`。结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂后，番茄根系中植物重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1的表达均提高，结果见图3。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：丁香假单胞杆菌在促进植物富集重金属中的应用。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：丁香假单胞杆菌在制备植物重金属富集促进剂中的应用。
所述的是一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：在优选的实施方式中，本发明使用的丁香假单胞杆菌为丁香假单胞番茄叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000)，来自英国国家植物致病性细菌培养中心，编号为NCPPB 1106，其对于本领域技术人员而言是可以获得的。
本发明的作用机理是：丁香假单胞番茄叶斑病菌侵染宿主植物后，促进植株内部重金属转运相关蛋白基因(例如LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1)表达提高，提高宿主植物富集重金属能力。
本发明的又一目的在于提供丁香假单胞杆菌在促进植物富集重金属中的应用，或者提供丁香假单胞杆菌在制备植物重金属富集促进剂中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种利用丁香假单胞杆菌促进植物富集重金属的方法在重金污染治理中的应用。本发明基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂的使用方法为：将制备的植物重金属富集促进剂均匀喷施到植物叶面，然后覆盖上农膜直至收获。
本发明试验表明，丁香假单胞杆菌侵染宿主植物后可以诱导植株内部与重金属转运相关蛋白基因(例如LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1)大量表达，提高植物富集重金属的能力，在测试的植物中可使其富集能力至少提高2倍以上。
本发明的创新及有益之处：基于自然界植物对病害的应激反应原理，以丁香假单胞杆菌为核心，以原材料易得的气孔开启剂如亚硫酸氢钾、表面活性剂如Tween-80等为复配剂，具有投入低，效益高，操作技术简单等优点。
附图说明
图 1是实施例2中番茄叶面喷水（作对照）和本发明基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，7天后重金属提取量变化情况（注：***代表P＜0.001）。
图 2是实施例3中烟草叶面喷水（作对照）和本发明基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，7天后重金属提取量变化情况（注：***代表P＜0.001）。
图3是定量PCR检测番茄中重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1相对表达情况（注：表达量提升2倍及以上，认为基因表达提高）。
图4是植株移栽至周转箱2个月后，收获。植物体内的重金属含量采用等离子质谱仪[Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS ) ] ( Agilent G3271A,日本)测定情况。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1，基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂的制备：（1）丁香假单胞杆菌的制备，Pst DC3000菌株培养基均为低盐LB培养基（配方：每升培养基中包含：蛋白胨 10g；酵母浸出粉 5 g；氯化钠 5 g）。将-80 ℃贮存的DC3000菌株从超低温冰箱中取出，划线到含适量抗生素的的低盐LB固体培养基上，28 ℃培养36-48 h。挑取单菌落，接种至10 ml种子管中，在恒温摇床上28 ℃，120 rpm培养约10 h。按照1：100的比例将新鲜的培养物接种到含有适量抗生素的低盐LB液体培养基中，继续在恒温摇床上28 ℃，120 rpm过夜培养至OD600≈0.8。将终产物转入离心管，1500 g离心20 min，弃上清，将沉淀的菌体用无菌水重新溶解，最终稀释至1010 CFU/L备用。（2）在1010 CFU/L的菌悬液中加入亚硫酸氢钾和Tween-80，其终浓度分别为丁香假单胞杆菌1010 CFU/L，亚硫酸氢钾:2 g/L，Tween-80: 200ppm。
实施例2，供试土壤: 采自甘肃省庆阳市郊区未受污染的麦田表层土壤（0-20cm）：有机质含量为10.58 g·kg−1，全氮0.82 g·kg−1，碱解氮52.45 mg·kg−1，全磷0.659g·kg−1，速效磷11.24 mg·kg−1，速效钾152.88 mg·kg−1，总镉：0.039 mg.kg-1。参照我国《土壤环境质量标准，1995》，本实施例共设2个镉水平，Cdl (1 mg/kg土壤)和Cd3 ( 3 mg/kg土壤)，分别模拟农田土壤轻、中度镉污染,并通过人为添加3CdSO4.8H2O溶液而实现的。各个镉水平充分搅拌混匀的土壤20 kg，分别装入塑料周转箱中，周转箱的尺寸是42 cm (长)X 32 cm (宽) X 16 cm (高)。为了稳定土壤的各种吸附平衡特性，土壤加水保持田间持水量的60%，自然条件下平衡1个月后备用。
供试植物：番茄（品种名：霞光）。播种前用55 ℃热水烫种进行种子消毒，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8 株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜,整个试验期间没有添加任何肥料。随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
植株移栽至周转箱2个月后，收获。土壤中镉的残留量，采用火焰原子吸收光谱法测定[flame atomic absorption spectroscopy (FAAS)] ( Shimadzu，AA6650，日本 )。结果表明，施用本发明植物重金属富集促进剂，在Cd1和Cd3两种污染水平上均能显著提高番茄植株富集重金属镉的能力，其提取能力较对照分别提高2.6倍和2.3倍，且差异极显著（p<0.001），结果见附图1。
实施例3，供试土壤同实施例2。
供试植物：烟草（品种名：云烟-87），烟草种子播种前用3% H2O2浸泡10分钟,然后用自来水冲洗3次，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8 株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜,整个试验期间没有添加任何肥料。随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
植株移栽至周转箱2个月后，收获。土壤中镉的残留量，采用火焰原子吸收光谱法测定[flame atomic absorption spectroscopy (FAAS)] ( Shimadzu, AA6650, Japan)。结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂，在Cd1和Cd3两种污染水平上均能显著提高烟草植株富集重金属镉的能力，其提取能力较对照分别提高6.6倍和3.1倍，且差异极显著（p <0.001），结果见附图2。
实施例4，供试土壤: 采自甘肃省庆阳市宁县长庆桥镇受污染的表层土壤（0-20cm）。经检测，土壤中总铜（Cu）含量154.3士20.3 mg/Kg；总镉（Cd）含量3.1±0.23 mg/Kg；总铅（Pb）含量272.2±15.9 mg/Kg。土壤中可交换态金属的含量：铜(Cu) 4.6±1.07 mg/Kg；镉 (Cd) 0.31士0.02 mg/Kg；铅(Pb)2.6士0.76 mg/Kg。土壤20 kg，分别装入塑料周转箱中，周转箱的尺寸是42 cm (长) X 32 cm (宽) X 16 cm (高)。
供试植物：番茄（品种名：霞光）。播种前用55℃热水烫种进行种子消毒，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜,整个试验期间没有添加任何肥料。随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
植株移栽至周转箱2个月后，收获。植物体内的重金属含量采用等离子质谱仪[Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS ) ] ( Agilent G3271A,日本)测定。结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂，能显著提高烟草植株富集重金属铅、镉和铜的能力，使其在植株体内的含量提高2倍以上，尤其是根部，且差异均极显著（p <0.001），结果见图4。
实施例5，供试土壤同实施例4。
供试植物及栽培同实施例4。
叶面喷施细菌或水（作对照）24小时后，取根作为试验材料，利用Qiagen RNA提取试剂盒（Qiagen RNAeasy Kit，德国）提取总RNA，随后利用Promega反转录试剂盒（GoScript™ Reverse Transcription Syste，美国）反转录成cDNA，采用荧光定量PCR法[qPCR]（Roche LightCycler 480,美国）以番茄肌动蛋白基因ACT 作内参，检测植物重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1相对表达情况。相关引物如下：LeNRAMP1：5`-ggccaatttatcatgcaaggatttc-3 `和5`-ttgtggcaatggaatatcagcaagat-3`。
LeNRAMP3：5`-tgttggcggatagattactcgagg-3` 和5`-ggtaattccccgtgaaatgaggtatac-3`。
LeIRT1：5`-gcactttgctttcatcaaatgtttg-3` 和 5`-ttgcaactcccaataggtcatgaag-3`。
ACT:5`-cggtgaccactttccgatct-3`和5`-tcctcaccgtcagccatttt-3`
结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂后，番茄根系中植物重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1的表达均提高，结果见图3。

Claims (10)

1.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：所述植物为番茄或烟草，优选的是，基于1L所述植物重金属富集促进剂，其包含丁香假单胞杆菌1010-1012 CFU/ml，亚硫酸氢钾2 g，Tween-80 200 μL，水1 L。
2.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂的制备：（1）丁香假单胞杆菌的制备，Pst DC3000菌株培养基均为低盐LB培养基；配方：每升培养基中包含：蛋白胨 10 g；酵母浸出粉 5 g；氯化钠 5 g；将-80℃贮存的DC3000菌株从超低温冰箱中取出，划线到含适量抗生素的的低盐LB固体培养基上，28 ℃培养36-48 h；挑取单菌落，接种至10 ml种子管中，在恒温摇床上28 ℃，120 rpm培养约10 h；按照1：100的比例将新鲜的培养物接种到含有适量抗生素的低盐LB液体培养基中，继续在恒温摇床上28 ℃，120 rpm过夜培养至OD600≈0.8；将终产物转入离心管，1500 g离心20 min，弃上清，将沉淀的菌体用无菌水重新溶解，最终稀释至1010 CFU/L备用；（2）在1010 CFU/L的菌悬液中加入亚硫酸氢钾和Tween-80，其终浓度分别为丁香假单胞杆菌1010 CFU/L，亚硫酸氢钾:2 g/L，Tween-80: 200 ppm。
3.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试土壤: 采自甘肃省庆阳市郊区未受污染的麦田表层土壤（0-20 cm）：有机质含量为10.58 g·kg−1，全氮0.82g·kg−1，碱解氮52.45 mg·kg−1，全磷0.659 g·kg−1，速效磷11.24 mg·kg−1，速效钾152.88mg·kg−1，总镉：0.039 mg.kg-1；参照我国《土壤环境质量标准,1995》，本实施例共设2个镉水平，Cdl (1 mg/kg土壤)和Cd3 ( 3 mg/kg土壤)，分别模拟农田土壤轻、中度镉污染,并通过人为添加3CdSO4.8H2O溶液而实现的；各个镉水平充分搅拌混匀的土壤20 kg，分别装入塑料周转箱中，周转箱的尺寸是42 cm (长) X 32 cm (宽) X 16 cm (高)；为了稳定土壤的各种吸附平衡特性，土壤加水保持田间持水量的60%，自然条件下平衡1个月后备用。
4.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试植物：番茄（品种名：霞光），播种前用55 ℃热水烫种进行种子消毒，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8 株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜，整个试验期间没有添加任何肥料；随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
5.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：植株移栽至周转箱2个月后，收获。
6.土壤中镉的残留量，采用火焰原子吸收光谱法测定[flame atomic absorptionspectroscopy (FAAS)] ( Shimadzu，AA6650，日本 )；结果表明，施用本发明植物重金属富集促进剂，在Cd1和Cd3两种污染水平上均能显著提高番茄植株富集重金属镉的能力，其提取能力较对照分别提高2.6倍和2.3倍，且差异极显著（p <0.001），结果见附图1。
7.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试植物：烟草（品种名：云烟-87），烟草种子播种前用3% H2O2浸泡10分钟，然后用自来水冲洗3次，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8 株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜，整个试验期间没有添加任何肥料；随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
8.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：植株移栽至周转箱2个月后，收获；土壤中镉的残留量，采用火焰原子吸收光谱法测定[flame atomic absorptionspectroscopy (FAAS)] ( Shimadzu, AA6650，Japan )；结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂，在Cd1和Cd3两种污染水平上均能显著提高烟草植株富集重金属镉的能力，其提取能力较对照分别提高6.6倍和3.1倍，且差异极显著（p <0.001），结果见附图2。
9.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：供试土壤: 采自甘肃省庆阳市宁县长庆桥镇受污染的表层土壤（0-20 cm）；经检测，土壤中总铜（Cu）含量154.3士20.3 mg/Kg；总镉（Cd）含量3.1±0.23 mg/Kg；总铅（Pb）含量272.2±15.9 mg/Kg；土壤中可交换态金属的含量：铜(Cu) 4.6±1.07 mg/Kg；镉 (Cd) 0.31士0.02 mg/Kg；铅(Pb) 2.6士0.76 mg/Kg，土壤20 kg，分别装入塑料周转箱中，周转箱的尺寸是42 cm (长) X 32 cm(宽) X 16 cm (高)；供试植物：番茄（品种名：霞光）；播种前用55℃热水烫种进行种子消毒，在温室大棚内进行育苗，1个月后，将幼苗移栽至周转箱中（8株/箱），每天浇水保持土壤水分适宜，整个试验期间没有添加任何肥料；随机分组，在收获前1周，分别在叶面在喷水（作对照）或实施例1中所制备植物重金属富集促进剂(喷菌)，然后覆盖上农膜，保持环境相对湿度 RH≥80%，直至收获。
10.一种基于丁香假单胞杆菌植物重金属富集促进剂，其特征是：植株移栽至周转箱2个月后，收获；植物体内的重金属含量采用等离子质谱仪[Inductively coupled plasmamass spectrometry (ICP-MS ) ] ( Agilent G3271A，日本)测定；结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂，能显著提高烟草植株富集重金属铅、镉和铜的能力，使其在植株体内的含量提高2倍以上，尤其是根部，且差异均极显著（p <0.001），结果见图4；其特征是：叶面喷施细菌或水（作对照）24小时后，取根作为试验材料，利用Qiagen RNA提取试剂盒（Qiagen RNAeasy Kit，德国）提取总RNA，随后利用Promega反转录试剂盒（GoScript™Reverse Transcription Syste，美国）反转录成cDNA，采用荧光定量PCR法[qPCR]（RocheLightCycler 480，美国），以番茄肌动蛋白基因ACT 作内参，检测植物重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1相对表达情况；相关引物如下：LeNRAMP1：5`-ggccaatttatcatgcaaggatttc-3 `和5`-ttgtggcaatggaatatcagcaagat-3`；LeNRAMP3：5`-tgttggcggatagattactcgagg-3` 和5`-ggtaattccccgtgaaatgaggtatac-3`；LeIRT1：5`-gcactttgctttcatcaaatgtttg-3` 和 5`-ttgcaactcccaataggtcatgaag-3`；结果表明，施用本发明的植物重金属富集促进剂后，番茄根系中植物重金属转运相关蛋白基因LeNRAMP1，LeNRAMP3和LeIRT1的表达均提高，结果见图3。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109570214A (zh) * 2019-01-23 2019-04-05 侯萍 一种土壤修复方法
CN115382901A (zh) * 2022-09-06 2022-11-25 生态环境部南京环境科学研究所 一种利用植物-微生物联合的镉污染土壤修复方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676440A (zh) * 2012-06-26 2012-09-19 四川大学 一种重金属抗性菌在强化蕈菌富集土壤重金属上的应用及制剂
CN103350105A (zh) * 2013-06-26 2013-10-16 深圳清华大学研究院 一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法及其应用
CN104871850A (zh) * 2015-06-12 2015-09-02 上海交通大学 促进重金属污染植物修复效率的方法
CN107085077A (zh) * 2017-05-06 2017-08-22 申洪涛 重金属在烟叶不同部位富集分布的研究方法
CN107236546A (zh) * 2017-06-23 2017-10-10 河北麦森钛白粉有限公司 与植物和/或微生物联用的土壤修复促进剂的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676440A (zh) * 2012-06-26 2012-09-19 四川大学 一种重金属抗性菌在强化蕈菌富集土壤重金属上的应用及制剂
CN103350105A (zh) * 2013-06-26 2013-10-16 深圳清华大学研究院 一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法及其应用
CN104871850A (zh) * 2015-06-12 2015-09-02 上海交通大学 促进重金属污染植物修复效率的方法
CN107085077A (zh) * 2017-05-06 2017-08-22 申洪涛 重金属在烟叶不同部位富集分布的研究方法
CN107236546A (zh) * 2017-06-23 2017-10-10 河北麦森钛白粉有限公司 与植物和/或微生物联用的土壤修复促进剂的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
夏立江等: "《重金属污染生物修复机制及研究进展》", 《核农学报》 *
田锦: "《基因操作技术》", 31 August 2013, 北京：中国农业大学出版社 *
赵恒: "《产一氧化氮基因工程菌株的构建及其对铜胁迫下杂交狼尾草的促生作用研究》", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109570214A (zh) * 2019-01-23 2019-04-05 侯萍 一种土壤修复方法
CN115382901A (zh) * 2022-09-06 2022-11-25 生态环境部南京环境科学研究所 一种利用植物-微生物联合的镉污染土壤修复方法

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