CN108753641A - 一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属微生物种质资源的开发与利用技术领域，公开了高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其应用，该菌株为致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens) Z‑H2，能耐受高浓度的对羟基苯甲酸，且能以对羟基苯甲酸为唯一碳源生长，对对羟基苯甲酸有高效降解功能。用紫外分光光度法测定，0.1 mg/ml对羟基苯甲酸条件下培养12小时PA降解了97%。1 mg/ml对羟基苯甲酸条件下培养48小时PA降解了98%。5 mg/ml对羟基苯甲酸条件下，培养72小时PA降解了97%。实验显示该菌株对自毒物质对羟基苯甲酸具有很好的降解效果，对缓解自毒物质引起的连作障碍具有潜在的应用价值。

Description

一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物种质资源的开发与利用技术领域，具体涉及一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其应用。
背景技术
化感作用( Alle lopathy) 是植物因向环境释放某些化学物质而影响其他植物或自身生长发育的化学生态学现象。已有研究表明，化感作用是造成作物连作障碍的主要因子。通过研究根系化感物质对土壤微生态的影响揭示连作障碍机理是当前研究的热点。
自毒物质是指植物通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径释放并对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用的化学物质。这些物质一方面通过影响离子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白质和 DNA 合成等多种途径来影响植物生长，而更为重要的是自毒物质在根际土壤中的累积为根际病原菌提供了丰富的营养，加速其繁殖，从而导致连作障碍的发生。
对羟基苯甲酸已经被证实是多种植物产生的自毒物质，尤其在草莓和黄瓜上，对羟基苯甲酸在根系分泌物中含量最高、自毒作用最强。如果能加速连作土壤中对羟基苯甲酸的降解，将利于有效控制草莓和黄瓜连作障碍的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌，该菌株分类命名为致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens) Z-H2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CGMCC No.14461。
该菌株的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养24h后，菌落颜色发红，圆形，有光泽，直径1-1.5mm，不透明,表面湿润；培养48h可见橙色色素产生并扩散在培养基里，继续培养后，菌落发粘，不易挑起；菌体呈杆状，单个或成对生长，不产芽孢，革兰氏染色为阴性。菌株显微图片如图1所示。
该菌株的生理生化特征为：氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性、乙醇利用试验阴性、L-阿拉伯糖试验阳性、水解淀粉实验阴性、荧光色素阳性、明胶液化试验阳性、从蔗糖产生果聚糖试验阳性。
该菌株最适培养条件为：LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L,氯化钠10 g/L，pH 7.2，温度30℃，121˚C灭菌20min。
该菌株可以用于制备微生物菌剂，应用时，培养CGMCC No.14461，得菌悬液，作为液态菌剂，浓度为2×108cfu/ml。使用时，直接将100mL OD600值为1的菌液施加进植株根系土壤中即可。该菌液对植株无毒害作用。
本发明所获得的细菌致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens) Z-H2能够耐受高浓度的对羟基苯甲酸，且能以对羟基苯甲酸为唯一碳源生长，对对羟基苯甲酸有高效降解功能。用紫外分光光度法测定，0.1 mg/mL对羟基苯甲酸条件下，在培养4小时时，培养液中的PA已经被降解了80%，培养12小时后PA已经被降解了97%。在1 mg/mL对羟基苯甲酸条件下，培养24小时，PA被降解了70%，培养48小时，PA已经被降解了98%。在最高浓度5 mg/mL对羟基苯甲酸条件下，培养36小时前，PA未被降解，但到培养72小时，PA已经被降解了97%。3个PA浓度下，PA均能被Z-H2有效降解。以上结果表明，Z-H2菌株对自毒物质对羟基苯甲酸具有很好的降解效果，对缓解自毒物质对羟基苯甲酸引起的连作障碍具有潜在的应用价值。
本发明的致金色假单胞菌可用于能够分泌自毒物质对羟基苯甲酸的作物的水体或土壤中。
附图说明
一种降解对羟基苯甲酸的细菌，该菌株分类命名为致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens) Z-H2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CGMCCNo.14461；
图1为本发明菌株在LB培养基上培养48h后的显微图；图2为本发明菌株在LB培养基上培养48h后的菌落特征图；图3为对羟基苯甲酸标准曲线图；图4为Z-H2在0.1 mg/ml 对羟基苯甲酸条件下的生长曲线和对羟基苯甲酸残留量数据图；图5为Z-H2在1 mg/ml 对羟基苯甲酸条件下的生长曲线和对羟基苯甲酸残留量数据图；图6为Z-H2在5 mg/ml对羟基苯甲酸条件下的生长曲线和对羟基苯甲酸残留量数据图；图7为菌液缓解对羟基苯甲酸对黄瓜苗毒害作用图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种降解对羟基苯甲酸的细菌，该菌株分类命名为致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens) Z-H2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CGMCCNo.14461。
一、CGMCC No.14461的筛选分离
取重庆市忠县官坝镇一个30年老竹林里随机采集土样10g，采集地经纬度N30°29′26.48″ 东经E107°52′30.75″。
采用无菌水梯度稀释至10-8浓度，分别取10-6、10-7、10-8浓度的稀释液0.2ml涂布在LB固体平板上，30℃，黑暗条件倒置培养。LB培养基配方为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L,氯化钠10 g/L，pH 7.2，温度30℃，121˚C灭菌20min。待菌落长出来后，挑取颜色发红，菌落较大的菌，在新的LB固体培养基上划线培养，以获得单菌落。
单菌落长出后，挑取单菌落接种于以对羟基苯甲酸（简称PA）为唯一碳源的无机盐基础培养液中，其中PA质量浓度为3mg/ml，无机盐基础培养液配方为：硫酸铵 2 g/L,七水硫酸镁0.2 g/L,磷酸二氢钠0.5 g/L,氯化钙0.1 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L, pH 7.2。接种后30℃，180 rpm恒温摇床培养72h，筛选出培养液由白色变为黄绿色的培养物，该培养物对应的单菌落即为能够利用对羟基苯甲酸的细菌，编号为Z-H2。将Z-H2接于LB固体斜面上,4℃保存用于后续实验。
二、CGMCC No.14461的的鉴定
该菌株在LB培养基上培养24h后，菌落颜色发红，圆形，有光泽，直径1-1.5mm，不透明,表面湿润；培养48h可见橙色色素产生并扩散在培养基里，继续培养后，菌落发粘，不易挑起。菌体呈杆状，单个或成对生长，不产芽孢，革兰氏染色为阴性。菌株显微图片如图1所示。
该菌株的生理生化特征为：氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性、乙醇利用试验阴性、L-阿拉伯糖试验阳性、水解淀粉实验阴性、荧光色素阳性、明胶液化试验阳性、从蔗糖产生果聚糖试验阳性。
对筛选得到的Z-H2按如下步骤进行分子鉴定:挑取Z-H2单菌落接于LB液体培养基中,30℃摇床培养过夜。取200μl菌液,12000rpm离心5min,弃上清,于沉淀中加入40μl灭菌超纯水,充分混匀后,置于100℃水浴5min裂解,裂解液作为模板进行PCR反应。PCR引物为通用引物27F和1492R,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列为:27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR体系为：10× PCR Buffer5μL， dNTPs 1.5μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，rTaq酶1μL，加水补齐至50μL。PCR程序为94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京华大生物工程技术有限公司测序。序列经blast比对，结果与绿针假单胞菌为100%相似度。
最后，结合Z-H2的培养特征、生理生化和分子鉴定结果,尤其是根据Z-H2产生的色素颜色（橙色而不是绿色），对碳源的利用情况（能利用L-阿拉伯糖，而不能利用乙醇）这两点，根据《伯杰细菌鉴定手册》第八版，将Z-H2鉴定为致金色假单胞菌（Pseudomonas aureofaciens）。
致金色假单胞菌是由Kluyver于1956年提出并命名的一个假单胞菌种(Pseudomonas aureofaciens)，2007年Peix等将其划归为绿针假单胞菌( Pseudomonaschlororaphis) 的一个亚种( P． chlororaphis subsp． aureofaciens)。
三、菌株Z-H2对高浓度对羟基苯甲酸的耐受及其对对羟基苯甲酸的降解能力
（1）对羟基苯甲酸标准曲线的绘制
以无机盐基础培养液为溶液配制对羟基苯甲酸标准液，浓度分别为：0.00, 0.002,0.004, 0.006, 0.008, 0.01 mg/mL，以零管作参比,用石英比色杯在波长255 nm下测定吸光度,以吸光度为纵坐标,以对羟基苯甲酸含量为横坐标绘制标准曲线。不同浓度对羟基苯甲酸对应的255 nm吸光度值见表1。
表1不同浓度对羟基苯甲酸对应的255 nm吸光度值
浓度(mg/mL) 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
A255 0 0.107 0.239 0.376 0.512 0.632
根据上述数值做出的标准曲线图见图2。由图2所示，拟合的方程式为：C(A) = 0.0155* A + 0.0002。
（2）生长曲线的绘制：取OD600为0.5的Z-H2菌液为种子液，按2%的体积比将种子液接种到25 ml新鲜的无机盐基础培养液中,培养液中PA是唯一碳源。PA浓度设3个，分别为0.1 mg/mL,1 mg/mL,5 mg/mL. 无机盐基础培养液配方为：硫酸铵 2 g/L,七水硫酸镁0.2g/L,磷酸二氢钠0.5 g/L,氯化钙0.1 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L, pH 7.2。
将接种后的培养物放在30℃，180 rpm恒温摇床中震荡培养。第一次和第二次取样时间为培养4小时和12小时，以后每间隔12小时取一次样品。在超净台内用无菌取样器取出2ml培养液，其中1ml用于测定OD600，观察Z-H2的生长情况，测定仪器为：eppendorfbiospectrometer紫外/可见分光光度计。另外1ml用于测定样品中对羟基苯甲酸残留量。
样品中对羟基苯甲酸残留量的测定及降解率计算：将1ml菌液加入到无菌离心管中，10000r/min，25℃，离心5min后，取0.2 ml上清液以不加对羟基苯甲酸的无机盐基础培养液作参比，用石英比色杯在波长255 nm下测定吸光度。根据标准曲线计算培养液中的对羟基苯甲酸残留量。按公式计算PA的降解率。
Z-H2在0.1 mg/ml 对羟基苯甲酸条件下的生长曲线和对羟基苯甲酸残留量数据见图3，Z-H2在1 mg/ml 对羟基苯甲酸条件下的生长曲线和对羟基苯甲酸残留量数据见图4，Z-H2在5 mg/ml对羟基苯甲酸条件下的生长曲线和对羟基苯甲酸残留量数据见图5。由上述结果可见，在0.1 mg/ml对羟基苯甲酸条件下，培养基中碳源浓度太低，虽然可见Z-H2生长，但生长状况明显不如1 mg/ml和5 mg/ml 对羟基苯甲酸条件。在1 mg/ml和5 mg/ml 对羟基苯甲酸条件下，Z-H2生长曲线呈现出明显的延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。说明Z-H2能够利用对羟基苯甲酸作为唯一碳源生长，且能耐受1 mg/ml和5 mg/ml 对羟基苯甲酸浓度。尤其在1 mg/ml浓度下，Z-H2的延缓期很短，只有12小时，培养24小时即达到对数生长期。
从培养液中残留的PA浓度来看，PA浓度随着菌体的生长而降低，当细菌生长达到对数生长期时，PA也被迅速降解，浓度急剧下降。表2为菌株Z-H2对培养液中PA降解率的统计结果。
表2 Z-H2对培养液中PA降解率（%）统计表
从表2可以看出，0.1 mg/ml对羟基苯甲酸条件下，培养基中PA浓度低，因此，在培养4小时时，培养液中的PA已经被降解了80%，培养12小时后PA已经被降解了97%。这也解释了在0.1 mg/ml对羟基苯甲酸条件下，细菌的生长状况不太好（OD600一直很低）的原因：大部分碳源已经被降解，细菌生长处于受抑制状态。虽然不太好，但也一直在缓慢生长，这说明了Z-H2能够利用对羟基苯甲酸降解的中间产物为碳源。在1 mg/ml对羟基苯甲酸条件下，培养24小时时，PA被降解了70%，培养48小时时，PA已经被降解了98%。在最高浓度5 mg/ml对羟基苯甲酸条件下，培养36小时前，PA未被降解，但到培养72小时时，PA已经被降解了97%。总之，在3个PA浓度下，PA均能被Z-H2有效降解。
四、菌株Z-H2在草莓上的应用。
文献《草莓根系分泌物和腐解物中的酚酸类物质及其化感作用》（甄文超，河北农业大学学报.2004），该文献中公开了：从培养70天的草莓组培苗根系分泌物中检测到对羟基苯甲酸含量为0.0032 mg/mL。同时，发现0.138 mg/mL的对羟基苯甲酸强烈抑制草莓组培苗的根系和茎叶生长。因此，本研究中使用含有0.1 mg/mL对羟基苯甲酸的栽培基质，并接种CGMCC No.14461，然后进行草莓幼苗盆栽实验，以说明CGMCC No.14461对对羟基苯甲酸自毒作用的缓解作用。
具体实验方案如下：在尺寸为口径24cm，高25cm的塑料花盆中装土9L，将0.9g对羟基苯甲酸溶解于500mL水，然后均匀的拌入土中。再加入100mL OD600值为1即浓度为2×108cfu/ml的CGMCC No.14461菌悬液，拌匀菌液后将土放入新的塑料盆中。含对羟基苯甲酸和菌液的处理定为处理一。只含有对羟基苯甲酸，以100 mL 水代替菌液的处理定为处理二；既不含对羟基苯甲酸也不含菌液，只浇600 mL水的处理为CK。每个处理设5次重复。将三个处理浇水至土壤湿度80%左右，移栽生长健壮、大小一致的草莓幼苗，每盆栽一株。草莓移栽后将盆置于温室中，温度条件25℃，每周浇一次水。移栽60天后，统计草莓苗根条数、根茎粗、株高和地上部干重。结果如表3。可见，与CK相比，处理二中的草莓苗因为加入了对羟基苯甲酸而受到强烈抑制，表现为植株矮小，细弱，根少，地上部分干重只有对照的23%。当处理二加入CGMCC No.14461菌悬液后，明显缓解了草莓苗的受抑制作用。根数量、根茎粗、株高及地上部干重均有所提高，地上部分干重达到有对照的76%。说明CGMCC No.14461菌悬液能够缓解对羟基苯甲酸对草莓苗的自毒作用。
表3不同对羟基苯甲酸和菌液处理下草莓苗生长情况
处理 根数量（条） 根茎粗（cm） 株高（cm） 地上部干重（g）
CK 24 0.70 12.5 1.182
处理一 18 0.60 10.8 0.893
处理二 8 0.26 5.0 0.277
五、菌株Z-H2在黄瓜上的应用。将黄瓜种子播种到基质中，放置于光照培养箱中生长到株高约20 cm时，根据基质重量施加对羟基苯甲酸，使得基质中的对羟基苯甲酸含量为25g/kg。在处理一中施加完对羟基苯甲酸后，再加入100mL OD600值为1即浓度为2×108cfu/ml的CGMCC No.14461菌悬液，处理二中只加对羟基苯甲酸和100mL 水，处理三中不加对羟基苯甲酸，加入100mL 不含菌体的空白LB培养基。在光照培养箱中生长10天后，结果见图7。生长数据见表4，可见，25g/kg的对羟基苯甲酸对黄瓜苗的毒害作用主要表现为整株发黄，而加入CGMCC No.14461菌悬液后，黄瓜苗不但不发黄，反而长得更健壮，表现为叶片颜色深绿，茎粗增加，叶片增大。为了排除是空白LB培养基对黄瓜苗的促进生长作用，我们设置了处理三作为对照。结果由图7和表2可以看出，在没有加对羟基苯甲酸的情况下，LB空白培养基处理的黄瓜苗茎粗及叶片横径、纵径均小于处理一。所以，CGMCC No.14461菌悬液不仅能够解除对羟基苯甲酸对黄瓜苗的毒害作用，而且具有促进黄瓜苗生长的作用。
表4 不同对羟基苯甲酸和菌液处理下黄瓜苗生长情况
处理 株高 茎粗cm 最大叶片横径cm 最大叶片纵径cm 叶片颜色
处理一 32 9 14.2 12.5 深绿
处理二 34 6 12 10 黄
处理三 33 6 12 9.2 深绿
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 山西省农业科学院果树研究所；山西省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其应用
<150> 2017109954339
<151> 2017-10-23
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc 60
gacgatccgt aactggtctg agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag 120
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca 180
tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg aggaagggta 240
cttacctaat acgtgagtat tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc taactctgtg 300
ccagcagccg cggtaataca gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg 360
cgcgtaggtg gttcgttaag ttggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatc 420
caaaactggc gagctagagt atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta gcggtgaaat 480
gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca cctggactga tactgacact 540
gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 600
gatgtcaact agccgttggg agccttgagc tcttagtggc gcagctaacg cattaagttg 660
accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca 720
agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat 780
ccaatgaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac attgagacag gtgctgcatg 840
gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg 900
tccttagtta ccagcacgtt atggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga 960
ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta 1020
caatggtcgg tacagagggt tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc 1080
gtagtccgg 1089

Claims (6)

1.一种高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌，其特征在于：该菌株分类命名为致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens) Z-H2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CGMCC No.14461。
2.根据权利要求1所述的高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌，其特征在于：所述菌株的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养24h后，菌落颜色发红，圆形，有光泽，直径1-1.5mm，不透明,表面湿润；培养48h可见橙色色素产生并扩散在培养基里，继续培养后，菌落发粘，不易挑起菌体呈杆状，单个或成对生长，不产芽孢，革兰氏染色为阴性。
3.根据权利要求1所述的高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌，其特征在于：所述菌株的培养条件为：LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L,氯化钠10 g/L，pH 7.2，温度30℃，121˚C灭菌20min。
4.一种包含权利要求1或2所述的高效降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌的微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于：培养CGMCC No.14461，得菌悬液，作为液态菌剂。
6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于：所述液态菌剂的浓度为2×108cfu/ml。
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