CN110938556A - 一株杨树根际解无机磷细菌及其应用 - Google Patents

一株杨树根际解无机磷细菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株杨树根际解无机磷细菌，为琥珀葡萄球菌，分类命名为Staphlococcus succinus Mp1‑Ha3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019723，保藏日期：2019年9月16日，保藏地址：中国武汉武汉大学。该细菌对难溶性磷酸盐表现出较强的溶解能力，且在外源性磷酸盐的诱导下较为稳定，该菌株具有良好的植物促生作用。

Description

一株杨树根际解无机磷细菌及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株杨树根际解无机磷细菌及其应用。
背景技术
杨树是苏北的重要经济林木，具有成材快，易种植等优势，然而短期轮阀的经营模式造成土壤肥力的大量流失，土壤缺磷问题已逐渐显现。磷是植物生长发育所需的重要营养物质，在植物的生长过程中起到重要作用。然而，土壤中的磷源往往以不溶性形态存在，植物无法吸收利用，土壤缺磷已成为制约林业发展的重要问题。为满足发展的需求，需大量施用磷肥，但施用的磷肥易于土壤中的金属离子结合形成螯合物而被固定，不能被植物吸收利用。磷肥施用不当还会造成水源污染、土地板结、土壤肥力下降等情况。为提高林木产量，改善土壤环境，迫切需要寻求一种更为环保且有效的方法提高土壤有效磷含量。
植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria ,PGPR)指生存于植物根际、根表并能直接或间接地促进与调节植物生长的微生物，其中解磷菌能够将难溶性磷酸盐，如磷矿粉中的磷转化为水溶性态，从而供植物吸收利用。该类细菌既能活化土壤中难溶性磷素，还可以通过影响植物根系分泌物的种类和数量，增加植物根系对周围K、Ca、Mg、Fe、Zn等营养元素的吸收，提高植物的抗逆性，使植物能够在酸性、缺磷等胁迫生境下生长。
目前对于解磷细菌的研究主要集中于农业发展，从林木根际筛选的解磷细菌相对较少。微生物的种类繁多，较为复杂，溶解难溶性磷酸盐的机理也不尽相同，分离高效解无机磷细菌，研究其解磷特性和植物促生能力，为其开发利用奠定基础，为解决林木缺磷问题提供新的方向。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株杨树根际解无机磷细菌，该细菌对难溶性磷酸盐表现出较强的溶解能力，且在外源性磷酸盐的诱导下较为稳定；本发明明的另一目的在于提供该杨树根际解无机磷细菌在促进植物生长的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株杨树根际解无机磷细菌，分离自淮安市清江浦区淮阴工学院枚乘路校区校园杨树根际土壤，为琥珀葡萄球菌，分类命名为Staphlococcus succinus Mp1-Ha3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019723，保藏日期：2019年9月16日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
Mp1-Ha3的生物学特征：将活化后的Mp1-Ha3菌株接种于LB培养基，倒置培养48小时后，单菌落呈圆形，菌落中心黄色、干燥、不光滑，中心外围颜色稍浅，褶皱有光泽，菌落边缘锯齿状，显微镜镜检发现，该菌株菌体球形，直径0.8-1 μm，革兰氏染色结果为阳性，菌体外表面存在荚膜，菌体周身无鞭毛。
Mp1-Ha3的16S rDNA序列：该菌株16S rDNA序列片段全长1448bp，已上传至Genbank 数据库，序列登录号：MN461567.1。
本发明所述一株杨树根际解无机磷细菌在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。
进一步的，所述难溶性无机磷酸盐为磷酸三钙。
本发明所述一株杨树根际解无机磷细菌在促进植物生长中的应用。
进一步的，所述植物为油菜。
本发明的有益效果为：
（1）本发明的杨树根际解无机磷细菌Mp1-Ha3，对难溶性磷酸盐表现出较强的溶解能力，尤其对磷酸三钙具有较强的溶解能力，且在外源磷酸盐介导下能维持较为稳定的解磷能力。
（2）本发明的杨树根际解无机磷细菌Mp1-Ha3，用于油菜接种时，接种该菌株的油菜苗在苗高、地径、根长等方面明显优于未接菌的对照组，证明该菌株能够促进植物的生长，因此具有潜在的开发利用价值。
附图说明
图1为菌株Mp1-Ha3的生物形态学特征图；
图2为菌株Mp1-Ha3在NBRIP液体培养基中的解磷情况、pH及可滴定酸度结果图；
图3为不同浓度外源可溶性磷对菌株Mp1-Ha3解磷活性的影响图；
图4为菌株Mp1-Ha3对油菜生长影响图。
具体实施方式
实施例1：解无机磷细菌Mp1-Ha3对不同磷源的溶解能力
1.培养基配方
LB培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 10 g/L，去离子水 1000 mL，pH7.0。
NBRIP培养基：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）2 5 g，MgCl2.6H2O 5 g，KCl 0.2 g，MgSO4.7H2O 0.25 g，（NH4）2SO4 0.1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0，在测定该菌株对不同磷源的溶解能力时，需将培养基配方中的Ca3（PO4）2替换成AlPO4或FePO4。
2.实验方法
取-80℃保藏的菌株Mp1-Ha3活化转接两次后，接种于LB液体培养基，28℃，180 r/min培养12 h。吸取1 mL菌液，10000 rpm离心1 min，去上清，然后用无菌蒸馏水洗涤两次后制成种子液。然后按1%的接种量将种子液接种于NBRIP液体培养基中（分别以Ca3(PO4)2、AlPO4、FePO4为唯一磷源），28℃、180 r/min培养三天，每个磷源设置三组平行，以不接菌作为对照。将培养三天后的发酵液10000 rpm离心10 min，取上清，过0.22μm的滤膜，采用钼锑抗比色法测定上清液中的可溶性磷含量，用pH计测定上清液的pH，用酸碱滴定法测定可滴定酸度。
实验结果如图2所示，解无机磷细菌Mp1-Ha4对磷酸三钙的溶解能力最强，达到359.67mg/L，pH与可溶性磷含量之间呈负相关，可滴定酸与可溶性磷含量之间呈正相关。
实施例2：不同水平可溶性磷浓度对解无机磷细菌Mp1-Ha3解磷活性的影响
1.培养基
外源可溶性磷源：100mmol/L的K2HPO4。
SP培养基：葡萄糖10 g、(NH4)2SO4 0.6 g、KCl 0.4 g、Ca3(PO4)2 5 g，去离子水1L，pH7.0。
2.实验方法
以K2HPO4（100 mmol/L）为外源可溶性磷源，配制外源可溶性磷终浓度分别为0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和25.0 mmol/ L的SP培养基。按实施例1的方法制备种子液，按照1%的接种量将解无机磷细菌Mp1-Ha3菌悬液接入含有不同浓度可溶性磷的SP液体培养基中，180rmp、28℃条件下震荡培养2天。每一可溶性磷水平处理设置三个重复，以不接菌作为空白对照。培养2天后，对培养液进行菌落计数。将发酵液10000rpm，离心10 min，取上清。将上清用孔径为0.22 μm的一次性滤膜过滤菌体及杂质，过滤后的滤液用钼锑抗比色法测定上清液中的可溶性磷含量，pH计测量pH，酸碱滴定法测定可滴定酸度。
实验结果如图3所示，在SP液体培养基中，外源可溶性磷能够显著影响解无机磷细菌Mp1-Ha3的解磷活性。当不添加外源可溶性磷时（0 mmol/L），Mp1-Ha3解磷量为606.2 μg/mL，显著高于（P < 0.05）添加外源可溶性磷时的解磷量。当外源可溶性磷浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 、25.0 mmol/ L时，Mp1-Ha3的有效磷含量分别为358.3、432.7、338.1、297.2、249.7 μg/mL，呈现略微上升后逐渐下降的趋势。当外源可溶性磷浓度分别为0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和25.0 mmol/ L时，培养基pH分别为4.23、4.3、4.1、4.19、4.3、4.6、4.8，相对于空白对照（pH=7.1）均出现了下降，相关性分析显示，培养基pH与Mp1-Ha3解磷量呈负相关（R=-0.82065）。培养基可滴定酸度呈现先上升后下降，后又上升的趋势。结果表明，外源可溶性磷能够显著抑制解无机磷细菌Mp1-Ha3的解磷活性，随着可溶磷浓度的增加JW-H3解磷量基本呈逐渐下降的趋势，培养基pH基本呈逐渐上升的趋势，与该菌株解磷量密切相关。
实施例3：解无机磷细菌Mp1-Ha3对油菜接种的影响
供试土壤配方：85% 的石英砂，15% 的蒙脱石，2% 的CaCO3，按每千克土壤添加500 mgCa3(PO4)2。混匀后，121℃，灭菌50 min。
实验方法：
（1）种子灭菌：取200粒油菜种子浸泡于无菌水中6-7 h，于超净工作台风干。再将其置于30% 的次氯酸钠溶液中浸泡90 s进行表面灭菌，后用无菌水漂洗三次。
（2）种子萌发：将灭菌彻底的油菜种子分别浸泡于Mp1-Ha3菌悬液和生理盐水中，浸泡30 min后，于超净工作台中风干种子。将风干后的油菜种子置于水琼脂平板培养基上，每块平板放置12粒种子，每个处理设立五个重复。在28℃，黑暗条件下培养，观察种子萌发情况，计算萌发率。萌发率计算公式：（发芽终期全部正常种子粒数/供试种子粒数）×100%。
（3）油菜接种实验：按实施例1的方法制备种子液。取3粒彻底灭菌的油菜种子于花盆中，取1 mL接种液接种于种子上，以浸泡于生理盐水的油菜种子作为空白对照。待种子发芽后，只保留花盆中生长最旺盛的一株，进行后续取样处理。自然光照，第20天进行一次油菜苗取样。测定苗高、地径、根际、根内定殖情况。
种子萌发结果如表1所示。
表1 种子萌发率
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE002
由表1可知，在培养65 h内，接种菌液的种子萌发率要优于未接种的。
油菜接种20、40、60天后的结果如表2、表3和图4所示。
表2 接种解无机磷细菌Mp1-Ha3 20、40、60天后油菜的生长量
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE004
表3 接种解无机磷细菌Mp1-Ha3 20、40、60天后油菜组织、根际定殖
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE006
由表2、表3和图4可知，接种液处理过的的油菜地上苗高与对照相比分别增长了1.763、1.804、3.650 cm，有显著差异；接种液处理过的的油菜地下根长与对照处理相比分别增长了2.210、1.348、5.38 cm，有显著差异；接种液处理过的的油菜地径比对照组增长了0.01、0.018、0.009 cm，无显著差异；菌液处理过的的油菜干重分别为0.073、0.170、0.468 cm，相比对照处理的油菜干重分别增长了0.015、0.023、0.180 cm；接种液处理过的的油菜叶片数量比对照处理的油菜叶片数量多。研究表明，解无机磷细菌Mp1-Ha3能够促进油菜苗高、根长、地径以及叶片数量的生长。解无机磷细菌Mp1-Ha3在根际土定殖数量分别为110、126、134 cfu/g，根内定殖数量257、265、292 cfu/g，茎内定殖数量156、167、178 cfu/g，叶片定殖数量335、349、374 cfu/g。表明解无机磷细菌Mp1-Ha3能够促进油菜组织、根际定殖。

Claims (5)

1.一株杨树根际解无机磷细菌，其特征在于，为琥珀葡萄球菌，分类命名为Staphlococcus succinus Mp1-Ha3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM 2019723，保藏日期：2019年9月16日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的一株杨树根际解无机磷细菌在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株杨树根际解无机磷细菌的应用，其特征在于：所述难溶性无机磷酸盐为磷酸三钙。
4.权利要求1所述的一株杨树根际解无机磷细菌在促进植物生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的一株杨树根际解无机磷细菌的应用，其特征在于：所述植物为油菜。
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