CN108587979B - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明一方面提供了一种新菌株枯草芽孢杆菌；另一方面提供了该枯草芽孢杆菌在防治西瓜枯萎病和香蕉枯萎病中的应用。本发明的有益效果为：1）枯草芽孢杆菌hfkc07对西瓜枯萎病、香蕉枯萎病防效较高，具有较高的应用价值。2)枯草芽孢杆菌hfkc07培养5000升工艺所用的原料简单，工艺成熟，具备工业化前景。3）枯草芽孢杆菌hfkc07作为生物杀菌剂，作用机理复杂，克服了单一性化学杀菌剂容易产生抗性的弊端。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
西瓜枯萎病俗称“死秧病”，发病初期，病株茎蔓上的叶片自基部向前逐渐萎蔫，似缺水状，中午更明显，最初1、2日，早晚尚能恢复正常，数日后，植株萎蔫不再恢复，慢慢枯死，多数情况全株发病，也有的病株仅部分茎蔓发病，其余茎蔓正常。发病植株茎蔓基部稍缢缩，病部纵裂，有淡红色（琥珀色）胶状液溢出，根部腐烂变色，纵切根颈，其维管束部分变褐色。
香蕉枯萎病是一种侵染香蕉植株维管束的真菌引起的土传病。 是一种毁灭性病害，是国际植物检疫对象，由尖孢镰刀菌古巴专化型侵染引起。在中国南方数省香蕉产区都有发生。 主要有布1号和4号小种，1号小种主要为害粉蕉，4号小种为害粉蕉和香蕉。病原菌在土壤中存活时间达数年之久，一般减产20%以上，严重的田块甚至绝收。 又叫香蕉黄叶病或称巴拿马病(Panama disease)。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，枯草芽孢杆菌广泛应用于饲料、肥料及作为杀菌剂使用。其制剂是无毒、无残留、无污染的绿色菌剂，具有广阔的发展前景，显示出巨大的社会效益和生态效益。
防治西瓜枯萎病及香蕉枯萎病大多采用化学农药，存在药物残留及病原菌容易产生抗药性的风险，采用枯草芽孢杆菌进行防治，则不存在药物残留风险及抗药性问题。
现有技术中也筛选得到了一些枯草芽孢杆菌，但是其对枯萎病的防效不高，效果不明显。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种枯草芽孢杆菌及其应用的技术方案。
本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）hfkc07，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2018年04月25日，保藏号：CGMCC No.15643。
所述的枯草芽孢杆菌hfkc07在防治西瓜枯萎病中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌hfkc07在防治香蕉枯萎病中的应用。
所述的一种防治西瓜枯萎病的菌剂，其特征在于含有枯草芽孢杆菌hfkc07。
所述的一种防治香蕉枯萎病的菌剂，其特征在于含有枯草芽孢杆菌hfkc07。
所述的利用枯草芽孢杆菌hfkc07防治西瓜枯萎病的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌hfkc07经过种子罐和发酵罐培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液，该枯草芽孢杆菌发酵液喷施于田间防治西瓜枯萎病。
所述的利用枯草芽孢杆菌hfkc07防治香蕉枯萎病的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌hfkc07经过种子罐和发酵罐培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液，该枯草芽孢杆菌发酵液喷施于田间防治香蕉枯萎病。
本发明的有益效果为：1）枯草芽孢杆菌hfkc07对西瓜枯萎病、香蕉枯萎病防效较高，具有较高的应用价值。2) 枯草芽孢杆菌hfkc07培养5000升工艺所用的原料简单，工艺成熟，具备工业化前景。3）枯草芽孢杆菌hfkc07作为生物杀菌剂，作用机理复杂，克服了单一性化学杀菌剂容易产生抗性的弊端。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1 ：枯草芽孢杆菌分离
本发明中枯草芽孢杆菌分离可分为初筛和复筛。
枯草芽孢杆菌初筛采用平板稀释法，土样采集自桐庐县旧县街道水稻田，培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，葡萄糖0.5g/L,牛肉膏1g/L,蛋白胨1g/L,氯化钠0.5g/L,消前PH值7.2～7.4。将含枯草杆菌培养液的培养基加入一定量无菌水稀释，混匀后吸取0.1mL培养液到平板上，涂布均匀后置于30℃培养箱培养2天，挑选菌落较大的转接到含牛肉膏蛋白胨的试管斜面中。
复筛采用平板对峙法，尖孢镰刀菌接种用香蕉枯萎病病株分离得到，经显微镜镜检，有镰刀型孢子，将尖孢镰刀菌菌种于PDA平板上，28℃，培养5天，用5毫米打孔器在平板边缘打菌饼，放在PDA空白平板的中心，将枯草芽孢杆菌用无菌水稀释，配成一定浓度，用接种针在平板中心3厘米处均匀点四个点，倒置放置在28℃培养箱中，每天观察菌体生长情况，以不加药平板为对照，对照恰好长满平板时，用十字交叉法测各平板的菌落直径，计算抑制率。挑选抑制率最高的菌株为枯草芽孢杆菌菌种。
经过初筛及复筛，得到一株对尖孢镰刀菌抑制率达到90.5%的枯草芽孢杆菌菌种，命名为hfkc07，并进行生理生化鉴定及分子序列测定，确定为枯草芽孢杆菌。
同时，对该菌株进行保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2018年04月25日，保藏号：CGMCCNo.15643。
实施例2 枯草芽孢杆菌鉴定
对实施例筛选得到的枯草芽孢杆菌hfkc07进行鉴定，经鉴定，该枯草芽孢杆菌特征为：菌落粗糙，不规则圆形，菌落中心略有凸起，中心呈圆形，菌落外缘呈放射状波纹，白色不透明，无润泽度。同时，进行了理化性质及分子生物学鉴定，理化性质结果见表1，分子生物学鉴定得到枯草芽孢杆菌hfkc07的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，gyrB 基因如SEQ ID NO.2所示。
表1 枯草芽孢杆菌细胞形态及理化实验结果
实施例3 枯草芽孢杆菌培养
枯草芽孢杆菌hfkc07培养采用液态发酵工艺，取枯草芽孢杆菌hfkc07试管斜面，用适量无菌水，用接种针刮下孢子，混匀，加入种子罐中，37℃培养，通气比1:1（vvm），搅拌转速80～250rpm,培养15～25小时后移入5000升发酵罐。种子罐培养基：葡萄糖10g/L,黄豆饼10g/L,磷酸二氢钾0.2g/L、轻质碳酸钙0.5g/L，消前PH值7.0～7.5，灭菌后备用。
发酵采用5000升罐进行，配方为：葡萄糖10g/L,淀粉 20g/L,黄豆饼粉20g/L,磷酸二氢钾0.2g/L,轻质碳酸钙0.5g/L、硫酸锰0.02g/L，消前PH值7.0～7.5，121℃，灭菌30分钟，放凉后通过无菌法移入种子液，37℃培养，通气比1:1.5（vvm）,搅拌转速100～200rpm,培养24～48小时，通过显微镜镜检观察菌体情况，全部转为芽孢后停止培养。
经过种子罐及发酵罐培养，得到芽孢数100亿cfu/g的枯草芽孢杆菌发酵液，进行田间药效试验。
实施例4
枯草芽孢杆菌hfkc07采用100亿cfu/g发酵液，250倍及500倍稀释，对照采用空白对照及75%的百菌清500倍稀释，施药方式采用灌根，在瓜苗移栽期及坐果期各灌根一次，使用药剂分别为250倍、500倍枯草芽孢杆菌，75%百菌清100毫升500倍液，在第二次施药后7天，14天，30天，45天统计发病情况，计算防效并在收获期统计各处理产量，计算各处理增产情况。结果表明：枯草芽孢杆菌hfkc07发酵液在试验剂量下，对西瓜枯萎病有明显的防治效果，试验期间防效达到88.9%，并有明显的增产作用，每亩增产305.1～350.6公斤，对照药剂增产140.5公斤。
表2 不同施药天数下对西瓜枯萎病防效
实施例5
枯草芽孢杆菌hfkc07采用100亿cfu/g发酵液，250倍及500倍稀释，对照采用空白对照及50%的多菌灵600倍稀释，施药方式采用灌根，生长期每月灌根一次，使用药剂分别为250倍、500倍枯草芽孢杆菌、50%多菌灵100毫升600倍液，4月初开始试验，4～9月每月初施药一次，并统计当月防效，在收获期统计各处理产量，计算各处理增产情况。结果表明：枯草芽孢杆菌发酵液在试验剂量下，对香蕉枯萎病有明显的防治效果，试验期间防效达到90.5%，增产50.6～60.8公斤。
表3 不同施药天数下对香蕉枯萎病防效
序列表
<110> 浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司
<120> 一种枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
aatgcggcgt gctatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
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aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aatggctcac 240
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accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
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ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa 1440
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<211> 942
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
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ggagttccgg ttacagacct tgaaatcatt ggcgaaacgg atcatacagg aacgacgaca 120
cattttgtcc cggaccctga aattttctca gaaacaaccg agtatgatta cgatctgctt 180
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aaacgtgaag gacaagagcg caaaaatgag tatcattacg aaggcggaat taaaagttat 300
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Claims (7)
1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）hfkc07，保藏编号为CGMCC No.15643。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌hfkc07在防治西瓜枯萎病和西瓜增产中的应用。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌hfkc07在防治香蕉枯萎病和香蕉增产中的应用。
4.一种防治西瓜枯萎病的菌剂，其特征在于含有如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌hfkc07。
5.一种防治香蕉枯萎病的菌剂，其特征在于含有如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌hfkc07。
6.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌hfkc07防治西瓜枯萎病的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌hfkc07经过种子罐和发酵罐培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液，该枯草芽孢杆菌发酵液喷施于田间防治西瓜枯萎病。
7.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌hfkc07防治香蕉枯萎病的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌hfkc07经过种子罐和发酵罐培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液，该枯草芽孢杆菌发酵液喷施于田间防治香蕉枯萎病。
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