CN113373096B

CN113373096B - 一种蜡样芽孢杆菌及其在缓解植物盐胁迫中的应用

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Publication number: CN113373096B
Application number: CN202110827523.3A
Authority: CN
Inventors: 刘方方; 张言周; 黄丽杰; 黄进婵; 胡化广; 康贻军; 姚利; 孙淼
Original assignee: Yancheng Teachers University
Current assignee: Yancheng Teachers University
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2041-07-21
Also published as: CN113373096A; ZA202207949B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开一种蜡样芽孢杆菌及其在缓解植物盐胁迫中的应用。本发明从沿海滩涂盐生植物盐地碱蓬根际土壤中筛选得到一株根际促生菌，通过生理生化特性及16SrDNA序列分析，该菌株被鉴定为一种蜡样芽孢杆菌，并将其命名为SSR‑7，该菌株同时具备产IAA和产铁载体的促生特性。对SSR‑7的培养基成分和发酵条件进行优化，并将该菌株接种于盆栽番茄根际，在盐分胁迫下能显著改善番茄的生长状态。

Description

一种蜡样芽孢杆菌及其在缓解植物盐胁迫中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体公开一种蜡样芽孢杆菌及其在缓解植物盐胁迫中的应用。

背景技术

盐碱地是指含有较高浓度可溶性盐类，并对植物生长直接造成抑制作用或危害的土壤。土壤盐碱化是现代农业发展过程中一个亟待解决的严峻问题。

盐碱地成因复杂，一般认为有两种来源：正常土壤的盐碱化和天然形成的盐碱地。土壤盐碱化是指土壤底层或地下水中易溶性盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，盐分积累在表层土壤中的过程，其主要是由于气候变化、水位及水质变化、地形及地貌变化等原因引起的。天然形成的盐碱地是由于河口泥沙淤涨和海水倒灌而逐渐形成的。

土地盐碱化会导致土壤理化性质恶化，可表现为：盐碱化土壤结构差，直径大于0.25毫米的水稳性团聚数量少，空隙度低，非毛管孔间少，粘结性差，土壤胶体钠离子含量高，通水性差，土壤有效含水量低，无效含水量显著增高，供水能力差，春秋地温偏低，土性冷凉，影响作物及时播种和幼苗生长，夏季地温偏高，加速了地表蒸发和积盐。另外，土壤微生物活动受到盐碱的抑制，固氮菌、硝化菌数量少，活性差，因而土壤中的氨化作用和硝化作用微弱，土地利用率显著下降。

土壤盐分过多对植物造成的危害，称为盐害，也称为盐胁迫。植物受到盐碱胁迫后，体内离子平衡会发生改变，植物对基本养分离子的吸收会受到影响；土壤盐碱浓度过高能引起渗透胁迫，致使植物体内水分流失，生长速度缓慢；且会对植物造成离子毒害，例如植物细胞壁中钠的过度积累导致细胞发生渗透应激甚至死亡；盐碱浓度过高还会诱导植物细胞产生和积累大量活性氧(ROS)，造成氧化胁迫，进而影响植物光合作用、呼吸作用等基本生理过程。综上，土壤盐碱化会对植物种子萌发、营养生长、生殖发育等几乎所有方面带来负面影响。

现有的盐碱地改良措施主要有以下几种：①使用化学改良剂，主要有两方面作用：一是改善土壤结构，加速洗盐排碱过程；二是改变可溶性盐基成分，增加盐基代换容量，调节土壤酸碱度；②物理措施，是通过改变土壤物理结构来调控土壤水盐运动，从而达到抑制土壤蒸发、改善入渗淋盐效果的目的，主要包括平整土地、深耕晒垡、及时松土、抬高地形、微区改土等传统的改良方法；③生物措施，包括借助植物改良盐碱土壤和借助微生物改良盐碱土壤。

应用微生物改良盐碱土壤具有成本低、环境友好等优势，是盐碱地改良研究中的一个热点。植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是一类自由生活在植物根际土壤或附生于植物根系的微生物，可直接或间接地协助植物适应环境变化，促进植物生长。研究发现，PGPR可以通过固氮、解磷、解钾、产吲哚乙酸(IAA)等方式促进植物对土壤中元素的有效吸收，提高植物抗逆性，改善土壤质量。有关PGPR诱导作物盐耐受性机制的研究表明，PGPR可通过调控植物体内激素水平、诱导植物产生抗ROS的酶类、诱导植物产生渗透保护剂、诱导产生胞外多聚糖(Exopolysaccharide,EPS)、调控植物体内的离子平衡等方式来应对或减轻盐胁迫。

已有文献报道，从多种作物的根际土壤中分离筛选出具有耐盐促生能力的PGPR，其中以芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomonas)居多。但从天然盐生植物，特别是从沿海滩涂重盐碱地盐生植物根际发掘的PGPR还比较少。另一方面，真正将PGPR应用于实际生产的案例也不多。

发明内容

为了解决上述问题，本发明从天然盐生植物根际土壤入手，筛选鉴定优良根际促生菌，并用于缓解植物的盐胁迫，为盐碱地修复和开发利用提供新途径。

本发明从沿海滩涂盐生植物盐地碱蓬根际土壤中筛选得到一株根际促生菌，通过生理生化特性及16SrDNA序列分析，该菌株被鉴定为一种蜡样芽孢杆菌，并将其命名为SSR-7，该菌株同时具备产IAA和产铁载体的促生特性。对SSR-7 的培养基成分和发酵条件进行优化，并将该菌株接种于盆栽番茄根际，在盐分胁迫下能显著改善番茄的生长状态。

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌，其命名为SSR-7，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2021459，保藏日期2021年4月26日。

上述蜡样芽孢杆菌能够用于缓解植物盐胁迫。

优选地，所述蜡样芽孢杆菌能够用于缓解番茄盐胁迫。

更优选地，所述蜡样芽孢杆菌的接菌量为1～5×10⁸CFU/株。

本发明还提供一种上述蜡样芽孢杆菌的发酵方法，将所述蜡样芽孢杆菌接种于LB培养基中，于30℃、转速150r/min下震荡培养12h，获得种子液；再将所述种子液以体积分数5％的接种量接种于复合培养基中，于20～35℃、pH5～9 下发酵培养12～36h；

其中，所述复合培养基是在L-色氨酸的基础培养基中分别加入1％(w/v)的碳源和氮源，且所述L-色氨酸的基础培养基是将L-色氨酸、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁及氯化钙按质量比为1:20:5:5:2:1混合，用超纯水溶解并定容至1L后得到。

优选地，所述碳源为果糖、蔗糖、木糖、甘露醇、乳糖或葡萄糖中的一种或几种；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸钙或硫酸铵中的一种或几种。

本发明还提供一种根据上述发酵方法制备得到的发酵菌液。

本发明还提供一种用于缓解植物盐胁迫的微生物菌剂，其包括上述蜡样芽孢杆菌或上述发酵菌液及可接受的辅料。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

1、盐胁迫下，在植物根部土壤中添加本发明提供的蜡样芽孢杆菌SSR-7，植物的株高、根长、鲜重等生长指标均优于对照组，植物叶片中过氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活以及丙二醛的含量均显著低于对照组，且植物根际土壤中的脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性均得到显著提高(提高了植株根际土壤中速效氮、磷和钾的含量)，表明SSR-7的加入能够显著缓解盐胁迫对植物的损伤，进而促进盐胁迫下植物的生长发育。

2、本发明从天然盐生植物根际土壤入手，筛选鉴定优良根际促生菌，并应用于缓解植物的盐胁迫；本发明提供的缓解植物盐胁迫的菌株为盐碱地修复和制备缓解盐胁迫的微生物制剂的开发利用提供新途径。

生物保藏说明

生物材料：蜡样芽孢杆菌SSR-7；分类命名：蜡样芽孢杆菌(拉丁文名称： Bacilluscereus)，于2021年04月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国·武汉·武汉大学；保藏编号为CCTCCM2021459。

附图说明

图1是各菌株16SrDNA序列扩增后纯化结果；泳道1-10分别代表菌株SSR-1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10，M代表DNA标准分子量参照Marker D2000；

图2是基于16SrDNA序列进行分子进化分析结果；

图3是PGPR对盐胁迫下番茄种子生根的影响；a、生根率；b、根长；图中 *表示实验组与对照组差异显著(P<0.05)；

图4是PGPR对盐胁迫下番茄种子发芽的影响；a、发芽率；b、芽长；图中 *表示实验组与对照组差异显著(P<0.05)；

图5是不同碳源对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响；

图6是不同氮源对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响；

图7是培养时间对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响；

图8是培养温度对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响；

图9是pH值对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响；

图10是装液量对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响；

图11是盐胁迫下SSR-7菌株对番茄幼苗生长发育的影响。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

该蜡样芽孢杆菌能够用于缓解植物盐胁迫。

该蜡样芽孢杆菌还能够按照该领域可接受的方法进一步制备成用于缓解植物盐胁迫的微生物菌剂。

下面对该蜡样芽孢杆菌的分离筛选方法及性能进行说明。

1.材料与方法。

1.1菌株的分离与筛选。

在江苏省沿海滩涂(N33°58'9.69"，E120°23'24.89")挖取盐地碱蓬，保证根部土壤完全覆盖根须，放入无菌保鲜袋中，带回实验室。用工具轻轻剖去外围土壤，剪去碱蓬的地上部分，随后将包裹着根部的土块放入超净工作台中，用剪刀小心剖开土壤，取带有少量土壤的根，剪成1cm的小段，放入盛有无菌水的三角瓶，于摇床中150r/min、28℃、震荡30min，使根部土壤完全溶于无菌水，形成富集液。对富集液进行梯度稀释(10^-5～10^-9)，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，每个梯度涂布3个平板，28℃培养箱中培养。挑取形态各异的单菌落进行划线培养，重复3次后，挑取单菌落保存于斜面培养基。

1.2根际菌的促生能力鉴定。

1.2.1产生长素(IAA)能力的鉴定：参照“刘晔,刘晓丹,张林利,等.花生根际多功能高效促生菌的筛选鉴定及其效应研究[J].生物技术通报,2017, 33(10):125-134”中记载的方法进行。

1.2.2产NH₃能力的鉴定：参照“康贻军,程洁,梅丽娟,等.植物根际促生菌的筛选及鉴定[J].微生物学报,2010,50(7):853-861”中记载的方法进行。

1.2.3产ACC脱氨酶能力的鉴定：参照“Penrose D M,Glick B R.Methods forisolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promotingrhizobacteria[J].Physiologia Plantarum,2010,118(1):10-15”中记载的方法进行。

1.2.4产铁载体能力的鉴定：参照“赵翔,谢志雄,陈绍兴,等.适合高产铁载体细菌筛选、检测体系的改进与探析[J].微生物学通报,2006,33(06):95-98”中记载的方法进行。

1.3 PGPR的生理生化分析及分子鉴定。

1.3.1 PGPR的生理生化分析，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)进行形态和生理生化特征鉴定。

1.3.2 PGPR的分子鉴定：参照“冯广达,陈美标,羊宋贞,等.用于PCR扩增的细菌DNA提取方法比较[J].华南农业大学学报,2013,34(03):439-442”中记载的方法进行。

1.4番茄种子萌发实验评价菌株的耐盐促生效果。

番茄种子预处理：选取颗粒圆润、大小相近的种子，先用质量分数75％乙醇消毒5min，无菌水冲洗2次，再用质量分数3％次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗4～5次。在24℃左右避光的条件下，于无菌水中浸种12h。

取培养至对数期的10株PGPR菌株菌液5mL，分别离心收集菌体，将菌体重悬浮于1％羧甲基纤维素钠粘稠剂内，并用无菌水调至浓度约为10⁸CFU/mL的菌悬液。在超净工作台内将预处理好的番茄种子做浸种处理：将分装好的番茄种子分别用10株PGPR的菌悬液浸泡6h，对照组在相同体积不含菌的粘稠剂中浸泡6h。将种子铺于含3层无菌滤纸(用6‰的NaCl溶液浸润)的培养皿内， 25℃避光培养5天左右，待种子生根发芽后，改用12h光照与12h黑暗交替的条件继续培养7天。每个处理做3个重复，每个培养皿内30粒种子。每天观察统计培养皿内种子的发芽和生根情况，培养结束测定根长和芽长，计算生根率和发芽率。

1.5菌株SSR-7的培养基成分及发酵条件优化。

1.5.1菌株活化。

超净工作台紫外灭菌30min后，将斜面冷冻保藏的菌种在超净工作台中接种到已配好的LB固体培养基中，在30℃条件下培养12h后，挑取单菌落进行二次划线，在同样的条件下进行培养，使冻存的细菌完全复苏；

其中，LB固体培养基的制备方法为：先在少量超纯水中加入10g蛋白胨、 5g酵母提取物和10g氯化钠，搅拌直至全部溶解，再用5mol/L的氢氧化钠调pH 至7.0，最后用超纯水定容至1L，加入15g琼脂粉，高温高压蒸汽灭菌后倒平板。

1.5.2种子液的制备。

将活化好的单菌落接种至种子培养基中，温度30℃，转速150r/min，震荡培养12h，制成种子液(菌含量＞10⁸CFU/mL)。

1.5.3培养基成分和发酵条件优化。

通过测定菌液600nm处吸光值监测菌株生长状况，通过检测菌株产IAA的能力优化菌株的培养基成分和发酵条件，IAA的测定方法参照“Glickmann E, Dessaux Y.Acritical examination of the specificity of the salkowski reagent for indoliccompounds produced by phytopathogenic bacteria[J].Applied& EnvironmentalMicrobiology,1995,61(2):793-796”报道的方法。

菌株培养的基础条件为：将菌株接种于含有100mg/L L-色氨酸的基础培养基中，种子液接种量5％(v/v)，装液量40％(v/v)，在恒温振荡培养箱中30℃、 150r/min培养12h。其中，L-色氨酸的基础培养基是将100mg L-色氨酸、2g硫酸铵、0.5g磷酸二氢钠、0.5g磷酸氢二钾、0.2g硫酸镁及0.1g氯化钙，用超纯水溶解并定容至1L。L-色氨酸需要单独配制并进行过滤灭菌，在接种培养前，加至已灭菌且温度达到室温的基础发酵培养基中。

培养基成分优化：在基础培养基中分别添加1％w/v(即1g/100mL)的碳源和氮源，在基础培养条件下培养，检测菌株生长情况和IAA产量，每个处理设置 3个重复。待优化的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乳糖和甘露醇，氮源有蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸钙和硫酸铵。

发酵条件的优化：菌株在基础培养条件下，固定其他因素和条件不变，分别优化培养时间(12、24、36、48、60h)、温度(20、25、30、35、40℃)、pH 值(4、5、6、7、8、9)和装液量(10％、20％、30％、40％、50％v/v)，每个处理设置3个重复。

发酵条件的最优组合：根据发酵条件的单因素优化结果，针对每个因素选定 3个水平，设计正交实验，考察不同因素对菌株IAA产量的影响，并确定发酵条件的最优组合。

1.6番茄幼苗盆栽实验评价SSR-7的耐盐促生效果。

1.6.1幼苗培育和耐盐促生处理。

营养土在121℃灭菌20min，取出风干，放置3天后备用。土壤灭菌后进行育苗，待番茄种子发芽后，将大小均匀的幼苗移植到含有150g无菌营养土的盆 (7.5cm×7.5cm)中，每盆4株。

移栽10天后，开始耐盐促生处理，选取长势一致的番茄幼苗，向每盆幼苗根部土壤中加入5mL菌悬液(即5×10⁸CFU/株，由于1～5×10⁸CFU/株范围内的使用效果基本相同，故在此仅以5×10⁸CFU/株的用量为例进行效果说明)，阴性对照组不加菌，加5mL无菌水。加菌和不加菌处理各3个重复，每个重复12株幼苗，2天后，所有幼苗用无菌水配置的NaCl溶液(120mmol/L)进行灌溉，使土壤含盐量约为6‰，植物在25±2℃、16h/8h的光/暗循环的培养室中培育，每隔3天补浇一次NaCl溶液(每盆30mL)，20天后，检测植株生长指标、抗氧化指标及土壤酶活性。

1.6.2耐盐促生指标分析。

番茄幼苗生长发育指标的检测：耐盐促生处理20天后，检测加菌组(菌+盐) 和不加菌组(只加盐)幼苗的生长发育指标，包括株高、根长和鲜重。

番茄幼苗叶片抗氧化指标的测定：以盆为单位，采集每盆中每株幼苗相同部位的叶片，组成混合样品，分别检测各抗氧化指标，每盆每个指标做3次技术重复。采用NBT法测定SOD活性，采用愈创木酚法测定POD活性，通过紫外吸收法来进行CAT的活性测定，采用TBA法测定MDA含量。

番茄幼苗根际土壤酶活性的测定：以盆为单位，采集每盆中幼苗根际的土壤样品，参照“关松荫.土壤酶及其研究方法[M].北京:农业出版社,1986:274-331”中记载的测定方法，分别检测脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的酶活，每盆每个指标做3次技术重复。

2.结果与分析。

2.1根际菌的促生能力鉴定。

本研究从盐地碱蓬根际土壤分离筛选获得根际菌共计22株，菌株产IAA能力与其促生特性相关度较大，因此，首先对22株根际菌进行产IAA能力的鉴定，以缩小筛选范围，结果显示10株菌有产IAA的能力，分别命名为SSR-1至SSR-10，对其产IAA能力的定量分析显示(见表1)，菌株SSR-3产IAA能力最强，菌株SSR-8的能力最弱。此外，还对这10株菌进行了产NH₃、铁载体和ACC脱氨酶能力的鉴定，结果见表1。

表1.根际菌的促生能力鉴定

菌株	产IAA(mg/L)	产NH<sub>3</sub>	产铁载体	产ACC脱氨酶
					SSR-1	40.0
SSR-2	49.0
					SSR-3	53.5			+
SSR-4	41.0	+
					SSR-5	39.0	+
SSR-6	38.0	+	+
					SSR-7	42.0	+	+
SSR-8	37.8	+
					SSR-9	39.0
SSR-10	38.8			+

注：“+”表示具有相应的促生能力。

2.2 PGPR的生理生化分析及分子鉴定。

2.2.1 PGPR的生理生化分析。

菌株的生理生化特征分析表明(见表2)，SSR-4、SSR-7和SSR-10是革兰氏阳性菌；SSR-7和SSR-10在生长过程中能产生芽孢；SSR-6、SSR-7既能水解淀粉，又能产酸；菌株SSR-2、SSR-4、SSR-8和SSR-10既不能水解淀粉，也不能产酸。

表2.PGPR的生理生化特征

菌株	革兰氏染色	芽孢染色	淀粉水解试验	甲基红试验
					SSR-1				+
SSR-2
					SSR-3				+
SSR-4	+
					SSR-5				+
SSR-6			+	+
					SSR-7	+	+	+	+
SSR-8
					SSR-9			+
SSR-10	+	+

注：+表示相应检测为阳性。

2.2.2 PGPR的分子鉴定。

对10株PGPR的16SrDNA序列进行PCR扩增，凝胶电泳后纯化回收目标条带，并进行电泳检测(见图1)。结果显示，菌株SSR-8的目标序列扩增亮度较低，其它9株菌的目标序列扩增亮度较高，均没有非特异条带，浓度检测结果符合测序要求，送生物公司测序。

将10株PGPR的16SrDNA序列在Ebiocloud中与同源性相近的模式菌株进行序列比对，并利用MEGA软件进行分子进化分析(见图2)。结果显示，SSR-1、 3、4、6、9属于泛菌属(Pantoea)，SSR-2、5、8属于假单胞菌属(Pseudomonas)， SSR-7、10属于芽孢杆菌属(Bacillus)，这表明沿海滩涂植物根际菌具有多样性。

2.3 PGPR对盐胁迫下番茄种子萌发的促生效应。

2.3.1 PGPR对盐胁迫下番茄种子生根的影响。

在质量分数6‰NaCl胁迫下进行番茄种子萌发实验，分析PGPR对种子生根的影响，生根率数据显示(图3-a)：与对照组相比，所有10株PGPR对种子生根率无显著提高作用，相反，经菌株SSR-6处理的种子，生根率显著低于对照。根长数据显示(图3-b)：经菌株SSR-5、7处理的种子萌发12天后，根长显著长于对照组，但经菌株SSR-2、6处理的种子，根长显著短于对照组。此外，本研究还分析了番茄种子的生根势，经菌株SSR-7处理的种子，生根势略优于对照组，其它菌株处理与对照组相比无显著差异。

2.3.2 PGPR对盐胁迫下番茄种子发芽的影响。

在质量分数6‰NaCl胁迫下进行番茄种子萌发实验，分析PGPR对种子发芽的影响，发芽率数据显示(图4-a)：经菌株SSR-5、7处理的种子，发芽率显著高于对照，相反，经菌株SSR-2、6处理的种子，发芽率显著低于对照。芽长数据显示(图4-b)：经菌株SSR-3、5、7处理的种子萌发12天后，芽长显著长于对照组；但经菌株SSR-1、2、6处理的种子，芽长显著短于对照组。此外，本研究还分析了番茄种子的发芽势，经菌株SSR-7处理的种子，发芽势与对照组持平，其他菌株处理均低于对照组。

2.4菌株SSR-7的培养基成分优化。

2.4.1碳源对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响。

菌株生长数据显示(图5)，果糖、蔗糖、木糖、甘露醇和乳糖均能够显著促进SSR-7的生长，葡萄糖对SSR-7生长的影响较小。说明SSR-7对果糖、蔗糖、木糖、甘露醇和乳糖的吸收利用效果较好，对葡萄糖的吸收利用效果较差。

IAA产量数据显示(图5)，果糖显著提高了IAA的产量，乳糖次之，葡萄糖、蔗糖和甘露醇对IAA的产量的影响一般，木糖对菌株IAA产量的影响最小。

综合比较不同碳源对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响，确定果糖为最佳碳源。

2.4.2氮源对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响。

菌株生长数据显示(图6)，蛋白胨和酵母粉对SSR-7菌株的生长有显著效果，硝酸钾、硝酸钙和硫酸铵对其生长影响较小，说明SSR-7易吸收有机氮源。

IAA产量数据显示(图6)，蛋白胨能显著提高菌株的IAA产量，酵母粉次之，硝酸钾、硝酸钙和硫酸铵对IAA产量的影响不大。

综合比较不同氮源对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响，确定蛋白胨为最佳氮源。

2.5菌株SSR-7的发酵条件优化。

2.5.1培养时间对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响。

实验数据显示(图7)，在0～36h内，菌株生长较快，并于36h达到最高，之后进入稳定期，随着培养时间进一步延长，OD600开始下降，菌株进入衰亡期。 IAA是活菌的次级代谢产物，在0～36h内，产量逐步提高，36h达到最高，之后趋于稳定。

2.5.2培养温度对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响。

实验数据显示(图8)，随着培养温度的升高，菌株的生长状态和IAA产量均呈先升高后降低的趋势，且在30℃时，均达到最大值。说明SSR-7的最佳培养温度为30℃，在此条件下，次生代谢产物IAA积累最多。

2.5.3 pH值对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响。

实验数据显示(图9)，随着培养基pH值的升高，菌株的生长状态和IAA产量均呈先升高后降低的趋势，且在pH值为6时，达到最大值。pH为5～9时，菌体均能够较好的生长，说明SSR-7对酸碱环境有较宽的适应范围。

2.5.4装液量对SSR-7菌株生长和IAA产量的影响。

实验数据显示(图10)，随着装液量的增加，菌株的生长状态和IAA产量呈先升高后降低的趋势，且在装液量为100mL时，达到最大值。当装液量大于100 mL时，可能导致培养基中溶氧量减少，菌体生长变慢，IAA产量较低。装液量占培养瓶容量40％时，最适合SSR-7菌体生长和IAA积累。

2.5.5最优发酵条件。

根据发酵条件的优化结果，设计正交实验，结果显示，各个因素对SSR-7的发酵培养效果的影响顺序为：pH值>装液量>培养温度>培养时间，最佳发酵条件为：培养时间36h，培养温度30℃，发酵培养基pH值为6，装液量100mL(40％v/v)。

2.6菌株SSR-7对番茄的耐盐促生效果评价。

2.6.1 SSR-7对盐胁迫下番茄幼苗生长发育的影响。

耐盐促生处理过程中，番茄幼苗的生长情况显示(图11)：处理5天，加菌组(菌+盐)和不加菌组(只加盐)幼苗的长势没有显著差别；处理5天后，随着时间的延长，两组幼苗的生长情况逐渐拉开差距，加菌组幼苗的长势优于不加菌组。

处理20天后，检测番茄幼苗的生长发育指标，结果显示(表3)，加菌组番茄幼苗的株高、根长和鲜重均显著高于不加菌组，说明盐胁迫下SSR-7菌株能显著促进番茄幼苗的生长发育。

表3.SSR-7对盐胁迫下番茄幼苗生长发育指标的影响

实验处理	株高(cm)	根长(cm)	鲜重(g)
				加菌	20.92±1.05a	20.21±3.46a	2.35±0.29a
不加菌	15.81±2.50b	14.76±2.73b	1.81±0.18b

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

2.6.2 SSR-7对盐胁迫下番茄幼苗叶片抗氧化指标的影响。

番茄幼苗叶片的抗氧化指标检测结果显示(表4)，加菌组番茄幼苗叶片中过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的酶活以及丙二醛(MDA)的含量均显著低于不加菌组，加菌组番茄幼苗叶片中过氧化氢酶(CAT)的酶活与不加菌组无显著差异。

表4.SSR-7对盐胁迫下番茄幼苗叶片抗氧化指标的影响

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

2.6.3 SSR-7对盐胁迫下番茄幼苗根际土壤中酶活的影响。

番茄幼苗根际土壤酶活性检测结果显示(表5)，加菌组番茄幼苗根际土壤中脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的酶活均显著高于不加菌组，加菌组番茄幼苗根际土壤中蔗糖酶的酶活与不加菌组无显著差异。

表5.SSR-7对盐胁迫下番茄幼苗根际土壤中酶活的影响

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

综上，本发明提供的蜡样芽孢杆菌SSR-7显著提高了番茄幼苗根际土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性，进而提高了植株根际土壤中速效氮、磷和钾含量，从而对植物的生长发育起到显著的促进作用。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种蜡样芽孢杆菌，其特征在于，其命名为SSR-7，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2021459，保藏日期2021年4月26日；

所述蜡样芽孢杆菌在缓解植物盐胁迫的应用；

所述蜡样芽孢杆菌用于产NH₃及铁载体，所述蜡样芽孢杆菌具有抗氧化活性，所述蜡样芽孢杆菌用于提高土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性。

2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌能够用于缓解番茄盐胁迫。

3.根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌的接菌量为1~5×10⁸CFU/株。

4.一种权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌接种于LB培养基中，于30℃、转速150 r/min下震荡培养12h，获得种子液；再将所述种子液以体积分数5%的接种量接种于复合培养基中，于20~35℃、pH5~9下发酵培养12~36h；

其中，所述复合培养基是在L-色氨酸的基础培养基中分别加入1%w/v的碳源和氮源，且所述L-色氨酸的基础培养基是将 L-色氨酸、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁及氯化钙按质量比为1:20:5:5:2:1混合，用超纯水溶解并定容后得到；所述碳源为果糖、蔗糖、甘露醇、乳糖或葡萄糖中的一种或几种；所述氮源为蛋白胨或酵母粉中的一种或两种。

5.一种根据权利要求4所述的发酵方法制备得到的发酵菌液。

6.一种用于缓解植物盐胁迫的微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或权利要求5所述的发酵菌液。

7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，还包括可接受的辅料。