CN108570426B - 一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂，所述菌株为玫瑰单孢菌Roseomonas sp.CH‑Si‑5菌株，从沙漠中沙生植物根际土壤中分离，鉴定获得，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月31日，保藏号为CGMCC No.14479。

Description

一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，特别涉及一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂。
背景技术
目前，土地荒漠化困扰着全世界，给经济社会发展带来威胁，土地沙化造成的沙尘暴多次袭击我国北部大中城市，对整个国家的环境造成很不利的影响，因此改善沙地，保护和增加耕地面积不仅是人类生存的需求，也是社会高度发展的要求。
我国沙地面积广大，并且沙漠中植物生长环境恶劣，土壤的不溶态磷含量较多，造成植物在沙漠中根际生态环境差，根系生长缓慢且抗旱能力差，磷是植物生长所需的重要营养元素，大多数土壤中磷素的95％以上为无效磷，植物很难吸收利用。目前，我国农用磷肥的加工主要是利用大量硫酸，以磷矿粉为主要原料加工而成，加工成本较高，长期施用不仅造成土壤板结，也会污染环境。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种可以改善沙地植物根际生长环境并且可以在植物根际与植物形成互利共生关系的具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂。
本申请的技术方案是这样实现的：
一方面，本申请提供一种具有解磷功能的菌株，所述菌株为玫瑰单孢菌Roseomonas sp.CH-Si-5菌株，从沙漠中沙生植物根际土壤中分离，鉴定获得，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年 7月31日，保藏号为CGMCC No.14479。
可选地，所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的培养条件为：培养基为LB培养基，pH7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，摇床振荡培养时160～170h，培养温度 30～35℃；摇床培养时所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的生物量达 1.0×109cfu/mL；所述LB培养基成分包括：酵母粉4.0～6.0g，蛋白胨9.0～11.0g， NaCl 9.0～11.0g，琼脂19.0～21.0g，加水至1000mL。
可选地，所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的培养条件为：培养基为LB培养基，pH7.0，接种量3mL，摇床振荡培养时间168h，培养温度30℃；摇床培养时所述Roseomonassp.CH-Si-5菌株的生物量达1.0×109cfu/mL；所述LB培养基成分包括：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，加水至1000mL。
另一方面，本申请还提供一种具有解磷功能的菌剂的制备方法，制备所述具有解磷功能的菌剂的制备方法包括：
(1)将所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株活化后接种于LB培养基中，将所述LB培养基放入试管斜面培养，得到试管菌种；所述LB培养基pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，培养温度30～35℃，摇床振荡培养时间160～170h；所述LB 培养基成分包括：酵母粉4.0～6.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl 9.0～11.0g，琼脂 19.0～21.0g，加水至1000mL；
(2)将步骤(1)中得到的试管菌种接种于肉汤培养基中，将所述肉汤培养基放入摇瓶，振荡培养至对数生长期，得到摇瓶菌种；所述肉汤培养基pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，培养温度30～35℃；所述肉汤培养基成分包括：牛肉膏2.0～4.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl 4.0～6.0g和水1000g，；
(3)将步骤(2)中得到的摇瓶菌种接种于发酵培养基中，将所述发酵培养基放入种子罐，搅拌培养至对数生长期，得到种子罐菌种；所述发酵培养基 pH 7.2～7.5，接种量9～10mL，培养温度20～40℃；所述发酵培养基成分包括：葡萄糖80.0～90.0g，(NH4)2SO4 90.0～110.0g，K2HPO410.0～30.0g，MgSO4 4.0～6.0g， NaCl 0.9～1.1g，CaCO 20.0～40.0g，酵母粉1.0～3.0g和水1000mL；
(4)将步骤(3)中的种子罐菌种接种于生产罐用培养基中，将所述生产罐用培养基放入生产罐中，得到菌剂；所述生产罐用培养基pH 7.2～7.5，接种量 9～10mL，培养温度30～35℃，搅拌培养48～60h；所述生产罐培养基成分包括：葡萄糖80.0～90.0g，(NH4)2SO490.0～110.0g，K2HPO410.0～30.0g，MgSO44.0～6.0g， NaCl 0.9～1.1g，CaCO3 20.0～40.0g，酵母粉1.0～3.0g和水1000mL。
另一方面，本申请还提供一种具有解磷功能的菌剂，所述菌剂中的活性成分为Roseomonas sp.CH-Si-5菌株，其中Roseomonas sp.CH-Si-5菌株在所述菌剂中的菌数至少为1.0×109cfu/mL。
本申请的有益效果是：本申请提供的一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂能够在沙地中使用，提高土壤中不溶态磷向可溶态磷的转化，改善沙地植物根际微生态环境，且可以在植物根际与植物形成互利共生关系，能提高普通作物的抗旱能力。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内容的情况下做类似推广，因此本申请不受下面公开的具体实施的限制。
以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不限定本申请。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买，具体如表1所示，所述表1为各试剂的商购来源信息表。
所用玉米种子为常规玉米种子。以下实验均设置3次重复，结果取平均值。以下实施例中所指的含盐量，如无特殊说明，均为质量百分含量，所指的盐为 NaCl。
表1
Figure BDA0001605250270000041
本申请提供一种具有解磷功能的菌株，所述菌株为玫瑰单孢菌Roseomonassp.CH-Si-5菌株，从沙漠中沙生植物根际土壤中分离，鉴定获得，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月31日，保藏号为CGMCC No.14479。
本申请实施例中，Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的培养条件为：培养基为LB 培养基，pH(氢离子浓度指数)7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，摇床振荡培养时 160～170h，培养温度30～35℃；摇床培养时Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的生物量达1.0×109cfu/mL；所述LB培养基成分包括：酵母粉4.0～6.0g，蛋白胨 9.0～11.0g，NaCl(氯化钠)9.0～11.0g，琼脂19.0～21.0g，加水至1000mL。
本申请实施例中，Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的培养条件为：培养基为LB 培养基，pH 7.0，接种量3mL，摇床振荡培养时间168h，培养温度30℃；摇床培养时Roseomonassp.CH-Si-5菌株的生物量达1.0×109cfu/mL；所述LB培养基成分包括：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，加水至1000mL。
本申请实施例还提供一种菌剂的制备方法，用于制备上述菌剂，其制备方法包括：
(1)将Roseomonas sp.CH-Si-5菌株活化后接种于LB培养基中，将所述 LB培养基放入试管斜面培养，得到试管菌种；所述LB培养基pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，培养温度30～35℃，摇床振荡培养时间160～170h；所述LB 培养基成分包括：酵母粉4.0～6.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl 9.0～11.0g，琼脂 19.0～21.0g，加水至1000mL；
(2)将步骤(1)中得到的试管菌种接种于肉汤培养基中，将所述肉汤培养基放入摇瓶，振荡培养至对数生长期，得到摇瓶菌种；所述肉汤培养基pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，培养温度30～35℃；所述肉汤培养基成分包括：牛肉膏2.0～4.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl 4.0～6.0g和水1000g，；
(3)将步骤(2)中得到的摇瓶菌种接种于发酵培养基中，将所述发酵培养基放入种子罐，搅拌培养至对数生长期，得到种子罐菌种；所述发酵培养基 pH 7.2～7.5，接种量9～10mL，培养温度20～40℃；所述发酵培养基成分包括：葡萄糖80.0～90.0g，(NH4)2SO4 90.0～110.0g，K2HPO410.0～30.0g，MgSO4 4.0～6.0g， NaCl 0.9～1.1g，CaCO 20.0～40.0g，酵母粉1.0～3.0g和水1000mL；
(4)将步骤(3)中的种子罐菌种接种于生产罐用培养基中，将所述生产罐用培养基放入生产罐中，得到菌剂；所述生产罐用培养基pH 7.2～7.5，接种量 9～10mL，培养温度30～35℃，搅拌培养48～60h；所述生产罐培养基成分包括：葡萄糖80.0～90.0g，(NH4)2SO490.0～110.0g，K2HPO410.0～30.0g，MgSO44.0～6.0g， NaCl 0.9～1.1g，CaCO3 20.0～40.0g，酵母粉1.0～3.0g和水1000mL。
本申请实施例还提供一种菌剂，所述菌剂中的活性成分为Roseomonas sp. CH-Si-5菌株，其中Roseomonas sp.CH-Si-5菌株在所述菌剂中的菌数至少为 1.0×109cfu/mL。
本申请实施例中，所述Roseomonas属菌株CH-Si-5可以分离于内蒙古库布其沙漠中沙生植物根系土壤中。
本申请实施例提供的一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂能够在沙地中使用，提高土壤中不溶态磷向可溶态磷的转化，改善沙地植物根际微生态环境，且可以在植物根际与植物形成互利共生关系，能提高普通作物的抗旱能力；本申请提供的菌株和菌剂不仅能提高植物对磷的利用率，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，改善植物根部营养，从而达到增产效果。
下面将通过具体实施例来进一步说明本申请。但是，需要说明的是，以下实施例是对本申请的技术方案的进一步的说明，本申请的技术方案并不因此而受到任何限制。
本申请实施例中Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的获得及鉴定：
取2016年3月从内蒙古鄂尔多斯杭锦旗独贵塔拉镇周边沙地沙柳植株根系土，将根系土梯度稀释后，取1/10000的稀释液0.1mL涂布在LB固体培养基上，摇床振荡培养时间168h，培养温度30℃，挑取单菌落划线纯化后保存。
LB培养基成分包括：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉20.0g，用水定容至1000mL，pH为7.0左右。
本申请实施例中Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的鉴定
(1)形态特征：菌体为球状，短杆状，不产生芽孢，在LB固体平板上形成粉红色，表面湿润，光滑的菌落。
(2)生理生化特征：革兰氏染色反应阴性，好氧细菌，脲酶，接触酶，氧化酶反应阳性，硝酸盐还原，明胶水解，吲哚利用反应等阴性；在LB培养基培养3天后，形成直径为0.3mm、红色、不透明、表面光滑湿润的圆形菌落。
(3)16S rDNA序列鉴定
采用如下引物：8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492 (5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，进行PCR扩增，从菌株CH-Si-5中扩增到16S rDNA基因片段，将所获得16S rDNA克隆到pGEM T-easy载体后送北京博艾远上生物科技有限公司测序。16S rDNA的部分序列见序列表的SEQ ID No：1所示的碱基序列，与GenBank中的序列比对发现，CH-Si-5的16SrDNA序列与 Roseomonas属菌株序列的同源性最高，达到99.8％。
本申请实施例Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的解磷能力测定。
筛选培养基(NBRIP)：葡萄糖10g，MgCl2·6H2O5.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，氯化钠KCl0.2g，(NH4)2SO40.1g，磷酸钙Ca3(PO4)2 5.0g，加蒸馏水至1mL， pH 7.0。
LB培养基成分：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂粉20g，用水定容至1mL，pH为7.0。
从LB固体平板上挑取单菌落到LB液体培养基中，置于30℃摇床震荡培养 2天，取出3000rpm离心5min，去除上清，用0.8％的生理盐水重新悬浮。按 1％的接种量在3mL的NBRIP液体培养基中接种初筛菌株，置于30℃，150rpm 摇床中振荡培养7天，钼锑抗比色法测发酵液中可溶性磷的含量，确定菌株的溶磷能力。以接入等体积灭活菌株为对照。试验结果如下：
Figure BDA0001605250270000081
本申请实施例中，田间试验测定Roseomonas sp.CH-Si-5菌株对白菜产量的提升：
挑取单菌落接种到3mL的LB液体培养基试管中，30℃，150rpm摇床震荡培养2天后，转接到1L的LB液体培养基中，放同上条件的摇床中震荡培养2 天，取出后3000rpm下离心5min，收集菌体，菌体用等体积的0.8％的生理盐水重新悬浮。然后1L的菌液按1:50体积兑水稀释后，均匀喷施到种植白菜地中(土地面积约为50㎡)；对照样中喷施等量的灭活菌株；白菜种植期约60天后，期间按照正常白菜生产过程管理。收集时，将白菜从土中拔出，去土后称量白菜鲜重，比较二者之间的差别。
处理 白菜重量(kg) 提高
不施肥(CK) 12.4 -
CH-Si-5 30.2 1.4倍
本实施例能够得到一种加速溶解土壤中不溶态磷向溶解态转变的 Roseomonassp.CH-Si-5菌株，该菌株可以改善土壤根际的微生态环境，在植物根际与植物形成互利共生关系，使用菌量低，操作简便、成本低。
本申请实施例还提供一种菌剂，所述菌剂中的活性成分为Roseomonas sp.CH-Si-5菌株，其中Roseomonas sp.CH-Si-5菌株在所述菌剂中的菌数至少为 1.0×109cfu/mL。
本申请实施例的菌剂的制备方法，包括斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品等步骤，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。
(1)将菌株Roseomonas sp.CH-Si-5在LB培养基平板上培养，备用，所述 LB培养基成分：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂粉20g，用水定容至1mL，pH为7.0，接种量3mL，培养温度30℃，摇床振荡培养时间168h，得到试管菌种。
(2)挑取LB培养基平板上的单菌落接种于100mL肉汤培养基中，恒温振荡培养至对数生长期，准备接种种子罐，所述肉汤培养基成分包括：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g和水1000g，所述肉汤培养基pH 7.0，接种量3mL，培养温度30℃，得到摇瓶菌种。
(3)配制发酵培养基，所述发酵培养基成分包括：葡萄糖80.0g，(NH4) 2SO4100.0g，K2HPO420.0g，MgSO45.0g，NaCl 1.0g，CaCO3 30.0g，酵母粉2.0g 和水1000mL，pH 7.2，将400mL发酵培养基加入500mL种子罐中，121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将步骤(2)中的摇瓶菌种按10％的接种量接种入种子罐中的发酵培养基中，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1：0.8(空气和培养液的体积比)，得到种子罐菌种。
(4)生产罐(生产罐容量5吨)所用培养基成分与步骤(3)中发酵培养基相同(投料量4.5吨)，投料后的生产罐在1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用；将到达对数期的种子罐菌种按10％的接种量接入生产罐，接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：1.2(空气和培养液的体积比)，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为50小时；发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。
(5)发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
本实施例中的Roseomonas sp.CH-Si-5菌株和菌剂，可以直接在沙地中使用，改善沙地微生态环境，提高沙地中普通植物利用土壤中磷的能力和提高沙生植物本身的抗旱能力，并且使用菌量低，操作简便，成本低。
以上公开的本申请优选实施例只是用于帮助阐述本申请。可选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该申请仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本申请的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本申请。本申请仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 鄂尔多斯市亿鼎生态农业开发有限公司；亿利资源集团有限公司
<120> 一种具有解磷功能的菌株、菌剂的制备方法及菌剂
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taccttgtta cgactt 16
<210> 3
<211> 628
<212> DNA
<213> 红球菌（Roseomonas sp.）
<400> 3
agtaccgcgt aggaatgtgt ccagaggtgg gggacaacct tgggaaactg aggctaatac 60
cgcatatgag ctgaggctca aagcagcgat gcgcctttgg agtagcctgc gtccgattag 120
ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatcggt agctggtctg agaggacgac 180
cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 240
tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatc 300
gtaaagcact ttcgacgggg acgatgatga cggtacccgt agaagaagcc ccggctaact 360
tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt actcggaatt actgggcgta 420
aagggcgcgt aggcggcgct ccaagttagg cgtgaaagtc ctgggctcaa cctgggaact 480
gcgcttgata ctggagtgct tgaggatgga agagggtcgt ggaattccca gtgtagaggt 540
gaaattcgta gatattggga agaacaccgg tggcgaaggc ggcgacctgg tccattactg 600
acgctgaggc gcgacagcgt ggggagca 628

Claims (5)

1.一种具有解磷功能的菌株，其特征在于，所述菌株为玫瑰单孢菌(Roseomonas sp.)CH-Si-5菌株，从沙漠中沙生植物根际土壤中分离，鉴定获得，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月31日，保藏号为CGMCC No.14479。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的培养条件为：培养基为LB培养基，pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，摇床振荡培养时160～170h，培养温度30～35℃；摇床培养时所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的生物量达1.0×109cfu/mL；所述LB培养基成分包括：酵母粉4.0～6.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl 9.0～11.0g，琼脂19.0～21.0g，加水至1000mL。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的培养条件为：培养基为LB培养基，pH 7.0，接种量3mL，摇床振荡培养时间168h，培养温度30℃；摇床培养时所述Roseomonas sp.CH-Si-5菌株的生物量达1.0×109cfu/mL；所述LB培养基成分包括：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，加水至1000mL。
4.一种具有解磷功能的菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将如权利要求1所述的菌株活化后接种于LB培养基中，将所述LB培养基放入试管斜面培养，得到试管菌种；所述LB培养基pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，培养温度30～35℃，摇床振荡培养时间160～170h；所述LB培养基成分包括：酵母粉4.0～6.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl 9.0～11.0g，琼脂19.0～21.0g，加水至1000mL；
(2)将步骤(1)中得到的试管菌种接种于肉汤培养基中，将所述肉汤培养基放入摇瓶，振荡培养至对数生长期，得到摇瓶菌种；所述肉汤培养基pH 7.0～7.2，接种量2.5～3.5mL，培养温度30～35℃；所述肉汤培养基成分包括：牛肉膏2.0～4.0g，蛋白胨9.0～11.0g，NaCl4.0～6.0g和水1000g；
(3)将步骤(2)中得到的摇瓶菌种接种于发酵培养基中，将所述发酵培养基放入种子罐，搅拌培养至对数生长期，得到种子罐菌种；所述发酵培养基pH 7.2～7.5，接种量9～10mL，培养温度20～40℃；所述发酵培养基成分包括：葡萄糖80.0～90.0g，(NH4)2SO4 90.0～110.0g，K2HPO410.0～30.0g，MgSO44.0～6.0g，NaCl 0.9～1.1g，CaCO 20.0～40.0g，酵母粉1.0～3.0g和水1000mL；
(4)将步骤(3)中的种子罐菌种接种于生产罐用培养基中，将所述生产罐用培养基放入生产罐中，得到菌剂；所述生产罐用培养基pH 7.2～7.5，接种量9～10mL，培养温度30～35℃，搅拌培养48～60h；所述生产罐培养基成分包括：葡萄糖80.0～90.0g，(NH4)2SO490.0～110.0g，K2HPO410.0～30.0g，MgSO44.0～6.0g，NaCl 0.9～1.1g，CaCO3 20.0～40.0g，酵母粉1.0～3.0g和水1000mL。
5.一种具有解磷功能的菌剂，其特征在于，所述菌剂根据权利要求4的制备方法得到，所述菌剂中的活性成分为如权利要求1所述的菌株，其中所述菌株在所述菌剂中的菌数至少为1.0×109cfu/mL。
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Marı＇a Laura Pe＇rez等.Diversity of endophytic fungal and bacterial communities in Ilex paraguariensis grown under field conditions.《World J Microbiol Biotechnol》.2016,第32卷第1-15页，尤其是第4页左栏第1段，第8页右栏最后一段，第10页表1. *

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