CN111893063B

CN111893063B - 一种玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104及其应用

Info

Publication number: CN111893063B
Application number: CN202010713144.7A
Authority: CN
Inventors: 潘信利; 李菲; 胡文进; 黄媛林; 李喆; 陆璐; 王巧贞; 黄庶识; 姜发军; 赖俊翔
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111893063A

Abstract

本发明属于微生物修复技术领域，通过活性筛选的方法从广西钦州红树林土壤中分离得到一种具有耐受重金属铅的有益菌株，经鉴定，该菌株为玫瑰单胞菌新菌株Roseomonas sp.M0104。本发明进一步研究了上述菌株的发酵条件、对重金属铅的吸附和耐受能力，以及对植物生长的影响，其能够耐受大于600mg/L的重金属铅离子。对水中重金属铅离子的去除率达到84.2％；同时对植物无毒害作用并能促进种子的萌发，将该菌应用于重金属污染修复上具有使用方便、成本低和环境兼容性好的优点，对解决目前重金属污染具有重要的实用价值。

Description

一种玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104及其应用

技术领域

本发明涉及微生物修复技术领域，更具体地，涉及一种玫瑰单胞菌Roseomonassp.M0104 及其应用。

背景技术

随着工业化的迅速发展和人民生活水平的不断提高，日渐加重的环境污染严重破坏生态环境并威胁着人类的生命健康。环境污染，特别是重金属污染，对生物体具有明显的毒性，且不易降解。另外，被重金属污染的土壤和河流，会对植物的生长造成不利影响，限制了土地和水源的应用。铅污染是常见的污染形式，具有广泛性、持续时间长和难治理性，可对人的神经系统、消化系统、免疫系统、骨骼系统以及血液系统等产生毒性作用，严重时会导致死亡。因此急需研究和开发高效的土壤重金属修复制剂和治理方法。

目前已发展出的多种治理重金属污染的方法包括物理法、化学法、植物和微生物修复法。微生物修复法相对于其它三种处理方法，具有费用低、易操作、不会造成二次污染、不破坏生态系统、适用性广和选择性强等优点。微生物修复技术是指利用对重金属具有抗性的微生物群，通过生物吸附、胞外沉淀、外排、生物转化或累积来降解环境中的重金属，这些微生物能够耐受重金属的毒性，在重金属污染的环境中生长繁殖。此外，微生物特别是细菌在治理土壤重金属修复方面应用较广。细菌具有高代谢能力和代谢活性特异性，能够与植物联用，帮助植物应对环境中的重金属胁迫；通过产生植物激素、合成铁载体、将难溶磷转换成可溶磷促进植物的生长；还可通过转换土壤中重金属的形态，促进植物对重金属的富集和吸收，提高土壤修复效率；现有能够用于重金属修复的微生物种类较少，且修复效果不好。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中能够用于修复重金属的微生物种类少，且修复效果不好，提供一种新的能够耐受并吸附重金属铅的菌株。

本发明的第二个目的是提供上述菌株的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104，所述菌株于2019年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。保藏编号为CCTCC NO：M2019761。

优选的，所述菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：3所示。以所述的玫瑰单胞菌菌株的基因组总DNA为模板扩增其16S rDNA序列，进行测序，获取长度为1484bp的16S rDNA序列，见序列表，其与Ezclouddatabse数据库收录的相关菌株进行同源性比对分析，确定该菌隶属Roseomonas菌属，与该属标准模式菌Roseomonas deserti M3同源性分别为96.18％，与Roseomonas属的其它菌株同源性均低于96％。

所述玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104为革兰氏染色阴性菌，呈杆状，不产生孢子，无运动性。在ISP2培养基上培养3～5天后，菌落为圆形、边缘整齐、略微凸起的淡粉色菌落。菌体生长温度范围在10～45℃，最适温度生长是28℃；pH生长范围5.0～10，最佳pH值为 7.0，可耐受1～10％的NaCl。

所述玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104能够利用阿拉伯糖、脱氧-D-核糖、D-木糖、阿东糖醇、熊果苷、水杨苷、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-棉子糖和D-岩藻糖，具有氧化酶和过氧化氢酶活性，含有辅酶Q-10(呼吸醌)、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷酸类脂等(磷酸类脂)，以及棕榈酸、油酸、硬脂酸等(脂肪酸)。

本发明还提供所述玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104吸附重金属铅的应用；本发明经研究发现玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104能够耐受大于600mg/L的重金属铅离子。对水中重金属铅离子的去除率达到84.2％。

本发明还提供所述玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104修复重金属污染土壤的应用，从而用于吸附土壤中的重金属铅，以降低土壤中重金属铅的含量，使得土壤更适合于植物生长。

本发明还提供所述玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104在促进种子萌发的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过活性筛选的方法从广西钦州红树林土壤中分离得到一种具有耐受重金属铅的有益菌株，经鉴定，该菌株为玫瑰单胞菌新菌株Roseomonas sp.M0104。本发明进一步研究了上述菌株的发酵条件、对重金属铅的吸附和耐受能力，以及对植物生长的影响，其能够耐受大于600mg/L的重金属铅离子。对水中重金属铅离子的去除率达到84.2％；同时对植物无毒害作用并能促进种子的萌发，将该菌应用于重金属污染修复上具有使用方便、成本低和环境兼容性好的优点，对解决目前重金属污染具有重要的实用价值。

附图说明

图1为以最大似然法构建的玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104的系统发育树；

图2为玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104的菌落形态；

图3为使用扫描电镜观察玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104在铅胁迫下生长的细胞形态；图3(a)为在正常ISP2固体培养基上生长的细胞形态，图3(b)为在含有600mg/L铅离子的ISP2固体培养基上生长的细胞形态；

图4为玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对重金属铅的耐受能力；

图5为使用原子吸收光谱检测玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对重金属铅的吸附率，图中不同的字母代表数据处理的差异性；

图6为玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104在重金属胁迫下对玻璃生菜种子萌发的促进效果图；图6(a)为纯水处理的种子，图6(b)为使用M0104菌液处理的种子。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104的分离、筛选及鉴定

一、分离和筛选

采集广西北部湾红树林植物根须表面附着的土壤(距离根须5mm以内)，称取2.0g土壤样品装于20ml无菌水(内有玻璃珠)的锥形瓶中，手动摇匀；依次制成10^-2和10^-3稀释度的样液。取200μl样品置于6种不同培养基中进行涂布，放入28℃培养箱中培养20天，观察菌落形态特征，挑取菌落进行纯化。纯化后的菌株置于20％(v/v)甘油中，-80℃冷冻保藏。

二、分类鉴定

1、纯化后菌株M0104的基因型分析

使用通用引物27f(SEQ ID NO：1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(SEQ IDNO：2：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对以纯化后的菌株为模板的DNA进行扩增，测序，获得长度为1484bp的16S rDNA序列，如SED ID NO：3所示。

所得序列通过Blast与NCBI网上储存的已知序列比对，经分析发现纯化后的菌株与 Roseomonas属的模式菌株Roseomonas deserti的相似度为96.18％，与该属其它菌的相似度均小于96％。在MEGA 7.0软件上使用最大释然法(Maximum-likelihood)建立系统发育树，菌株与Roseomonas deserti聚类在一个分枝上。系统发育树见附图1。经过进化分析发现，菌株 M0104为玫瑰单胞属Roseomonas的新菌种，具有新种的典型特点，暂定命名为玫瑰单胞菌 Roseomonas sp.M0104。

2、玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104的生理生化测定

将玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104菌株于ISP2固体培养基中活化，28℃恒温培养箱中培养72h。通过观察发现该菌的生长温度范围在10～45℃，最适生长温度是28℃；pH生长范围为5～10，最佳pH值为7.0；可耐受的NaCl浓度范围为1～10％。

使用显微镜观察发现该菌株菌落为圆形、杆状的淡粉色菌落，菌落形态参见附图2。所述ISP2固体培养基成分包括：酵母提取物2g，葡萄糖2g，胰蛋白胨2g，琼脂15g，加蒸馏水至1000ml。

使用Biolog微生物鉴定仪GNIII测试板鉴定、API ZYM活性酶试剂条和API 50CH细菌糖代谢试剂条检测玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104能利用的碳源以及各种酶活性。结果显示：玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104能够利用阿拉伯糖、脱氧-D-核糖、D-木糖、阿东糖醇、熊果苷、水杨苷、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-棉子糖和D-岩藻糖，具有氧化酶和过氧化氢酶活性，含有辅酶Q-10(呼吸醌)、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷酸类脂等(磷酸类脂)，以及棕榈酸、油酸、硬脂酸等(脂肪酸)。

基于16S rRNA基因序列的系统发育分析和各种微生物学特性分析结果，表明本实施例分离得到的玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104确定为玫瑰单胞菌属的一株典型的新菌种，该菌于2019年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉，武汉大学，邮编：430072，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019761。

实施例2玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对重金属铅的耐受能力分析

活化后的玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104通过划线方式转接至含有不同浓度铅离子的 BE培养基上，将细菌接种至不含有铅的BE培养基作为对照组，放置于恒温培养箱中28℃ 培养72小时，并观察细菌的生长形态。BE琼脂培养基配方为：胰蛋白胨10g，去离子水1000 mL，琼脂粉14g。

结果如图4，从图4看出，其能够耐受大于600mg/L的重金属铅离子，且在培养的40h内，菌对重金属铅的耐受能力不断增强，到培养至70h左右，耐受能力有小幅下降，但下降不明显。

实施例3玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对重金属铅的吸附能力分析

玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104转接至BE液体培养基中于28℃摇床中振荡培养72 小时。72h后吸取1ml发酵液母液分别接种至含有0～600mg/L Pb²⁺的ISP2培养基中，28℃摇床中摇培72h后离心(10000rpm，15min)，使用原子吸收光谱检测上清液中Pb²⁺的含量。

结果如图5，从图5看出，玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对0～600mg/L Pb²⁺的的去除率均高于80％。

实施例4玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对植物生长的促进实验

供试植物为玻璃生菜，选取颗粒饱满的玻璃生菜种子，用无菌水反复冲洗数次后，用2％的次氯酸钠消毒半小时，再用无菌水冲洗3次。

将玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104采用划线培养的方式在ISP2琼脂平板上于28℃下培养5天，然后使用5ml无菌水冲洗平板，使用无菌水稀释，OD₆₀₀检测细菌浓度，最后获得5×10⁴CFU/ml的菌液。

在直径为12cm的无菌培养皿上铺入双层无菌滤纸，每培养皿放入30粒玻璃生菜种子。一部分培养皿中加入2ml上述制备菌液，另一部分加入2ml无菌水，每组5个重复，放置于 28℃的温室中培养，3天后计算种子发芽率(结果见表1)。

表1玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104对玻璃生菜种子发芽的促进效应

处理	发芽率(％)	株高(cm)
			清水组	87.9±4.36	2.07±0.39
加菌组	90.7±2.44	2.07±0.22

结果表明种子经过玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104处理后，种子的发芽率高于清水组，两组的植株高度无明显差别，因此该菌株对植物无害，并且能够促进植物种子的萌发。

序列表

<110> 广西科学院

<120> 一种玫瑰单胞菌Roseomonas sp. M0104及其应用

<130> ZM201250I

<141> 2020-07-22

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Roseomonas sp

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Roseomonas sp

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1484

<212> DNA

<213> Roseomonas sp

<400> 3

tagagtttga tcctggctca gagtgaacgc tggcggcatg cttaacacat gcaagtcgtg 60

cggggggctt cggccctcag cggcggacgg gtgagtaacg cgtagggatg tgtccagggg 120

tgggggataa cgccgggaaa ctggcgctaa taccgcatat gggttgaggc ccaaagcctt 180

cgggcgcctt tggagtaacc tgcgttcgat taggtagttg gtggggtaaa ggcctaccaa 240

gccgacgatc gatagctggt ctgagaggac gatcagccac actgggactg ggacacggcc 300

cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag 360

caatgccgcg tgggtgaaga aggtcttcgg atcgtaaagc cctttcggcg gggacgatga 420

tgacggtacc cgcagaagaa gccccggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa 480

gggggctagc gttactcgga attactgggc gtaaagggcg cgtaggcggc gctccaagtt 540

aggcgtgaaa gtcctgggct caacctggga actgcgctta agactggagt gcttgaggat 600

ggaagaggct cgtggaattc ccagtgtaga ggtgaaattc gtagatattg ggaagaacac 660

cggtggcgaa ggcggcgagc tggtccatta ctgacgctga ggcgcgatag cgtggggagc 720

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtgcgctgg atgttggggc 780

ccctagggtc tcagtgtcgt agccaacgca gtaagcgcac cgcctgggga gtacggccgc 840

aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900

ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagcc cttgacatgg tcacggccgg cgcagagatg 960

cgctttcccc gcaaggggcg tgatgcacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg cctttagttg ccagcacgtt 1080

tgggtgggca ctctagagga actgccggtg acaagccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

agtcctcatg gcccttatgg gctgggctac acacgtgcta caatggcggt gacagtggga 1200

cgccaggtcg cgaggccgag ccgatcccca aaagccgtct cagttcagat tgcagcctgc 1260

aactcggctg catgagggtg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata 1320

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agttggttct accttaagca 1380

ggtgcggtaa ccgcaagggg ctagcctgcc acggtagggt cagcgactgg ggtgaagtcg 1440

taacaaggta gccgtagggg aacctgcggc tggatcacct cctt 1484

Claims

1.一株玫瑰单胞菌（Roseomonas sp.）M0104，其特征在于，所述菌株于2019年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2019761。

2.权利要求1所述玫瑰单胞菌（Roseomonas sp.）M0104在吸附重金属铅中的应用。

3.权利要求1所述玫瑰单胞菌（Roseomonas sp.）M0104在修复重金属污染土壤中的应用。

4.权利要求1所述玫瑰单胞菌（Roseomonas sp.）M0104在促进种子萌发中的应用。