CN114891655B - 一种窄食单胞菌sy1固定化菌剂在镉、铬污染净化中的应用 - Google Patents

一种窄食单胞菌sy1固定化菌剂在镉、铬污染净化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一种窄食单胞菌SY1固定化菌剂在镉、铬污染净化中的应用。本发明提供了一株窄食单胞菌SY1的固定化菌剂，该菌剂能够高效去除环境中镉、铬的单一型及复合型污染。试验表明，上述菌株制备的固定化菌剂具有去除镉、铬的能力，该菌剂可减少水体中镉、铬，可作为水体中镉、铬污染净化的新型微生物菌剂。

Description

一种窄食单胞菌SY1固定化菌剂在镉、铬污染净化中的应用
技术领域
本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一种窄食单胞菌SY1固定化菌剂在镉、铬污染净化中的应用。
背景技术
镉，由于其良好的韧性和延展性，在电池制造、金属电镀、颜料制造等工业生产中被广泛应用。然而镉具有较大的毒性，为人体非必需元素，在生物体内的半衰期可长达20～40年，容易在人体的骨骼、肝脏和肾脏等器官内逐年累积，易造成慢性损伤。20世纪50年代时，日本富山县举世震惊的“痛痛病”正是由于通川流域镉污染所导致，环境镉污染严重危害着生态环境和人类健康。镉在天然水中含量甚低，水中镉的污染来源主要是含镉工业废水，其次是含镉矿渣的污染。目前，含镉废水的处理方法有膜分离法、吸附法、生物法、沉淀法、电絮凝法及离子交换法等。其中，化学沉淀法作为传统方法，具有工艺简单，操作方便等优点，它仍是目前应用最为广泛的方法，但其易造成二次污染、对pH敏感。([参考文献：李艳飞.突发水镉污染事件环境风险评价研究进展[J].职业与健康，2021,37(13):1856-1858)因此，寻找节能、环保、高效的除镉方法，仍是工业废水治理中亟待解决的问题。
铬，由于不同价态的铬盐具有不同的颜色，在制革行业和印染行业中常被用作漂染剂，此外还在电镀、冶金等工业领域被广泛使用。不同价态的镉毒性差异很大，三价铬是人体必需微量元素，对糖类、氨基酸代谢有促进作用；而六价铬具有强氧化性，其的毒性为三价铬的百倍，且具有更高的可迁移性和难降解性，对人体有致敏、致突变、致癌和致畸等危害，同时被列为我国五种重点重金属污染物之一。目前铬工业废水处理技术主要有离子交换法、膜分离技术、电解法、吸附还原法和生物方法。由于离子交换法限于周期性长，膜分离法和电解法存在维护成本过高，生物法尚不成熟、多停留在实验室层面，目前对于六价铬污染的治理仍主要依赖于吸附还原的方法，但该方法也存在吸附材料易被废水中其他物质影响，生产材料中存在副产物等缺点(参考文献：董文平等，六价铬废水处理技术研究进展[J].低碳世界，2021,11(06):32-33)。
目前对于重金属镉、铬单一型环境污染的微生物修复技术已有大量报道，但对于镉、铬复合污染的微生物修复的研究仍有不足，尤其在窄食单胞菌属内，没有能同时去除镉、铬的菌株报道(见表1)；此外，由于传统微生物菌剂在污水环境中容易退化、失活，而固定化微生物技术为微生物重复利用、较长期保存及使用开辟了新思路。本发明正是据此研制并改进了一种环保、高效、低成本的重金属复合污染修复的微生物固定化菌剂。
表1相关专利文献中微生物对镉或铬修复情况表
发明内容
本发明的目的在于分离筛选能高效去除环境中镉和/或铬的菌株，通过微生物固定化技术，克服传统微生物制剂在环境中易退化、失活并可能造成当地微生物群落结构改变等问题，从而实现水体环境中对镉、铬污染的绿色修复。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明的前期工作是分离、筛选得到一株能高效去除水体环境中镉和/或铬的微生物菌株，根据经典微生物学形态特征分类和生物信息学分类，申请人对该菌株定名为窄食单胞菌 SY1，Stenotrophomonas sp.SY1(参考文献：Cai L,Liu G,Rensing C.etal.Genes involved in arsenic transformation and resistance associated withdifferent levels of arsenic-contaminated soils. BMC Microbiol.2009,9,4)。
本发明的窄食单胞菌SY1筛选方案参见图1。分离株SY1采集分离于湖北省荆门市沙阳县某猪场土壤样品中。取前述土壤样品100g在终浓度为500mg/kg的NaAsO2，28℃下富集培养一周，在此孵育过程中，将灭菌后的水加到锥形瓶中，保持水分值不变。取10g富集的土壤加至250mL 0.85％NaCl溶液于锥形烧瓶，置于摇床160rpm摇动30min。取1mL的混合液加至9mL 0.85％NaCl溶液梯度稀释，涂布于含终浓度为800μM NaAsO2的CDM固体培养基平板 (溶液A：MgSO4·7H2O 20g/L，NH4Cl 10g/L，Na2SO4 10g/L，K2HPO4·3H2O 0.13g/L，CaCl2·2H2O 0.67g/L，Na lactate 50g/L；溶液B：FeSO4·7H2O 1.33g/L；溶液C：NaHCO379.81 g/L；CDM：100mL溶液A，2.5mL溶液B，10mL溶液C，补充超纯水至1L，调pH至7.2)， 28℃孵育一周，挑选单个菌落并重复划线几次以获得纯分离株。分别对实验室分离的各菌株进行镉去除能力试验，即在起始镉浓度为100μM的LB培养基中分别接种各菌株，置于28℃150rpm/min摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm/min离心1min，吸取上清过滤，取滤液用火焰原子吸收仪检测溶液剩余镉含量，挑选能使镉去除80％以上菌株，作为初步筛选菌株。在起始铬浓度为100μM的LB培养基中分别接种初步筛选菌株，置于28℃150rpm/min摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm/min离心1min，吸取上清，通过二苯羰酰二肼法检测溶液剩余铬含量，挑选能使铬去除80％以上菌株，作为二次筛选菌株。在起始镉浓度为50 μM，起始铬浓度为100μM的LB培养基中分别接种二次筛选菌株，置于28℃150rpm/min摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm/min离心1min，吸取上清过滤，取滤液用火焰原子吸收仪检测溶液剩余镉含量，通过二苯羰酰二肼法检测溶液剩余铬含量，最终筛选能使二者均去除80％以上菌株，得到最终筛选菌株。
对检测出的镉、铬去除菌进行16S核糖体RNA基因序列鉴定(菌株SY1的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:1所示)，结合形态学和基因组分析等相关鉴定工作，最终得到窄食单胞菌SY1。
本发明的积极效果：
本发明筛选到的窄食单胞菌SY1，能够在48h内对培养基中50μM镉+100μM铬基本完全去除。将SY1菌株应用到废水模拟中，利用葡萄糖改性固定化窄食单胞菌SY1菌剂的加入，能够分别在60h和36h时使含8.9μM的镉+40μM的铬的废水中的镉和铬完全去除。而本发明制备的活性炭改性固定化菌剂的使用，在96h时能使含8.9μM的镉+40μM的铬的废水镉去除率达90.07％，在96h时能使该废水铬去除率达95.90％，使铬达到了我国《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)V类水的标准(≤0.1mg/L)；在二次循环使用中，可使含8.9μM的镉+40μM的铬的废水镉去除率达61.40％，铬去除率达93.38％，使铬达到了我国《地表水环境质量标准》 (GB 3838-2002)V类水的标准(≤0.1mg/L)。另外本发明的窄食单胞菌SY1菌株(菌剂)能够利用豆粕、玉米粉等农业废料进行发酵培养，可大大降低菌剂的生产成本。
本发明的窄食单胞菌SY1固定化菌剂可高效去除污水中的镉、铬，在复杂污染环境修复中具有较大的应用潜力。本发明通过在固定化小球中添加能源类物质，能有效提高铬的还原，并为固定化菌剂的循环利用提供了可能；同时固定化小球性质稳定，能避免直接投放菌株对环境造成富营养化等不利影响。因此本发明具有操作简单、原料低廉易得、安全环保等优点。
附图说明
图1：本发明的技术路线图。
图2：本发明的窄食单胞菌SY1的系统发育进化树图。
图3：本发明的窄食单胞菌SY1的菌落形态图和革兰氏染色图。附图标记说明：图3中的A 图为SY1菌株平板划线图；图3中的B图为SY1菌株的革兰氏染色图。
图4：本发明的窄食单胞菌SY1菌株在制备为固定化菌剂后的形态图。附图标记说明：图 4中的A图从左至右依次为未包埋细菌的海藻酸钠小球、含5％葡萄糖的海藻酸钠小球和含7.5％生物炭的海藻酸钠小球；图4中的B图从左至右依次为包埋了窄食单胞菌SY1菌株的海藻酸钠小球、含5％葡萄糖的海藻酸钠小球和含7.5％生物炭的海藻酸钠小球。
图5：本发明的窄食单胞菌SY1菌株在LB培养基中镉、铬去除的曲线图。附图标记说明：图5中的A图为起始镉浓度为50μM时窄食单胞菌SY1菌株对镉的去除曲线和生长曲线图；图5 中的B图为起始镉浓度为100μM时窄食单胞菌SY1菌株对镉的去除曲线和生长曲线图；图5中的C图为将窄食单胞菌SY1菌株培养一段时间后，加入起始镉浓度为100μM时窄食单胞菌SY1 菌株对镉的去除曲线和生长曲线图；图5中的D图为起始铬浓度为100μM时窄食单胞菌SY1菌株对铬的去除曲线和生长曲线图；图5中的E图为起始铬浓度为500μM时窄食单胞菌SY1菌株对铬的去除曲线和生长曲线图；图5中的F图为起始镉浓度为50μM，起始铬浓度为100μM时窄食单胞菌SY1菌株对镉、铬的去除曲线和生长曲线图。
图6：本发明的窄食单胞菌SY1菌株在制备为固定化菌剂后在模拟废水中镉、铬去除的曲线图。附图标记说明：图6中的A图为利用海藻酸钠包埋法包埋窄食单胞菌SY1，在模拟镉、铬废水环境中对镉的去除效果曲线图；图6中的B图为利用海藻酸钠包埋法包埋窄食单胞菌 SY1，在模拟镉、铬废水环境中对铬的去除效果曲线图。
图7：本发明的窄食单胞菌SY1菌株在制备葡萄糖改性固定化菌剂后在模拟废水中镉、铬去除效果的曲线图。附图标记说明：图7中的A图为利用海藻酸钠包埋法包埋窄食单胞菌SY1 菌株+5％葡萄糖，在模拟镉、铬废水环境中对镉的去除效果曲线图；图7中的B图为利用海藻酸钠包埋法包埋窄食单胞菌SY1菌株+5％葡萄糖，在模拟镉、铬废水环境中对铬的去除效果曲线图。
图8：本发明的窄食单胞菌SY1菌株在制备为活性炭改性固定化菌剂后在模拟废水中镉、铬去除效果的曲线图。附图标记说明：图8中的A图为利用海藻酸钠包埋法包埋窄食单胞菌SY1 菌株+7.5％生物炭，在模拟镉、铬废水环境中对镉的去除效果曲线图；图8中的B图为利用海藻酸钠包埋法包埋窄食单胞菌SY1菌株+7.5％生物炭，在模拟镉、铬废水环境中对铬的去除效果曲线图。
图9：本发明的窄食单胞菌SY1菌株在制备为活性炭改性固定化菌剂后在模拟废水中循环使用的效果曲线图。图9中的左图为利用完成一轮去除后的生物炭改性固定化小球，在模拟镉、铬废水环境中循环使用对镉的去除效果曲线图；图9中的右图为利用完成一轮去除后的生物炭改性固定化小球，在模拟镉、铬废水环境中循环使用对镉的去除效果曲线图。
具体实施方式
对序列表SEQ ID NO:1序列的说明。
序列表SEQ ID NO:1是窄食单胞菌SY1的16S核糖体RNA的序列。
实施例1：窄食单胞菌SY1的分离鉴定
⑴分离纯化：菌株分离于湖北省荆门市沙阳县某猪场采集的砷污染的表层土壤，分离时间为：2009年1月。取上述土壤样品100g于终浓度为500mg/kg的NaAsO2，置于28℃下富集培养一周，在此孵育过程中，持续加入灭菌后的水，保持水分值不变。取10g上述富集的土壤加至250mL 0.85％NaCl溶液于锥形烧瓶，置于160rpm摇床摇动30min。取1mL的混合液加至 9mL 0.85％NaCl溶液梯度稀释，涂布于含终浓度为800μM NaAsO2的CDM固体培养基平板 (配方：溶液A：MgSO4·7H2O 20g/L，NH4Cl 10g/L，Na2SO4 10g/L，K2HPO4·3H2O 0.13g/L，CaCl2·2H2O 0.67g/L，Na lactate 50g/L；溶液B：FeSO4·7H2O 1.33g/L；溶液C：NaHCO379.81 g/L；CDM：100mL溶液A，2.5mL溶液B，10mL溶液C，补充超纯水至1L，调pH至7.2)， 28℃孵育一周，分离具有砷抗性菌株。挑取单个菌落并重复划线几次以获得纯分离株。
⑵镉和/或铬去除菌株的筛选：分别对实验室分离的各菌株进行镉去除能力试验，即在起始镉浓度为100μM的LB培养基中分别接种各菌株，置于28℃150rpm/min摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm/min离心1min，吸取上清过滤，取滤液用火焰原子吸收仪检测溶液剩余镉含量，挑选能使镉去除80％以上菌株，作为初步筛选菌株。在起始铬浓度为100μM 的LB培养基中分别接种初步筛选菌株，置于28℃150rpm/min摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm/min离心1min，吸取上清，通过常规二苯羰酰二肼法检测溶液剩余铬含量，挑选能使铬去除80％以上菌株，作为二次筛选菌株。在起始镉浓度为50μM，起始铬浓度为100μM 的LB培养基中分别接种二次筛选的菌株，置于28℃150rpm/min摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm/min离心1min，吸取上清过滤，取滤液用火焰原子吸收仪检测溶液剩余镉含量，通过二苯羰酰二肼法检测溶液剩余铬含量，最终筛选能使二者均去除80％以上镉和/或铬含量的菌株，将得到最终筛选菌株命名为窄食单胞菌SY1，Stenotrophomonassp.SY1。
⑶镉和/或铬去除菌的分类鉴定：利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物(正向引物)27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和(反向引物) 1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')进行PCR(具体PCR方法参见华中农业大学授权专利ZL2005101205847(发明名称：一种土壤总DNA小量快速提取方法，授权公告日：2008年7 月31日)。扩增窄食单胞菌SY1的16S rDNA并测序，再与NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 核苷酸数据库进行比对，表明本发明分离的窄食单胞菌SY1的核苷酸序列与NCBI登陆的菌株同源性为99.64％。故采用MEGA 6.0软件构建了SY1系统发育进化树，发现本发明分离的窄食单胞菌SY1菌株能稳定地与窄食单胞菌属的菌株聚在一起(见图2)，本发明将该菌株鉴定为窄食单胞菌Stenotrophomonas sp.SY1。对分离的菌株进行分类学鉴定(对该分离株进行革兰氏染色分析和生长特性鉴定，结果见图3)。
窄食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)SY1的菌学特征：
本发明分离的窄食单胞菌SY1菌株在LB培养基中菌落为黄色，圆形，直径约为0.2-0.3cm，边缘光滑，表面蜡状，革兰氏阴性菌(见图3)，能够在LB、R2A、10/1TSB或CDM培养基中生长。
窄食单胞菌SY1的保藏：
窄食单胞菌SY1在LB液体或固体培养基上在28℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管(具体方法请参见：赵斌，何绍江，微生物学实验，第一版，科学出版社.北京，2002：P202－205)保藏菌株比较合适。
实施例2：窄食单胞菌SY1在LB培养基中对镉、铬的去除试验
挑取窄食单胞菌SY1的单菌落接种到5mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为0.8左右，将其作为种子液；以1％(v/v)的接种量接种新鲜种子液于灭菌后的100mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为0.8左右，并向培养基中添加100μL 0.1M的镉，使其终浓度至100μM。将配制后的培养基置于28℃摇床中振荡培养，每隔12h取1mL样品，12000rpm/min离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于-20℃冰箱，通过火焰原子吸收仪(AAS)测定溶液中剩余Cd含量；以1％(v/v)的接种量接种新鲜种子液于灭菌后的100mL LB液体培养基中，同时向培养基中添加100μL 0.1M的铬，和500μL 0.1M的铬，使其终浓度分别为100μM和500μM。将配制后的培养基置于28℃摇床中振荡培养，每隔12h取1mL样品，12000rpm/min离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于-20℃冰箱，通过常规二苯羰酰二肼法测定溶液中剩余铬含量；以1％(v/v)的接种量接种新鲜种子液于灭菌后的100mL LB液体培养基中，同时向培养基中添加50μL 0.1M的镉，和100μL 0.1M的铬使其终浓度为50μM镉+100μM铬。将配制后的培养基置于28℃摇床中振荡培养，每隔12h取1mL样品，利用紫外分光光度计检测OD600，剩余样品12000rpm/min 离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于-20℃冰箱，通过火焰原子吸收仪测定溶液中剩余 Cd含量，通过二苯羰酰二肼法测定溶液中剩余铬含量。结果表明，在单独添加镉条件下，窄食单胞菌SY1菌株可在36h内使50μM镉完全去除(见图5中的A图),可在60h内使100μM 镉去除90％以上(见图5中的B图)；在将窄食单胞菌SY1培养8h后，在单独添加镉条件下，窄食单胞菌SY1可在48h内使100μM镉完全去除(见图5中的C图)；在单独添加铬条件下，窄食单胞菌SY1可分别在36h内完全使100μM铬基本去除(见图5中的D图)，在48h内完全去除500μM铬(见图5中的E图)；在镉和铬复合添加条件下，窄食单胞菌SY1可在60h 内使50μM镉和100μM铬基本去除(见图5中的F图)。
实施例3：窄食单胞菌SY1的固定化菌剂在模拟废水中对镉、铬的去除试验
挑取窄食单胞菌SY1的单菌落接种到5mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为0.8左右，将其作为种子液；以1％(v/v)的接种量接种新鲜种子液于灭菌后的120mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为1.0左右，5000rpm/min离心10min收集菌体。用灭菌后的超纯水清洗菌体，并重悬至6mL(1:20 浓缩)；吸取2mL 2％海藻酸钠(SA)与菌悬液混匀,菌(SY1菌剂，下同)胶(即海藻酸钠) (由添加海藻酸钠的制备工艺得到)体积比为3:1；用1mL注射器吸取混合液，逐滴滴加至2％CaCl2中，待其凝固为固定化小球，用灭菌后的超纯水清洗2-3次，备用。向100mL湖水(水样取自湖北省武汉市洪山区南湖)中添加100μL 1g/L的镉，和40μL 0.1M的铬，使其终浓度为8.9μM镉+40μM铬，制成模拟废水。将收集好的固定化小球加至模拟废水中，置于28℃恒温培养，每隔12h取1mL样品，12000rpm/min离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于 -20℃冰箱，通过火焰原子吸收仪测定溶液中剩余Cd含量，通过二苯羰酰二肼法测定溶液中剩余铬含量。结果表明，在镉和铬复合污染条件下，窄食单胞菌SY1固定化菌剂可在60h时使镉去除率达71.43％(见图6)。
实施例4：窄食单胞菌SY1的葡萄糖改性固定化菌剂在模拟废水中对镉、铬的去除试验
挑取窄食单胞菌SY1的单菌落接种到5mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为0.8左右，将其作为种子液；以1％(v/v)的接种量接种新鲜种子液于灭菌后的120mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为1.0左右，5000rpm/min离心10min收集菌体。用灭菌后的超纯水清洗菌体，并重悬至6mL(1:20 浓缩)；吸取2mL 2％海藻酸钠和900μL 50％葡萄糖溶液与菌悬液混匀(菌(SY1菌剂，下同)胶(即海藻酸钠)体积比为3:1，葡萄糖终浓度约为5％)；用1mL注射器吸取混合液，逐滴滴加至2％CaCl2中，待其凝固为固定化小球，用灭菌后的超纯水清洗2-3次，备用(见图 5)。向100mL湖水(水样取自湖北省武汉市洪山区南湖)中添加100μL 1g/L的镉，和40μL 0.1M的铬，使其终浓度至8.9μM镉+40μM铬，制成模拟废水。将收集好的葡萄糖改性固定化小球加至模拟废水中，置于28℃恒温培养，每隔12h取1mL样品，12000rpm/min离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于-20℃冰箱，通过火焰原子吸收仪测定溶液中剩余Cd含量，通过二苯羰酰二肼法测定溶液中剩余铬含量。结果表明，在镉和铬复合污染条件下，窄食单胞菌SY1葡萄糖改性固定化菌剂可在60h时使镉完全去除(见图7中的A图)，在36h时使铬完全去除(见图7中的B图)。表明能源物质的添加对于窄食单胞菌SY1对铬的还原至关重要。
实施例5：窄食单胞菌SY1的活性炭改性固定化菌剂在模拟废水中对镉、铬的去除试验
挑取窄食单胞菌SY1的单菌落接种到5mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为0.8左右，将其作为种子液；以1％(v/v)的接种量接种新鲜种子液于灭菌后的120mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为1.0左右，5000rpm/min离心10min收集菌体。用灭菌后的超纯水清洗菌体，并重悬至6mL(1:20 浓缩)；吸取2mL 2％海藻酸钠和0.6g生物炭与菌悬液混匀(菌胶比(SY1菌剂，下同)胶(即海藻酸钠)体积比为3:1，生物炭终浓度约为7.5％)。用1mL注射器吸取混合液，逐滴滴加至 2％CaCl2中，待其凝固为固定化小球，用灭菌后的超纯水清洗2-3次，备用。向100mL湖水(水样取自湖北省武汉市洪山区南湖)中添加100μL 1g/L的镉，和40μL 0.1M的铬，使其终浓度至8.9μM镉+40μM铬，制成模拟废水。将收集好的生物炭改性固定化小球加至模拟废水中，置于28℃恒温培养，每隔12h取1mL样品，12000rpm/min离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于-20℃冰箱，通过火焰原子吸收仪测定溶液中剩余Cd含量，通过二苯羰酰二肼法测定溶液中剩余铬含量。取经过一轮废水模拟处理的生物炭改性固定化小球，用超纯水清洗2-3次，再次投至终浓度为8.9μM镉+40μM铬的模拟废水中，置于28℃恒温培养，每隔12 h取1mL样品，12000rpm/min离心1min，吸取上清并过滤，取滤液暂存于-20℃冰箱，通过火焰原子吸收仪测定溶液中剩余Cd含量，通过二苯羰酰二肼法测定溶液中剩余铬含量。结果表明，在镉和铬复合污染条件下，窄食单胞菌SY1生物炭改性固定化菌剂可在96h时使镉去除率达90.07％(见图8中的A图)，在96h时使铬去除率达95.90％(见图8中的B图)，使铬达到了中国《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)V类水的标准(≤0.1mg/L)；在循环使用中，窄食单胞菌SY1生物炭改性固定化菌剂可在96h时使镉去除率达61.40％(见图8中的A图)，在96h时使铬去除率达93.38％(见图8中的B图)。表明本发明中生物炭的添加对于Cd的吸附具有一定的帮助，并且能够为窄食单胞菌SY1提供还原铬所需的能量，为SY1固定化菌剂的循环利用提供了可行性。
实施例6：窄食单胞菌SY1的发酵培养
挑取窄食单胞菌SY1的单菌落接种到5mL LB液体培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养至OD600为0.8左右，将其作为种子液。配置发酵培养基：玉米粉6g/L，豆粕12g/L，氯化铵8g/L，氯化钙6g/L，经本领域常规高压灭菌后备用。以1％(v/v)的接种量分别接种新鲜种子液于灭菌后的100mL发酵培养基和LB培养基中，置于28℃，150rpm/min摇床中振荡培养24h，分别吸取100μL培养液，用灭菌后的超纯水做梯度稀释，涂布于LB平板中，置于 28℃恒温培养，观察菌落生长情况并计数。结果表明，窄食单胞菌SY1以LB震荡培养24h能达到2×108cfu/mL，而以发酵培养基振荡培养24h则超过109cfu/mL。
综上所述，本发明的窄食单胞菌SY1菌株及其固定化菌剂可高效去除污水中的镉和/或铬，通过在固定化小球中添加生物炭等能源类物质，能够有效提高窄食单胞菌SY1对铬的还原能力，并为固定化菌剂的循环利用提供了可能，表明本发明的菌剂在复杂污染环境修复中具有较大的应用潜力。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种窄食单胞菌SY1固定化菌剂在镉、铬污染净化中的应用
<141> 2021-11-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1540
<212> DNA
<213> 窄食单胞菌SY1(Stenotrophomonas sp.)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1540)
<400> 1
tgaagagttt gatcctggct cagagtgaac gctggcggta ggcctaacac atgcaagtcg 60
aacggcagca caggagagct tgctctctgg gtggcgagtg gcggacgggt gaggaatgca 120
tcggaatcta ctctttcgtg ggggataacg tagggaaact tacgctaata ccgcatacga 180
cctacgggtg aaagccgggg accttcgggc ctggcgcgaa tgaatgagcc gatgcccgat 240
tagctagttg gcggggtaag agcccaccaa ggcgacgatc ggtagctggt ctgagaggat 300
gatcagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 360
tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccataccgcg tgggtgaaga aggccttcgg 420
gttgtaaagc ccttttgttg ggaaagaaaa gcagtcggtt aatacccgat tgttctgacg 480
gtacccaaag aataagcacc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaagggtg 540
caagcgttac tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgtag gtggttgttt aagtctgtcg 600
tgaaagccct gggctcaacc tgggaattgc gatggaaact gggcaactag agtgtggcag 660
aggatagtgg aattcctggt gtagcagtga aatgcgtaga gatcaggagg aacatccgtg 720
gcgaaggcga ctgtctgggc caacactgac actgaggcac gaaagcgtgg ggagcaaaca 780
ggattagata ccctggtagt ccacgcccta aacgatgcga actggatgtt gggtgcaatt 840
tggcacgcag tatcgaagct aacgcgttaa gttcgccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 900
ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagtatgtg gtttaattcg 960
atgcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgtcgag aactttccag agatggattg 1020
gtgccttcgg gaactcgaac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttgccagca cgtaatggtg 1140
ggaactctaa ggagaccgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1200
catggccctt acggccaggg ctacacacgt actacaatgg tagggacaga gggctgcaag 1260
ccggcgacgg taagccaatc ccagaaaccc tatctcagtc cggattggag tctgcaactc 1320
gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt 1380
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt tgttgcacca gaagcaggta 1440
gcttaacctt cgggagggcg cttgccacgg tgtggccgat gactggggtg aagtcgtaac 1500
aaggtagccg tatcggaagg tgcggctgga tcacctcctt 1540

Claims (7)

1.一种分离的窄食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)SY1菌株制备的菌剂在环境镉和/或铬污染净化中的应用。
2.一种窄食单胞菌SY1的固定化菌剂，其特征在于，是将窄食单胞菌SY1菌株接种于LB液体培养基或以豆粕和玉米粉为主成分的发酵培养基中通过振荡培养得到，所述固定化菌剂中的窄食单胞菌SY1与2％海藻酸钠的体积比为3:1，通过包埋法生产。
3.一种改良的窄食单胞菌SY1的固定化菌剂，其特征在于，是将窄食单胞菌SY1菌株接种于LB液体培养基或以豆粕和玉米粉为主成分的发酵培养基中通过振荡培养得到，所述固定化菌剂中的窄食单胞菌SY1与2％海藻酸钠的体积比为3:1，并添加终浓度为5％的葡萄糖，通过包埋法生产。
4.一种改良的窄食单胞菌SY1的固定化菌剂，其特征在于，是将所述窄食单胞菌SY1菌株接种于LB液体培养基或以豆粕和玉米粉为主成分的发酵培养基中通过振荡培养得到，所述固定化菌剂中的窄食单胞菌SY1与2％海藻酸钠的体积比为3:1，并添加终浓度为7.5％的生物炭，通过包埋法生产。
5.权利要求2所述的一种窄食单胞菌SY1的固定化菌剂在环境镉和/或铬污染修复中的应用。
6.权利要求3所述的一种改良的窄食单胞菌SY1的固定化菌剂在环境镉和/或铬污染修复中的应用。
7.权利要求4所述的一种改良的窄食单胞菌SY1的固定化菌剂在环境镉和/或铬污染修复中的应用。
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Genes involved in arsenic transformation and resistance associated with different levels of arsenic-contaminated soils;Lin Cai et al.;BMC Microbiology;第1-11页 *

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