CN114015601B - 赖氨酸芽孢杆菌qb30及其在含乙硫醇恶臭废气降解中的应用 - Google Patents

赖氨酸芽孢杆菌qb30及其在含乙硫醇恶臭废气降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开赖氨酸芽孢杆菌QB30及其在含乙硫醇恶臭废气降解中的应用。本发明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)QB30，保藏编号：CCTCCNO：M2020895。真菌“QB30”在含乙硫醇废气降解中的应用。人工增加QB30真菌在生物活性填料中的丰度，可提高生物活性填料对含乙硫醇废气的清除效率。添加赖氨酸芽孢杆菌QB30的反应器，在进入稳定期后，针对含乙硫醇废气的吸收清除效率显著提高。添加赖氨酸芽孢杆菌QB30后的活性填料，可以缩短生物滴滤塔反应器启动时间。

Description

赖氨酸芽孢杆菌QB30及其在含乙硫醇恶臭废气降解中的应用
技术领域
本发明属于环境污染治理领域，涉及一株赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)QB30及其在含乙硫醇恶臭废气降解中的应用。
背景技术
伴随着现代工业化、城市化的快速发展，如何降低工业废气污染已经成为人们关注的环境焦点问题。乙硫醇是恶臭类废气中的一种重要的污染物，其主要来源于化工、石油冶炼和医药等工业生成，特别是在污泥消化过程中会有大量的乙硫醇废气产生。乙硫醇毒性大，并且容易与衣服、皮肤、眼角膜和鼻粘膜等吸附。当乙硫醇在空气中的浓度高于0.7ug/L时，会引起人体不适，因此，大量含乙硫醇废气的排放严重危害了人们身体健康。目前，乙硫醇废气被列为含硫废气处理的重点，已经受到相关部门的高度关注。因此，开发高效、无二次污染的生物降解技术是解决这类含乙硫醇废气污染的有效技术之一。
目前常用的处理恶臭废气的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和法学法技术比较成熟，不够其局限性较大，这两种方法普遍存在运行费用高且存在二次污染等问题。与前两种方法相比，生物法则具有降解效果好、无二次污染等优点，因此，目前该方法已经普遍被人们所关注。目前，人们筛选获得一些具有去除乙硫醇能力的微生物，譬如姜安玺等研究了异养菌黄单胞菌He4和自养菌排硫杆菌Au16脱除乙硫醇的应用(利用黄单胞菌He4和排硫杆菌Au16固定化生物滴滤技术去除乙硫醇臭气，高技术通讯，2003，(01)：85-88)。专利(公开号：CN 103667119 A)公开了一种具有降解乙硫醇作用的菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)WL2。
采用生物滴滤塔处理工业恶臭废气是目前比较热门的一种生物技术。生物滴滤塔反应器内安装固体填料床，培养微生物，并使微生物在固体填料表面附着生长形成牢固的生物膜，废气流经生物反应器，有害物质吸附到生物膜上进而被微生物所降解。为达到生物滴滤塔反应器降解废气中快速启动的目的，通常需往底泥中接种特别的微生物。但是目前的生物滴滤反应器存在去除效率低、停留时间短和维护成本高等缺点，这在一定程度上限制了生物滴滤反应器在废气净化领域的应用。从生物滴滤塔底泥中筛选具有吸收、降解乙硫醇的高效细菌，并将其以人工方式培养后再加入生物滴滤塔反应器中，可以达到改良生物滴滤反应器的效果。此外，筛选得到的高效细菌，为研究含乙硫醇废气的生物降解机制提供了实验材料。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种具有降解乙硫醇废气的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)菌株QB30。
本发明提供的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)菌株QB30，分类名为Lysinibacillus sp.QB30，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号为CCTCC NO：M2020895；保藏日期2020年12月29日。
该菌株的生物学特征如下：菌落成暗白色，边缘比较整齐，菌丝蓬松，显微镜下显示该菌为革兰氏阳性菌，粗短杆状。
本发明所涉及菌种的筛选技术方案是：
所提供菌株在化工企业的生物滴滤塔反应器活性污泥驯化池中筛选获得。
本发明的第二个目的是提供上述赖氨酸芽孢杆菌QB30在含乙硫醇废气降解中的应用。
作为优选，赖氨酸芽孢杆菌QB30在生物滴滤塔降解含乙硫醇废气中的应用。
作为优选，所述生物滴滤塔中的填料采用基质和菌株QB30，其中每克基质中含有不低于3.0×107CFU的QB30菌株，基质为木屑、活性炭和麦麸按照2：1：1.5的质量比混合的混合物。
作为优选，所述的生物滴滤塔反应器的工作设置参数如下：设计废气风量8500m3/h，空塔气速1m/s，塔径2000mm，塔高8500mm，喷淋密度16m3/(m2·h)，填料高度1600mm，停留时间8s。
本发明的第三个目的是提供一种发酵制品，为赖氨酸芽孢杆菌QB30的发酵液或液体菌剂。
作为优选，所述赖氨酸芽孢杆菌QB30的发酵液的制备方法具体如下：
将经过PDA固体培养基培养纯化后的赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株接种于发酵培养基，按照种子液和发酵培养基的体积比为1:10进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；发酵培养的条件为：32-37℃，保持溶解氧高于2.2mg/L，发酵罐压强为0.05MPa，每一轮培养时间2天；
作为优选，所述发酵培养基包括营养肉汤5g，碳酸氢钠200g，尿素8g，琼脂15g，ddH2O 1000mL，pH6.5-9.5。
作为优选，所述赖氨酸芽孢杆菌QB30的液体菌剂的制备方法具体如下：
用冷冻离心机对上述发酵液进行4℃，4500×g离心，时间为15min，收集沉淀菌体，以新鲜无菌发酵培养基重悬菌体，得到终浓度为0.5-0.8g/L的菌株悬液。
保藏说明：
本发明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)菌株QB30，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号为CCTCC NO：M2020895；保藏日期2020年12月29日。
本发明具有的有益效果主要体现在：
(1)人工增加赖氨酸芽孢杆菌QB30在生物滴滤塔反应器活性填料中的丰度，可提高生物活性填料对含乙硫醇废气的清除效率。添加赖氨酸芽孢杆菌QB30的反应器，在进入稳定期后，针对含乙硫醇废气的吸收清除效率相比对照组提高25.5％；
(2)添加赖氨酸芽孢杆菌QB30后的活性填料，其驯化时间缩短3天，可快速启动生物滴滤塔反应器；
(3)赖氨酸芽孢杆菌QB30菌种可长期保存，-80℃超低温冰箱中保存一年后，经活化可继续使用，对含乙硫醇废气的清除效率没有显著下降，具非常好的保存性。
附图说明
图1为生物反应器结构示意图；
图2为菌株的菌落形态图；
图3为系统发育聚类图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：赖氨酸芽孢杆菌QB30的筛选、分离、及培养
赖氨酸芽孢杆菌QB30分离自罗赛洛(温州)明胶有限公司生物反应器(图1)。其分离方法如下：取5g驯化后的生物滴滤塔反应器污泥，利用ddH2O配制1000倍、100倍和10倍三个浓度梯度，分别涂布于PDA细菌固体培养基上。所述的PDA细菌培养基为：营养肉汤5g，碳酸氢钠200g，尿素8g，琼脂15g，ddH2O 1000mL。取1mL稀释后的污泥溶液，分别放入每个培养皿中，于25℃下进行恒温暗培养。一周后，进行形成的独立菌落观察，从选定的菌落边缘挑取菌丝体，移到新鲜的PDA平板中，进行划线分离培养，可重复上述操作，直到获得纯培养物，转至PDA斜面保存。
实施例2：赖氨酸芽孢杆菌QB30的形态学鉴定
在显微镜下，观察细菌的菌落、菌丝和孢子等特征，参照《细菌鉴定手册》进行鉴定。具体而言，采用点种法将筛选到的赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株点种于PDA平板上，置于25度恒温培养，肉眼观察菌株的形态特征，包括菌落形态、颜色、大小、边缘特征、菌丝性状、生长速度等特征。挑取菌落表面菌丝，置于光学显微镜(日本，OLYMPUS)观察有无孢子和产孢结构等。
本发明的赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株的形态特征如下：
如图2所示，赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株在PDA培养基中，菌落成暗白色，边缘比较整齐，菌丝蓬松，显微镜下显示该菌为革兰氏阳性菌，粗短杆状。
实施例3：赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株的分子生物学鉴定
采用细菌DNA提取试剂盒，进行赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)菌株QB30基因组总DNA提取，具体提取方法如下：取1.2mL菌液，12000×g，离心1.5min，收集菌体；加入500μL 5×CTAB，液氮中速冻50s，再转至65℃下温浴50s，反复上述过程3次；高速涡旋震荡5-8min，65℃温浴25min，加入等体积的氯仿，12000×g，8min，取上清液；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇，静止30min后再次离心；倒掉上清液，以75％的酒精洗涤沉淀物；自然条件下干燥，得到菌株DNA备用。
然后利用细菌ITS区的通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’，如SEQ IDNO.2所示)、1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，如SEQ ID NO.1所示)，扩增所选菌株的ITS区间序列，扩增的结果序列如SEQ ID NO.1所示。通过在NCBI数据库中进行BLAST比对分析发现，其与赖氨酸芽孢杆菌Firmi-27的同源性最高，为99.73％，故鉴定该菌株为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)菌株。
实施例4：赖氨酸芽孢杆菌QB30的系统进化分析
将实施例3中得到的ITS序列在NCBI中进行的BLAST检索，下载与之相近的已知菌种ITS序列，用于构建系统发育树。采用clustalx1.83进行多序列比对，比对结果利用MEGA7.0软件并采用neighbor-joining统计学方法，Bootstrap值设置为1000，使用Tamura-Nei model碱基替换模式，构建基于rDNA ITS序列的系统发育树。具体的系统进化树如图3所示，聚类图显示赖氨酸芽孢杆菌QB30与其他赖氨酸芽孢杆菌属的菌种遗传关系比较近，但是在核苷酸序列的碱基排序上仍然存在着一定的差异。
实施例5：赖氨酸芽孢杆菌QB30发酵及填料制备
经过PDA固体培养基培养纯化后的赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株接种于发酵培养基，发酵培养基为：营养肉汤5g，碳酸氢钠200g，尿素8g，琼脂15g，ddH2O 1000mL，pH调整至6.5-9.5。按照种子液和发酵培养基的体积比为1:10，进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；发酵培养的条件为：32-37℃，保持溶解氧高于2.2mg/L，发酵罐压强为0.05MPa，每一轮培养时间2天。然后，用冷冻离心机对发酵液进行4℃，4500×g离心，时间为15min，收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到终浓度为0.5-0.8g/L的菌株悬液。将“QB30”悬液吸附于填料上，完成富含“QB30”的填料制备。
实施例6：“QB30”菌株提升生物滴滤反应器对含乙硫醇废气的吸收清除效率
分别采用不含“QB30”的原始填料基质和人工添加“QB30”接种后填料基质，设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，在一个工作日周期内，检测两组设备对含乙硫醇废气吸收清除效率的差异。选取两套设备启动20天后的第21个工作日，取样测定所需参数。生物滴滤塔反应器输入口的废气含乙硫醇浓度分别为50mg//m3、100mg//m3、150mg//m3、200mg//m3和250mg//m3，测定乙硫醇降解率。测定结果如表1所示。从表1数据结果可以看出，处理组生物滴滤塔反应器对含乙硫醇废气的清除效率为97.8％～99.5％之间，显著高于对照组。
实施例7：生物滴滤塔反应器启动时间比较分析
分别采用不含“QB30”真菌的原始填料基质和人工添加上述“QB30”真菌接种后的填料基质，设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，检测从开始第一天到启动后第20天的含乙硫醇废气清除效率。每天上午8点30分固定进行样品收集，提取输入口和输出口的废气样本，测定乙硫醇氢含量(单位为mg/m3)。所测得的数据见表格2。
从表2结果可以看出，处理组的生物滴滤塔反应器从14天开始达到95％以上的效率，而对照组的生物滴滤塔反应器从第18天开始达到95％以上的效率。由此可见，“QB30”可以缩短生物滴滤塔反应器启动时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 赖氨酸芽孢杆菌QB30及其在含乙硫醇恶臭废气降解中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1459
<212> DNA
<213> 赖氨酸芽孢杆菌QB30(Lysinibacillus)
<400> 2
ggctccaaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg 60
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120
tccggcttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaacgac tttatcggat 180
tagctccctc tcgcgagttg gcaaccgttt gtatcgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240
aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300
agtcacctta gagtgcccaa ctaaatgatg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc 360
gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcaccg 420
ttgcccccga aggggaaact atatctctac agtggtcaac gggatgtcaa gacctggtaa 480
ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc 600
tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagtgtc agttacagac 720
cagatagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccaaatctct acgcatttca ccgctacact 780
tggaattcca ctatcctctt ctgcactcaa gtctcccagt ttccaatgac cctccacggt 840
tgagccgtgg gctttcacat cagacttaag aaaccacctg cgcgcgcttt acgcccaata 900
attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960
gctttctaat aaggtaccgt caaggtacag ccagttacta ctgtacttgt tcttccctta 1020
caacagagtt ttacgaaccg aaatccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcaggctt 1080
tcgcccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag 1140
tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt 1200
acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggc ccatcctata gcgacagccg aaaccgtctt 1260
tcagtatttc accatgaggt gaaataaatt attcggtatt agccccggtt tcccggagtt 1320
atcccaaact atagggtagg ttgcccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacgtcaaa 1380
ggagcaagct ccttctctgt tcgctcgact tgcatgtatt agcacgccgc cagcgttcgt 1440
cctgagccag atccaaact 1459
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (7)

1.一株具有降解乙硫醇恶臭废气的赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，分类名为Lysinibacillus sp.QB30，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号为CCTCC NO：M2020895；保藏日期2020年12月29日；所述赖氨酸芽孢杆菌的rDNA ITS序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株在含乙硫醇废气降解中的应用，其特征在于所述赖氨酸芽孢杆菌QB30菌株采用权利要求1所述的一株具有降解乙硫醇恶臭废气的赖氨酸芽孢杆菌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于在生物滴滤塔反应器降解净化含乙硫醇废气。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述生物滴滤塔中的填料采用基质和菌株QB30，其中每克基质中含有不低于3.0×107 CFU的菌株QB30。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述基质为木屑、活性炭和麦麸按照质量比2：1：1.5的混合物。
6.如权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于所述的生物滴滤塔反应器的工作参数：废气风量8500 m3/h，塔高8500 mm，塔直径2000 mm，喷淋密度16m3/（m2•h），填料高度1600mm，停留时间8 s。
7.一种发酵制品，其特征在于为赖氨酸芽孢杆菌QB30的发酵液或液体菌剂；所述赖氨酸芽孢杆菌QB30采用权利要求1所述的一株具有降解乙硫醇恶臭废气的赖氨酸芽孢杆菌；
所述发酵液的制备方法具体如下：
将经过PDA固体培养基培养纯化后的赖氨酸芽孢杆菌QB30接种于发酵培养基，按照种子液和发酵培养基的体积比为1:10进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；发酵培养的条件为：32-37℃，保持溶解氧高于2.2 mg/L，发酵罐压强为0.05 MPa，每一轮培养时间2天；
所述液体菌剂的制备方法具体如下：
用冷冻离心机对所述赖氨酸芽孢杆菌QB30的发酵液进行4℃，4500 × g离心，时间为15 min，收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到终浓度为0.5-0.8 g/L的菌悬液。
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