CN115305226B - 一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌zj-22及其应用 - Google Patents

一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌zj-22及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，特别是指一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌ZJ‑22及其应用。所述辐射不动杆菌ZJ‑22的分类名为Acinetobacter radioresistens，已于2022年03月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M 2022290。所述抗辐射不动杆菌ZJ‑22可用于降解烟碱并以烟碱作为唯一的碳源发酵产氢，对烟厂废水中烟碱的降解率为58%，同时最大累积产氢量为68mL/L。

Description

一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌ZJ-22及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，特别是指一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌ZJ-22及其应用。
背景技术
烟碱是烟草中重要的生物碱，其在自然条件下不易被降解，且易溶于水，容易通过淋溶作用造成土壤和水体污染。此外，烟碱进入人体后还大幅提高患高血压、中风等疾病的风险。因此，控制烟碱含量对保护环境和维护消费者健康非常重要。利用物理和化学方法降解烟碱成本高、费时，且涉及某些溶剂萃取过程，易造成二次污染。近年来，采用微生物发酵法降解烟碱因具有成本低、生态相容性好、无二次污染等优点被广泛研究。如公开号为CN1465300A的专利公开的利用微生物降解烟草烟碱的方法提供一种可发酵降解烟碱的烟草假单胞菌；公开号为CN103642722A的专利提供一种烟碱降解菌及其应用，该菌株发酵并与自制腐熟体混合后接入烟草秸秆进行发酵，可提高对烟草秸秆中烟碱的降解率。
氢能作为一种可再生的能源，具有清洁、高效、热值高等特点。传统的煤制氢和天然气制氢等方法不仅需要消耗大量的石化能源，而且会对环境造成污染。采用微生物发酵方法制备氢气具有反应条件温和，能耗低，原料来源广等特点，因而备受关注。如公开号为CN105219667A的专利提供用于木糖发酵制氢的菌株及制氢方法，以木糖为底物，采用蜡样芽孢杆菌S1株和/或圆滑短波单胞菌Z1株进行发酵培养制氢；公开号为CN110591922A的专利提供一种梨囊鞭菌及其发酵秸秆生产氢气的方法和应用，可利用该菌发酵秸秆产生氢气。
烟碱作为一种有机化合物，能够为微生物生长提供所需碳源。如果能够将烟碱降解与生物制氢相结合，将烟碱转化成清洁高效的氢能，将大大提高烟碱降解的工业经济效益，在烟草工业和环境保护方面均具有较高的应用价值。
发明内容
为了解决烟碱降解的工业经济效益有限的问题，本发明公开了一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌ZJ-22及其应用，该菌株能够将烟碱转化成清洁高效的氢能，从而有效提高工业降解烟碱的经济效益。
本发明的技术方案是这样实现的：
一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌ZJ-22，所述抗辐射不动杆菌ZJ-22的分类名为Acinetobacter radioresistens，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2022290，保藏时间为2022年03月18日，地址为中国.武汉.武汉大学。
进一步，所述抗辐射不动杆菌ZJ-22菌体大小为0.5-0.8μm×1.9-2.8μm，呈细杆状，无鞭毛，在平板上为淡黄色圆斑状。
上述抗辐射不动杆菌ZJ-22的培养方法，步骤如下：将抗辐射不动杆菌ZJ-22接种到活化培养基上进行发酵培养，发酵至对数生长期后停止发酵，即获得抗辐射不动杆菌ZJ-22菌液。
进一步，所述活化培养基的配方为葡萄糖10g/L、NH4HCO3 1g/L、NaCl 3g/L、K2HPO41g/L、KH2PO4 1g/L、MgCl2 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L和L-半胱氨酸0.5g/L。
进一步，所述菌种发酵培养的条件为：pH 7.0，温度37℃，转速180r/min振荡培养。
上述的抗辐射不动杆菌ZJ-22在降解废水中的烟碱并产氢中的应用，步骤为：将抗辐射不动杆菌ZJ-22菌液按10%的接种量接种到含有烟碱的废水的培养基中，进行发酵培养，并收集气体。
优选的，所述培养基的配方为：NH4HCO3 1g/L、L-半胱氨酸0.5g/L和营养液5mL/L，其余组分为含有烟碱的废水。
优选的，上述营养液含有以下组分：FeCl2·4H2O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、Na2MO4·2H2O 0.01g/L和MnSO4·7H2O 0.015g/L。
进一步，上述发酵培养的条件为pH 7.0、温度37℃，转速180r/min。
本发明的有益效果：本发明筛选的抗辐射不动杆菌ZJ-22，能够以烟碱作为唯一碳源进行生长，可在降解烟碱的同时发酵生产氢气，对废水中烟碱的降解率为58%，同时最大累积产氢量为68mL/L。本发明的抗辐射不动杆菌ZJ-22可将烟碱降解与生物制氢同步进行，在减轻烟草生产废弃物如烟厂废水中的烟碱对环境的污染的同时生成清洁高效的氢能，在一定程度上降低烟碱的降解成本，有效提高烟碱降解的工业经济效益，也为氢能的低成本工业生产提供参考，在烟草工业和环境保护方面均具有应用及推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明抗辐射不动杆菌ZJ-22菌株的菌落形态图（a）和光学显微镜图（b）。
图2为本发明的抗辐射不动杆菌ZJ-22的系统发育树图。
图3为本发明抗辐射不动杆菌ZJ-22降解烟碱过程中的氢气生成曲线和烟碱降解曲线。
图4为本发明抗辐射不动杆菌ZJ-22发酵烟厂废水过程中的氢气生成曲线和烟碱降解曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的实施例中所涉及到的液体培养基使用前均用N2吹扫培养液以排出空气，固体培养基在放入培养箱前均用真空袋抽真空并密封。
实施例1 抗辐射不动杆菌ZJ-22的驯化
将烟草浓缩液按驯化培养基体积10%的量接种到驯化培养基中，驯化培养基的配方为：烟碱0.1-2g/L、NH4HCO3 1g/L、L-半胱氨酸 0.5g/L和营养液2mL/L（FeCl2·4H2O0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、Na2MO4·2H2O0.01g/L和MnSO4·7H2O 0.015g/L），其余组分为去离子水。培养条件pH 7.0，培养温度37℃，转速180r/min。利用气相色谱仪检测发酵体系中产生的氢气的浓度，当累积产氢量不再发生变化时，往驯化体系中补充烟碱、NH4HCO3、L-半胱氨酸和营养液，每轮驯化添加的烟碱量均比上一轮多0.1g/L，直至培养基中的烟碱浓度达到2g/L，NH4HCO3、L-半胱氨酸和营养液的规格及添加量按上述驯化培养基配方添加。
实施例2 抗辐射不动杆菌ZJ-22的鉴定
（1）抗辐射不动杆菌ZJ-22的形态
本发明的抗辐射不动杆菌ZJ-22是通过在烟草浓缩液中筛选分离得到，具体步骤为：将烟草浓缩液分别用无菌水稀释10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍和10-7倍，再在分离培养基上进行平板涂布，培养条件为pH 7.0，温度37℃，培养时长为48h。48h后，菌落为淡黄色圆斑状，见图1（a）。在显微镜下菌体为细杆状，无鞭毛，大小为0.5-0.8μm×1.9-2.8μm，见图1（b）。经革兰氏染色后，该菌株为革兰氏阳性菌。将筛选得到的菌株命名为ZJ-22。
其中，分离培养基的配方为：烟碱 2g/L、NH4HCO3 1g/L、L-半胱氨酸 0.5g/L、营养液2mL/L（FeCl2·4H2O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、Na2MO4·2H2O 0.01g/L和MnSO4·7H2O 0.015g/L）、和琼脂1.5%（以分离培养基总质量为基准）。
（2）抗辐射不动杆菌ZJ-22的分子生物学鉴定
采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株ZJ-22的总DNA，采用细菌16SrDNA的通用引物（由上海生工生物工程股份有限公司合成，其正向引物序列：5’-AGTTTGATCMTG气相色谱仪TCAG-3’，反向引物序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行16SrDNA的PCR扩增。所得PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，对其进行Blast分析，并构建如图2所示的系统发育树，结果表明，菌株ZJ-22的rDNA基因与Acibetobacter radioresistens（NBRC102413）的同源性达99%，结合菌落形态特征和生理生化特性分析，初步鉴定菌株ZJ-22为与抗辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens）属。
实施例3 抗辐射不动杆菌ZJ-22的活化
挑选分离得到的抗辐射不动杆菌ZJ-22接种到活化培养基上培养，培养条件为pH7.0，温度37℃，转速180r/min，利用气相色谱仪对发酵体系进行检测，当菌液处于对数生长期时停止发酵，得到活化的抗辐射不动杆菌ZJ-22菌液。
其中，活化培养基的配方为：葡萄糖10g/L、NH4HCO3 1g/L、NaCl 3g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgCl2 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L和L-半胱氨酸0.5g/L。
实施例4 抗辐射不动杆菌ZJ-22降解烟碱并产氢
将实施例3活化的抗辐射不动杆菌ZJ-22按烟碱发酵培养基体积10%的接种量接种至烟碱发酵培养基（液体培养基）中，烟碱发酵培养基的配方为：烟碱0.5g/L、NH4HCO3 1g/L、L-半胱氨酸0.5g/L和营养液2mL/L（FeCl2·4H2O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、Na2MO4·2H2O 0.01g/L和MnSO4·7H2O 0.015g/L），其余组分为去离子水。配制烟碱发酵培养基时，将0.5g/L烟碱经0.22μm滤膜过滤后添加至经121℃灭菌20min的1g/L NH4HCO3、0.5g/L L-半胱氨酸和2mL/L营养液的混合液中，混合组成烟碱发酵培养基。培养条件为pH 7.0，温度37℃，转速180r/min，利用气相色谱仪对发酵体系进行检测，检测其产生的氢气浓度，当累积产氢量不再发生变化时停止发酵，记录累积产氢量。如图3所示，发酵结束时，抗辐射不动杆菌ZJ-22发酵烟碱最大累积产氢量为78mL/g。
依照国标YC/T 383-2010所规定的烟碱测定方法，测定烟碱发酵培养基中烟碱的含量变化。如图3所示，发酵结束时，抗辐射不动杆菌ZJ-22对烟碱的降解率达到68%。
应用例抗辐射不动杆菌ZJ-22降解烟厂废水中的烟碱并产氢
将实施例3活化的抗辐射不动杆菌ZJ-22的菌液按烟厂废水发酵培养基体积10%的量接种至烟厂废水发酵培养基（液体培养基）中。烟厂废水发酵培养基的配方为：NH4HCO31g/L、L-半胱氨酸0.5g/L和营养液2mL/L（FeCl2·4H2O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、Na2MO4·2H2O 0.01g/L和MnSO4·7H2O 0.015g/L），以上组分用烟厂废水进行溶解，溶解后在121℃下灭菌20min。在pH 7.0、温度37℃，转速180r/min条件下培养，利用气相色谱仪对发酵体系进行检测，检测其产生的氢气浓度，当累积产氢量不再发生变化时停止发酵，记录累积产氢量。
依照国标YC/T 383-2010所规定的烟碱测定方法，测定烟厂废水发酵培养基中烟碱的含量变化。如图4所示，发酵结束时，抗辐射不动杆菌ZJ-22利用烟厂废水累积产氢量达到68mL/L，废水中烟碱降解率达到58％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌ZJ-22，其特征在于：所述抗辐射不动杆菌ZJ-22分类名为Acinetobacter radioresistens，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2022290，保藏时间为2022年03月18日，地址为中国.武汉.武汉大学。
2.权利要求1所述的抗辐射不动杆菌ZJ-22的培养方法，其特征在于，步骤如下：将抗辐射不动杆菌ZJ-22接种到活化培养基上进行发酵培养，培养至对数生长期后停止发酵，即获得抗辐射不动杆菌ZJ-22菌液。
3.根据权利要求2所述的抗辐射不动杆菌ZJ-22的培养方法，其特征在于：所述活化培养基的配方为葡萄糖10g/L、NH4HCO3 1g/L、NaCl 3g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgCl20.1g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L和L-半胱氨酸0.5g/L。
4.根据权利要求3所述的抗辐射不动杆菌ZJ-22的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：pH 7.0，温度37℃，转速180r/min振荡培养。
5.权利要求1所述的抗辐射不动杆菌ZJ-22在降解废水中的烟碱并产氢中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤为：将抗辐射不动杆菌ZJ-22菌液按10%的接种量接种到含有烟碱的废水的培养基中，进行发酵培养，并收集气体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述培养基的配方为：NH4HCO3 1g/L、L-半胱氨酸0.5g/L和营养液5mL/L，其余组分为含有烟碱的废水。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述营养液的组分包括：FeCl2·4H2O0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.01g/L、Na2MO4·2H2O0.01g/L和MnSO4·7H2O 0.015g/L。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于：所述发酵培养的条件为pH 7.0、温度37℃，转速180r/min。
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