CN103789238A - 一株烟碱高效降解菌及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物应用技术领域，公开了一株烟碱高效降解菌及其培养方法。菌株为噬组氨醇节杆菌EA-17（Arthrobacter histidinolovorans），保藏号为CCTCC NO：M2013405。在烟碱初始浓度为2g/L的培养基中，噬组氨醇节杆菌EA-17在12小时内对烟碱的降解率达到87.71%；对于烟碱初始浓度为4g/L时，菌株在24小时内对烟碱降解率达95.64%。本发明优化了噬组氨醇节杆菌EA-17的培养方法，在本发明公布的培养方法下培养10h～16h，噬组氨醇节杆菌EA-17的菌量可达9×108CFU/mL～109CFU/mL。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株烟碱高效降解菌及培养方法。
背景技术
烟碱即尼古丁，是烟草中含量最多的一种生物碱，约占烟草生物碱的95%和烟草干重的0.5%-6%。烟碱对人体和环境都有一定的危害作用。烟碱是香烟中的一种主要有害物质，对人体的危害已得到大量揭示，会引起人体心率加快、血管收缩、血压升高等，长期吸烟会增大人患呼吸道疾病和心血管疾病的几率；我国每年因种植烟草产生烟草废弃物，大量烟草废弃物没有被及时处理而被堆放在田间，在堆放的过程中烟碱会从烟秆中释放溶入土壤中，造成土壤的污染；卷烟厂在生产的过程中，在清洗、蒸煮、制丝等过程中会产生大量废水，这些废水中含有一定浓度的烟碱，直接排放会对水体造成严重的污染。
降解烟碱的方法有很多，微生物降解烟碱被认为是高效、安全环保，而且低成本的方法。早在上个世纪就有微生物降解烟碱的科研报道，研究者陆续筛选出多种可降解烟碱的真菌、细菌等，主要包括节杆菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)等。其中节杆菌属和假单胞菌属是降解烟碱优势菌种。
但目前筛选出的降解烟碱微生物存在降解效率较低或降解不够充分等问题。丁怀宇等（2012）从白肋烟和烤烟中筛选出几株烟碱降解菌，24h内对4g/L烟碱的最高降解率为50.25%；彭宇等（2011）报道摩氏摩根氏菌F4（Morganellamorganii F4）对烟草废弃物浸提液中烟碱的降解率可达84～96％，但需要5～10d的降解周期。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高效降解烟碱能力的降解菌及其培养方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一株烟碱高效降解菌，所述降解菌分类命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17，已于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013405。
上述烟碱高效降解菌的培养方法，培养基的各组分为：K2HPO41g/L～14g/L，KH2PO41g/L～5g/L，烟碱0.1g/L～5g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，蛋白胨5g/L～15g/L，玉米浆干粉1g/L～10g/L，硫酸铵1g/L～15g/L，MgSO40.1g/L～0.3g/L，FeSO40.1g/L～0.3g/L；培养条件为：30℃～37℃，pH6～8，种龄18～24h，接种量0.1～10%。
本发明的有益效果：
（1）采用本发明所述培养方法对噬组氨醇节杆菌（Arthrobacterhistidinolovorans）EA-17进行培养，培养10～16h后，菌体生物量可以达到9×108CFU/mL～109CFU/mL。
（2）本发明所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17具有高效降解烟碱的能力，对于烟碱初始添加浓度为2g/L，所述菌株12h对烟碱的降解率达到87.71%；对于烟碱初始添加浓度为4g/L，所述菌株24h对烟碱的降解率达95.64%。
附图说明
图1为本发明所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17在LB培养基上的生长形态。
图2为本发明所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17的革兰氏染色镜检结果。
图3为本发明所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17基于16S rDNA基因序列的菌株系统进化树。
图4为本发明所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17降解烟碱的特性图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例、附图和附表进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
一株烟碱高效降解菌，该菌株分类命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacterhistidinolovorans）EA-17，已于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013405。
实施例1
1、烟碱降解菌的筛选
1.1培养基
富集培养基：K2HPO4·3H2O13.3g，KH2PO44g，MgSO4·7H2O0.2g，0.5mL微量元素溶液，加水至1L。培养基灭菌后，烟碱用0.22μm滤膜过滤除菌后按1.5g/L的含量加入。
分离培养基：富集培养基中添加1.5wt%含量的琼脂粉。
微量元素溶液：0.05g CaCl2·2H2O，0.05g CuCl2·2H2O，0.008g MnSO4·H2O，0.004g FeSO4·7H2O，0.l g ZnSO4，0.1g Na2MoO4·2H2O用少量0.1mol/L HCl溶解，再加水至1L。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加水至1L，调节pH7.2～7.4。
1.2烟碱降解菌的初筛
初筛菌株从三条途径得到，它们的具体操作是：
（1）烟草区土样：在常年种植烟草的区域取1g土样加入富集培养基中，30℃，180r/min培养三天，转接1mL培养物到另一富集培养基中，30℃，180r/min再培养三天，稀释涂布发酵液到分离培养基中。30℃，培养4-6天，将生长出的单菌落纯化到分离培养基上，30℃，培养4-6天，保藏。
（2）烟秆：将0.5g烟秆加入30mL生理盐水中，30℃，180r/min，震荡30min，取1mL震荡液加入富集培养基中，30℃，180r/min培养三天，稀释涂布发酵液到分离培养基中，30℃，培养4-6天，将生长出的单菌落纯化到分离培养基上，30℃，培养4-6天，保藏。
（3）实验室已保藏菌株：LB活化实验室已保藏菌株，挑单菌落到分离培养基上，30℃，培养4-6天，得到可以利用烟碱生长的菌株，保藏。
通过以上方法，共得到81株可以降解烟碱的菌株，其中从土样、烟秆、实验室已保藏菌株中分别筛选到26株、10株和45株。
1.3烟碱降解菌的复筛
将初筛到的81株菌株接种到含1.5g/L初始烟碱浓度的培养基中发酵培养10h，通过检测，烟碱降解率达到50%以上的菌株有6株，其中一株从土样富集筛选获得的菌株EA-17降解烟碱效率最高，其降解率为72.3%，发酵液呈蓝紫色。实验室保藏菌株、土样、烟秆中筛选到的降烟碱菌株的降解率分别如表1、表2、表3所示。
表1实验室已保藏菌株烟碱降解率
| 菌株编号 | 烟碱降解率 | 菌株编号 | 烟碱降解率 | 菌株编号 | 烟碱降解率 |
| Y-174 | 23.60％ | Y-133 | 25.20％ | Y-65 | 37.80％ |
| Y-176 | 25.10％ | Y-142 | 56.00％ | Y-37 | 36.80％ |
| Y-179 | 26.90％ | Y-189 | 28.50％ | Y-38 | 35.80％ |
| Y-180 | 26.30％ | Y-141 | 33.80％ | Y-56 | 40.90％ |
| Y-15 | 24.60％ | Y-110 | 36.40％ | Y-58 | 38.90％ |
| Y-18 | 20.00％ | Y-116 | 41.50％ | Y-260 | 36.40％ |
| Y-21 | 16.90％ | Y-120 | 39.20％ | PA | 19.10％ |
| Y-50 | 21.50％ | Y-128 | 40.00％ | PB | 22.40％ |
| Y-51 | 16.40％ | Y-146 | 40.90％ | PC | 19.60％ |
| Y-54 | 15.90％ | Y-26 | 57.90％ | PD | 17.70％ |
| Y-210 | 25.90％ | Y-28 | 57.60％ | PE | 20.70％ |
| Y-199 | 36.70％ | Y-29 | 40.30％ | PF | 23.80％ |
| Y-74 | 28.90％ | Y-42 | 53.10％ | PG | 26.40％ |
| Y-153 | 35.40％ | Y-48 | 41.30％ | PH | 24.20％ |
| Y-156 | 25.00％ | Y-63 | 40.90％ | PI | 25.60％ |
表2土样筛选菌株烟碱降解率
| 菌株编号 | 烟碱降解率 | 菌株编号 | 烟碱降解率 | 菌株编号 | 烟碱降解率 |
| AA | 32.60％ | EB | 50.00％ | E1B | 42.10％ |
| AB | 29.70％ | EC | 28.20％ | A1A | 26.20％ |
| AC | 27.10％ | ED | 32.50％ | A2B | 41.00％ |
| BA | 25.30％ | EE | 24.20％ | C2A | 38.30％ |
| BB | 31.40％ | A1B | 31.70％ | D2A | 33.40％ |
| CA | 24.00％ | A1C | 40.90％ | D2B | 38.00％ |
| DA | 32.50％ | B1B | 41.90％ | E2A | 35.80％ |
| DB | 30.70％ | C1A | 48.30％ | E2B | 34.40％ |
| EA-17 | 72.30％ | D1A | 43.80％ |
表3烟秆筛选菌株烟碱降解率
| 菌株编号 | 烟碱降解率 | 菌株编号 | 烟碱降解率 | 菌株编号 | 烟碱降解率 |
| C3A | 32.20％ | C3B | 40.00％ | D4A | 35.40％ |
| B3B | 32.00％ | A4A | 34.80％ | D4B | 44.90％ |
| B3C | 29.60％ | B4A | 46.70％ | ||
| D3A | 40.80％ | C4A | 40.90％ |
2、降解烟碱菌株的鉴定
2.1LB平板培养菌落特征：将菌株EA-17接种到LB培养基上，菌株在LB平板培养基上培养48h后，菌落呈圆形凸起，仅1mm大小，表面光滑、湿润，质地脆，呈浅黄色，且随着时间推移，颜色加深。菌株EA-17在LB固体培养基中生长48h后的形态如图1所示。
2.2菌体镜检：通过显微镜观察，菌株EA-17的菌体在100倍油镜下依然很微小，且在培养8h后，菌体呈短杆状，培养16h后大部分为圆形，少量仍为短杆状，培养48h后都呈圆形，这符合节杆菌属在生长幼期和成熟期的形态变化特征。对菌株EA-17进行革兰氏染色，革兰氏染色呈阳性但易脱色，菌株EA-17革兰氏染色镜检结果如图2所示（比例尺1:64）。
2.3菌株生理生化实验
菌株EA-17的生理生化特征见表4和表5：
表4菌株EA-17生理特征
| 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 |
| 芽孢染色 | 无芽孢 |
| 菌株运动性试验 | 运动 |
| 生长温度范围试验 | 10-45℃ |
| 初始pH影响生长范围试验 | 5-10 |
表5菌株EA-17生化特征
注：“+”表示反应为阳性，“－”表示反应为阴性
2.4菌株16S rDNA鉴定
测定菌株EA-17的16S rDNA全序列长度为1584bp，通过与16S rDNA序列已知的菌株比对，结果表明，菌株EA-17的16S rDNA序列与嗜组氨醇节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans)的16S rDNA序列有99.39%的同源性，且归为一簇的自检值支持率为97%（1000次检测）。结合菌落形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，鉴定所述菌株EA-17为嗜组氨醇节杆菌(Arthrobacterhistidinolovorans），其分类命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17。所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17基于16SrDNA基因序列的菌株系统进化树如图3所示。
3、噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17培养方法的优化
通过系列试验，考察碳氮源、金属离子等培养基成分和温度、初始pH、接种量、种龄等培养条件对噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17生长的影响，并优化得到适宜菌株生长的培养基成分和培养条件，所述培养基的各组分为：K2HPO41g/L～14g/L，KH2PO41g/L～5g/L，烟碱0.1g/L～5g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，蛋白胨5g/L～15g/L，玉米浆干粉1g/L～10g/L，硫酸铵1g/L～15g/L，MgSO40.1g/L～0.3g/L，FeSO40.1g/L～0.3g/L；所述培养条件为：30℃～37℃，pH6～8，种龄18～24h，接种量0.1～10%。
具体选取如下培养基进行噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17发酵培养：K2HPO413.3g/L，KH2PO44g/L，烟碱1.5g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨12g/L，玉米浆干粉8g/L，硫酸铵12.5g/L，MgSO40.2g/L，FeSO40.22g/L；发酵条件为30℃，pH6.5（自然pH），种龄10h，接种量为2%。发酵培养时间10h，发酵液中噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17生物量可达1×109CFU/mL。
对本发明所述噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17降解烟碱的特性进行验证，具体操作方法为：在培养基中分别添加初始浓度为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L的烟碱，所述培养基中不添加其他碳氮源，其组分为：K2HPO413.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO40.2g/L，FeSO40.22g/L。在24h内，噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17菌株能有效而较完全的降解0.5-4g/L浓度烟碱（见图4）。在初始添加0.5-2g/L烟碱含量时，菌株在12h内既完成了大部分烟碱的降解，其中，对于初始添加2g/L烟碱，菌株对烟碱的降解率达到87.71%；对于初始添加4g/L烟碱，24小时降解率达95.64%。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (2)
1.一株烟碱高效降解菌，其特征在于，所述菌株分类命名为噬组氨醇节杆菌（Arthrobacter histidinolovorans）EA-17，已于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013405。
2.权利要求1所述烟碱高效降解菌的培养方法，其特征在于，培养基的各组分为：K2HPO41g/L～14g/L，KH2PO41g/L～5g/L，烟碱0.1g/L～5g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，蛋白胨5g/L～15g/L，玉米浆干粉1g/L～10g/L，硫酸铵1g/L～15g/L，MgSO40.1g/L～0.3g/L，FeSO40.1g/L～0.3g/L；培养条件为：30℃～37℃，pH6～8，种龄18～24h，接种量0.1～10%。
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