CN103756943A

CN103756943A - 鞘氨醇单胞菌株xp及其在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用

Info

Publication number: CN103756943A
Application number: CN201410047536.9A
Authority: CN
Inventors: 马宇平; 周浩; 戴建国; 苏东赢; 王墨染; 唐鸿志
Original assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd
Priority date: 2014-02-11
Filing date: 2014-02-11
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-02-11
Also published as: CN103756943B

Abstract

本发明属于微生物菌种技术领域，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌株xp，其分类命名为Sphingomonas sp.，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011453。本发明还给出了该鞘氨醇单胞菌菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，降解效果好。

Description

鞘氨醇单胞菌株xp及其在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌株xp及其在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用。

背景技术

鞘氨醇单胞菌在环境中分布极广泛，而且对恶劣环境有很强的忍耐性（如极地、强辐射等极端环境中都曾发现了鞘氨醇单胞菌的存在）。鞘氨醇单胞菌的降解底物范围广，如对二噁英类、酚类、偶氮染料等芳香化合物以及异型生物质聚合体等的降解都有相关报道。由于鞘氨醇单胞菌对芳香化合物有极为广泛的代谢能力，并且该菌属某些菌种能够合成有价值的胞外生物高聚物，因此，近年来鞘氨醇单胞菌成为被关注和研究的热点。

烟草多酚是在烟株叶和茎两个主要部位合成的带有一个或多个羟基的芳香环化合物, 其在烟草中的含量较高，约为干叶重量的0.5－2.5%。在烟草中发现的多酚类化合物包括单宁类（绿原酸的异构体、咖啡酸和奎尼酸）、香豆素类（莨菪亭和莨菪亭的糖苷衍生物）、黄酮类（芳香苷、黄酮、鼠李糖、黄酮醇）和花色素类（花色素-3-芸香糖苷、花葵素-3-芸香苷、堪非醇）四大类共约135种。其中绿原酸和芸香苷是烟草中最主要的多酚类物质，绿原酸占多酚类物质总量的75—95%。多酚是烟叶中的重要香气前体物，多酚含量与烘烤后的烟叶颜色和卷烟香气密切相关。在吸烟过程中,多酚及其热解产物转移到烟气中, 对烟气香味有直接影响。在合理的调制、陈化条件下，植物多酚类化合物经一系列反应降解生成多种物质，这些降解产物能赋予烟草制品优雅的香气，增加烟草制品的香气量，对改善烟草制品的品质有极其重要的作用。

烟草中的多酚化合物含量对烟草品质有着重大影响。在一定范围内，多酚化合物含量与烟叶品质呈正相关。这是因为在调制、醇化和燃烧过程中，多酚类化合物可氧化分解生成一些能赋予烟草制品优雅清香气味和增加烟草制品香气量的化合物，因此它们对改善烟草制品的品质有着重要作用。然而，多酚类化合物含量超出一定范围时，烟叶不同程度带有多种品质缺陷，如：有青杂气和刺激性、香气质单调、香气量不足等，不能直接用来生产卷烟。更为重要的是，过量的多酚化合物对人体有毒性，会影响吸烟者的健康。因此，如何降低烟草中多酚类化合物的含量是烟草工业中的重要环节。现有研究表明微生物技术在降解烟草多酚化合物过程中发挥重要作用。因此，目前极需要开发出在低温低湿条件下能较好发挥多酚类化合物降解效果的微生物菌株。

发明内容

本发明目的在于提供一种鞘氨醇单胞菌株xp，将其用于降解烟草制品中的多酚类化合物方面，降解效果好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鞘氨醇单胞菌株xp，其分类命名为Sphingomonas sp. xp，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011453，保藏日期：2011年12月9日，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号（武汉大学）。

所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用。

所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，具体为：将鞘氨醇单胞菌株xp用LB培养基复苏（30℃培养24h），然后接种到含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中， 28－32℃培养2－24 h后离心收集菌体，无机盐培养基清洗1－5次后，用无机盐培养基重悬菌体，调整至OD₆₀₀值为2.0－5.0，所得悬浮液即为种子培养液；将种子培养液在28－32℃、湿度55－65%条件下均匀喷洒于烟草制品上。

具体的，所述含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中，绿原酸浓度为0.2－1.0g/L，烟草浸提液浓度为0.05－0.2 ml/L。绿原酸或烟草浸提液用以作为鞘氨醇单胞菌株xp生长的唯一碳源。本发明所述鞘氨醇单胞菌xp在绿原酸添加量为0.2－1.0g/L的无机盐培养基中培养时生长情况良好，更高浓度的绿原酸能抑制鞘氨醇单胞菌xp的生长。

所述烟草浸提液可经下述方法获得：取1g烤烟叶片，粉碎后加入55－65%（体积百分比）乙醇于45－55℃水浴萃取30－60min（每10 min摇匀一次），萃取结束后过滤，滤液即为烟草浸提液。

较好的，所述无机盐培养基的配方为：每1000ml去离子水中含2.44g Na₂HPO₄、1.52g KH₂PO₄、0.5g (NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.05g CaCl₂·2H₂O和10ml微量金属盐溶液SL-4；其中，所述微量金属盐溶液SL-4组成为：1000ml去离子水中含有0.50g EDTA、0.20g FeSO₄·7H₂O和100ml微量金属盐溶液SL-6；所述微量金属盐溶液SL-6组成为：1000ml去离子水中含有0.10g ZnSO₄·7H₂O、0.03g MnCl_2·4H₂O、0.30g H₃BO₃、0.20g CoCl₂·6H₂O、0.01g CuCl₂·2H₂O、0.02g NiCl₂·6H₂O和0.03g Na₂MoO₄·2H₂O。

本发明中，所述的烟草制品可以为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的不同品种、产地的全株烟草（Nicotiana tabacum），或者以烟草为原料经切制、研磨、提取或再造制成的烟丝、烟末、烟块、烟片或烟膏等。

其中，所述烟草制品优选为烤烟叶片。

本发明所提供的菌株鞘氨醇单胞菌株xp（Sphingomonas sp.）在无机盐培养基中利用绿原酸或烟草浸提液为唯一碳源生长后，能够降解烤烟叶片中的多酚类化合物。在利用鞘氨醇单胞菌xp（Sphingomonas sp.）喷洒于烟草制品上，一周后烟草制品中的多酚类化合物含量降解率超过25%。目前所利用的醇化方法中，所需的醇化时间较长，往往会影响产品的周期。本发明与现有的醇化方法相比，具有快速降解的优点，这对于烤烟生产醇化过程中的实际应用更具优势。

附图说明

图1是基于微生物菌株xp 16S rRNA基因序列构建的系统发育树；

图2是鞘氨醇单胞菌菌株xp在含绿原酸的无机盐培养基中48h的生长情况；

图3是菌浓度为OD3.0时，鞘氨醇单胞菌菌株xp在含不同绿原酸的无机盐培养基中对绿原酸的降解情况。

具体实施方式

（一）鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）菌株xp的筛选：

由于绿原酸是烟草中最具代表性的多酚类物质，本申请以绿原酸作为底物，制作成琼脂平板。在30℃、24hr的条件下使用烟田土壤水溶液进行涂板培养，平板培养物经过4℃的低温处理24－72hr后，通过荧光倒置显微观察细菌对绿原酸的分解效果。由于绿原酸在紫外光（365nm）下显蓝色荧光，具有绿原酸分解能力的菌落周围的培养基比背景中的荧光变淡变弱。在绿原酸的蓝色荧光背景中，能直接分离不受杂菌污染的菌株。根据绿原酸酶的活性和透明圈直径的关系测定不同菌株产生的绿原酸酶活力。在pH值4.0－6.0的琼脂平板上进行筛选培养，即可得到耐酸性菌株xp。

（二）鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）菌株xp的鉴定：

筛选得到的菌株xp为革兰氏阴性菌，无孢子，以单侧生极性鞭毛运动，呈黄色。委托中国典型培养物保藏中心对其进行生理生化特性鉴定，结果见表1和表2，其16S rRNA基因序列比对结果见表3，构建的系统发育树数据见附图1。

表3 基于微生物菌株xp 16S rRNA基因序列的比对结果

根据上述生理生化特性、16S rRNA基因序列比对结果及构建的系统发育树，鉴定该菌株xp属食芳烃新鞘氨醇菌(Novosphingobium aromaticivorans) ，菌株xp在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011453。

（三）以下以烤烟叶片为例，说明鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物的应用

下述实施例如无特殊说明，所用的LB培养基配方为：每1000 ml去离子水中含2.5g酵母膏、5g蛋白胨、1g葡萄糖，调pH值为7.0。

所用的无机盐培养基配方为：每1000ml去离子水中含2.44g Na₂HPO₄、1.52g KH₂PO₄、0.5g (NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.05g CaCl₂·2H₂O和10ml微量金属盐溶液SL-4；其中，所述微量金属盐溶液SL-4组成为：1000ml去离子水中含有0.50g EDTA、0.20g FeSO₄·7H₂O和100ml微量金属盐溶液SL-6；所述微量金属盐溶液SL-6组成为：1000ml去离子水中含有0.10g ZnSO₄·7H₂O、0.03g MnCl_2·4H₂O、0.30g H₃BO₃、0.20g CoCl₂·6H₂O、0.01g CuCl₂·2H₂O、0.02g NiCl₂·6H₂O和0.03g Na₂MoO₄·2H₂O。

无机盐培养基和LB培养基在使用前于121℃灭菌15min。

实施例1：鞘氨醇单胞菌xp利用绿原酸进行生长的能力测定

1）制备种子培养液：将菌株xp用LB培养基复苏，然后接种到含0.5g/L绿原酸的无机盐培养基中，30℃摇床培养24 h（转速200rpm）后离心收集菌体，无机盐培养基清洗3次，再用无机盐培养基重悬菌体，调整至OD₆₀₀值为3.0，所得悬浮液即为种子培养液。

2）鞘氨醇单胞菌的生长能力：将种子培养液加入到无机盐培养基中，获得初始OD₆₀₀值为0.15的菌液，然后加入0.5g/L绿原酸，于48h取样，检测菌液的浊度和绿原酸的含量（绿原酸含量测定采用高效液相色谱法），结果见图2。

结论：鞘氨醇单胞菌xp能在48 h内将浓度0.5 g/L的绿原酸降解80%以上（见图3）。

实施例2：鞘氨醇单胞菌xp利用烟草浸提液进行生长的能力测定

1）制备烟草浸提液：称取1g烤烟叶片，粉碎后加入60%乙醇20ml于50℃水浴萃取50min，每10 min摇匀一次，萃取结束后过滤，滤液即为烟草浸提液。

2）制备种子培养液：将菌株xp用LB培养基复苏，然后接种到含0.1 ml/L烟草浸提液的无机盐培养基中，30℃摇床培养24 h（转速200rpm）后离心收集菌体，无机盐培养基清洗3次，再用无机盐培养基重悬菌体，调整至OD₆₀₀值为3.0，所得悬浮液即为种子培养液。

3）鞘氨醇单胞菌的生长能力：将种子培养液加入到无机盐培养基中，获得初始OD₆₀₀值为0.15的菌液，然后加入0.1 ml/L烟草浸提液，于不同时间取样，检测菌液的浊度和多酚类化合物的含量。

结果：鞘氨醇单胞菌xp能够在48 h内将浓度0.1 ml/L烟草浸提液中的绿原酸降解60%。

实施例3：鞘氨醇单胞菌菌株xp以绿原酸为唯一碳源培养后，对烤烟叶片中多酚类化合物降解能力的测定及对烟叶吸食口感的影响

1）制备种子培养液：制备方法同实施例1。

2）鞘氨醇单胞菌xp的降解能力：于30℃、湿度60%条件下将50ml种子培养液均匀喷洒于500g烤烟叶片表面，在不同时间取样，检测烤烟叶片中多酚的含量。对照组使用50ml蒸馏水均匀喷洒于500g烤烟叶片表面。试验所用烟叶选自河南郏县2009年烟叶。

多酚含量的测定选用福林酚法：取1g烟末装入离心管，加入60%乙醇20ml于50℃水浴浸提50min（每10 min摇匀一次），过滤，收集烟草浸提液。取50μg烟草浸提液于25ml容量瓶中，加入3 ml 福林酚试剂，充分摇匀，反应5 min，加入6 ml 20%碳酸钠溶液，摇匀，加水定容，30℃避光放置反应30 min显色。测定710 nm处吸光值。

试验结果证实：鞘氨醇单胞菌xp能够在3周内将烤烟叶片中的多酚类化合物降解7%。其中，喷洒培养14天后的烟叶吸食口感数据见表4。由表4可以看出，对照组：总分40.96，试验组：总分42.75。评吸结论：对照组：杂气较大，香气质、量一般；试验组：杂气较小、甜度增加，浓度劲头有所增加，烟气柔细，香气质、香气量有所提升。

表4、利用鞘氨醇单胞菌xp喷洒培养烤烟叶片14天后的烟叶吸食口感

	香气质	香气量	浓度	柔细度	余味	杂气	刺激度	总分
									对照组	5.71	5.88	5.79	6.21	5.67	5.46	6.25	40.96
试验组	6.17	6.21	5.92	6.25	6.00	6.04	6.17	42.75

实施例4：鞘氨醇单胞菌xp以烟草浸提液为唯一碳源培养后，对烤烟叶片中多酚类化合物降解能力的测定及对烟叶吸食口感的影响

1）制备种子培养液：制备方法同实施例2。

2）鞘氨醇单胞菌xp的降解能力：于30℃、湿度60%条件下将50ml种子培养液均匀喷洒于500g烤烟叶片表面，在不同时间取样，检测烤烟叶片中多酚的含量。对照组使用50ml蒸馏水均匀喷洒于500g烤烟叶片表面。试验所用烟叶选自河南郏县2009年烟叶，

结果：鞘氨醇单胞菌xp能够在3周内将烤烟叶片中的多酚类化合物降解13%。

试验结果证实：以烟草浸提液为唯一碳源培养的鞘氨醇单胞菌xp能够在3周内将烤烟叶片中的多酚类化合物降解7.2%。其中，喷洒培养14天后的烟叶吸食口感数据见表5。由表5可以看出，对照组：总分40.96；试验组：总分42.68。评吸结论：对照组：杂气较大，香气质、量一般；试验组：杂气较小、甜度增加，浓度劲头有所增加，烟气柔细，香气质、香气量有所提升。

表5、利用鞘氨醇单胞菌xp喷洒培养烤烟叶片14天后的烟叶吸食口感

	香气质	香气量	浓度	柔细度	余味	杂气	刺激度	总分
									对照组	5.71	5.88	5.79	6.21	5.67	5.46	6.25	40.96
试验组	6.10	6.25	5.85	6.27	6.01	6.00	6.20	42.68

Claims

1.一种鞘氨醇单胞菌株xp，其分类命名为Sphingomonassp..xp，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011453。

2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用。

3.如权利要求2所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，将鞘氨醇单胞菌株xp用LB培养基复苏，然后接种到含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中， 28－32℃培养2－24 h后离心收集菌体，无机盐培养基清洗1－5次后，用无机盐培养基重悬菌体，调整至OD₆₀₀值为2.0－5.0，所得悬浮液即为种子培养液；将种子培养液在28－32℃、湿度55－65%条件下均匀喷洒于烟草制品上。

4.如权利要求3所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中，绿原酸浓度为0.2－1.0g/L，烟草浸提液浓度为0.05－0.2 ml/L。

5.如权利要求4所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草浸提液经下述方法获得：取1g烤烟叶片，粉碎后加入55－65%乙醇10－30ml于45－55℃水浴萃取30－60min，萃取结束后过滤，滤液即为烟草浸提液。

6.如权利要求3所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述无机盐培养基的配方为：每1000ml去离子水中含2.44g Na₂HPO₄、1.52g KH₂PO₄、0.5g (NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.05g CaCl₂·2H₂O和10ml微量金属盐溶液SL-4；其中，所述微量金属盐溶液SL-4组成为：1000ml去离子水中含有0.50g EDTA、0.20g FeSO₄·7H₂O和100ml微量金属盐溶液SL-6；所述微量金属盐溶液SL-6组成为：1000ml去离子水中含有0.10g ZnSO₄·7H₂O、0.03g MnCl_2·4H₂O、0.30g H₃BO₃、0.20g CoCl₂·6H₂O、0.01g CuCl₂·2H₂O、0.02g NiCl₂·6H₂O和0.03g Na₂MoO₄·2H₂O。

7.如权利要求2至6任一所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草制品为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的全株烟草，或者以烟草为原料经切制、研磨、提取或再造制成的烟丝、烟末、烟块、烟片或烟膏。

8.如权利要求7所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草制品为烤烟叶片。