CN104673701B - 一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用；根皮苷降解菌Enterobacter radicincitans G‑19，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9841；本发明分离得到的G‑19菌株来源于山东省泰安市多年生苹果树根际土壤，经人工富集、驯化及纯化得到；该菌株对根皮苷具有较强的降解能力；能够在苹果树根际稳定定殖；利用该菌株制备的菌剂可有效防治因根皮苷积累造成的苹果连作障碍；菌剂的制备工艺简单、发酵周期短、成本低，利于工业化生产。

Description

一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用

技术领域

本发明提供一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用。属于农用微生物技术领域

背景技术

苹果属于蔷薇科苹果属，是我国第一大水果品种，栽培面积约有200km²，栽培面积和产量均占世界的40％。苹果连作障碍是苹果产业面临的一大难题，连作苹果幼苗成活率低，根系发育不良，严重影响苹果产量和质量。

对于连作障碍的发生机制，目前普遍认可的是由土壤肥力下降、微生物群落(尤其是根际微生物)结构失衡、化感作用等综合作用的结果。对于连作障碍的应对措施主要有增施肥料、选育抗病品种、与它种植物轮作、土壤消毒、施加微生物菌剂等。基于我国苹果栽培面积大、生产周期长、抗病品种选育困难、管理粗放等特点，在其他粮食、蔬菜等农作物上常用的轮作、改换品种、大量增施有机肥等措施，难以适应苹果连作障碍的克服。

目前，越来越多的研究表明，自毒作用是连作障碍的主要原因之一。自毒作用是指某些植物可通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径，释放一些物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用的现象。产生自毒作用的物质包括有机酸、直链醇、简单酚类、酚酸、单宁、醛类、萜类、氨基酸和生物碱等。根皮苷是苹果属特征性酚类化合物，研究表明根皮苷的浓度为0.001mmol/L时可促进幼苗的生长，但浓度达到1mmol/L时开始抑制幼苗的生长，降低干物质的积累，且随着处理浓度的增加，抑制作用加强。另外，根皮苷的降解产物根皮素、间苯三酚和肉桂酸等均能抑制果树生长。酚酸类化感物质主要通过以下方式维持自毒作用：

(1)影响细胞膜的功能，抑制植物对养分的吸收，酚酸类化感物质对细胞膜的破坏可能是化感物质所产生的自毒效应的起点；(2)影响各种酶的功能和活性；(3)影响植物的光合、呼吸作用和根尖的生长。

微生物可以影响自毒物质的数量和种类，对缓解自毒作用具有重要作用。某些微生物能够利用根皮苷等酚酸类自毒物质作为唯一碳源，减弱或消除自毒作用；某些有益微生物能够抑制土壤中病原菌的数量或干扰病原菌对寄主植物的侵染，改善植株根际的土壤生态环境，从而间接缓解自毒作用；植物根际的一些有益微生物通过产生的次级代谢产物，如植物激素和抗生素等，对作物有一定的促生和抗病作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用；可应用于防治苹果的连作障碍。

一株根皮苷降解菌G-19来源于泰安市多年生苹果树跟际土壤，经人工富集、驯化及纯化得到。该菌株已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCC NO.9841，分类命名：促根生肠杆菌Enterobacter radicincitans。其16S rDNA序列如SEQ.NO.1所示。

该菌株对根皮苷具有较强的降解能力；能够以根皮苷作为唯一碳源生长繁殖；能够在苹果树根际稳定定殖。

利用根皮苷降解菌G-19生产的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)菌种活化

将保存的根皮苷降解菌G-19刮取一环划线接种于固体LB培养基上，28～32℃培养18～24h，挑取单菌落划线转接，培养12～18h。

(2)种子液制备

用接种环从LB固体培养基上刮取两环活化的根皮苷降解菌G-19，接入液体LB培养基,转速180～200r/m，温度28～32℃，摇瓶培养12～16h，得到G-19菌株种子液。

(3)发酵培养

将发酵培养基体积比1.0％～2.0％的G-19菌株种子液接种到发酵培养基中进行扩大培养；发酵温度28℃～32℃，转速180～200r/min，培养时间为24～28h，即得到G-19菌株的液体菌剂；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖5g、黄豆饼粉20g、玉米粉40g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸铵0.5g、碳酸钙0.5g和水1L。

使用时，每棵苹果树苗按照G-19菌株液体菌剂10～30mL中加入5～8L水的比例浇入其栽植穴；或先将G-19菌株液体菌剂10～30mL中加入2L水混合后浇入每棵苹果树苗栽植穴，再按常规浇水。

本发明还提供了根皮苷降解菌G-19生产的微生物菌剂在防治苹果连作障碍中的应用，该菌剂可应用于防治由根皮苷积累引起的苹果连作障碍。

本发明具有以下优点：

1、本发明得到的根皮苷降解菌G-19具有较高的根皮苷降解能力，并能够在苹果根际稳定定殖。

2、该菌菌剂的发酵工艺简单、发酵周期短，成本低，利于工业化生产。

3、利用该菌株生产的菌剂可有效防治因根皮苷积累导致的苹果连作障碍。

附图说明

图1为根据16S rDNA序列利用Mega 4.0分析构建的G-19菌株的系统进化树。

由图1可以看出G-19菌株与肠杆菌属的遗传进化距离最近，与已知菌株Enterobacter radicincitans(AY563134)的16S rDNA同源性达到100％，结合该菌株的菌体形态、菌落特征及生理生化指标的测定结果将其鉴定为肠杆菌属的Enterobacterradicincitans。

图2为根皮苷含量测定标准曲线。

决定系数R²＝0.9689，符合测定要求；P﹤0.0001，表明模型极显著；得到的线性回归方程为y＝0.0926x-0.0281。说明根皮苷的浓度与吸光度呈线性关系，可以用于G-19菌株对根皮苷降解能力的测定。

图3溶血实验结果。

从图3可以看出，G-19菌株的溶血性试验呈阴性，符合《微生物肥料安全通用技术准则》对菌种溶血性的要求。

具体实施方式：

实施例一

1、根皮苷降解菌G-19的分离

无菌条件下取苹果树根际土壤5g，溶于45mL根皮苷浓度为500mg/L的富集培养基(组分为：蛋白胨10.0g、氯化钠1.0g、磷酸氢二钾1.0g和水1000ml，pH值7.0-7.2)中，摇瓶培养，转速：180～200r/m，温度：28～32℃。此后每3d为一个训化周期，每个周期的富集培养基中根皮苷浓度由500mg/L依次递增至：1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L,每个周期培养结束时，将得到的发酵液以体积比10％的接种量再接种到50ml富集培养基中继续驯化培养，各周期摇瓶培养条件相同；同时，驯化结束后吸取0.5mL根皮苷浓度为2500mg/L的发酵液与4.5mL的无菌水混匀，即得10^-1的稀释液；再取0.5mL10^-1的稀释液与4.5mL的无菌水混匀，即得10^-2的稀释液，依稀类推，分别制备稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的稀释液。用移液枪吸取稀释度为10^-5的稀释液100uL于PDA平板中央，用涂布器涂抹均匀，于37℃恒温培养箱培养1-3d，挑取单菌落PDA平板划线成纯培养物，保存。

将上述获得的纯培养物接种到含根皮苷浓度为1000mg/L的无机盐培养基(简称：MM，其组分为：硝酸铵1.0g、硫酸铵0.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾1.5g、根皮苷1.0g和水1L，pH值7.0-7.2)中，摇瓶培养，转速：180～200r/m，温度28～32℃。3d为一个周期，培养3个周期，3个周期后选择浑浊度较高者划线得单菌落，获得根皮苷降解菌G-19。

根皮苷降解菌G-19保存方法：短期保存采用PDA固体培养基平板保存，长期保存采用甘油管保存。

本发明涉及到的PDA培养基、液体LB培养基及固体LB培养基均为通用培养基。

2、G-19菌株的鉴定

(1)菌体形态与菌落特征

G-19菌株在PDA培养基上生长12h后菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，质地粘稠，不透明，显微镜下观察该菌体的形态为短杆状。

(2)生理生化特征

G-19菌株的生理生化特征见表1，葡萄糖氧化发酵、需氧性、V-P试验、接触酶试验呈阳性，明胶液化、甲基红试验呈阴性，能够以KNO₃为氮源，能够以葡萄糖、果糖、甘油、甘露醇、蔗糖等多种底物为碳源。

表1 G-19菌株的主要生理生化特征

注:+：阳性反应；－：阴性反应

(3)菌株16S rDNA序列分析

根皮苷降解菌G-19 16S rDNA序列如下：

将此序列与GenBank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于肠杆菌属，选取9株与G-19菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega4.0软件，采取Neighbor-Joining法构建以16S rDNA全序列为基础的系统进化树(附图1)。G-19菌株的16S rDNA序列同公开发表的Enterobacter radicincitans(AY563134)16SrDNA的同源性达到100％，结合其菌体形态、菌落特征和生理生化特征，将其鉴定为肠杆菌属的Enterobacter radicincitans。

实施例二

G-19菌株对根皮苷的降解率的测定：

(1)根皮苷标准曲线的制备

根皮苷标准使用液：取根皮苷10mg溶解于80ml的去离子水，加热使其溶解完全，将该溶液转到100ml的容量瓶中，加去离子水定容至100ml，得到浓度为0.1mg/ml的根皮苷标准使用液。分别取根皮苷标准使用液1.00ml、2.00ml、4.00ml、6.00ml、8.00ml和10.00ml于50ml的容量瓶中，加水至50ml定容，摇匀，即得不同根皮苷浓度的系列外标溶液。以去离子水做对照，用玻璃比色皿于243nm处，分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，以不同根皮苷浓度的系列外标溶液为横坐标做标准曲线(附图2)，建立根皮苷浓度和吸光度的回归方程。

(2)根皮苷降解能力测定

用接种环从PDA平板上刮取2环G-19菌体接种到液体LB培养基中，28℃～32℃、180～200r/m摇瓶培养24h作为种子液。将种子液以体积比2％的接种量接种到浓度为1000mg/L根皮苷的无机盐培养基(MM)中，28～32℃、180～200r/m摇瓶培养48h，将培养液稀释适当倍数进行吸光度的测定，使其吸光度处于0.2～0.8之间，根据根皮苷标准曲线(附图2)和建立的根皮苷浓度和吸光度回归方程，得出培养液中根皮苷的浓度，经计算，G-19菌株对根皮苷的降解率为75.90％。

实施例三

G-19菌株生物安全性评价：

1、检测依据

NY 1109-2006《微生物肥料生物安全通用技术准则》

GB 15193.3-2003《急性毒性试验》

GB/T 4789.28-2003《食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂》

2、主要试剂与材料

G-19菌株，性状为斜面菌种，以无菌接种环挑取细菌斜面上少量菌落放置于50ml营养肉汤培养基中，37℃振荡培养24h，用无菌生理盐水调整细菌浓度至2.0～2.5×10⁸cfu/ml作为受试物。

抗菌药物药敏纸片、MH琼脂培养基购自北京天坛药物生物技术开发公司；血琼脂平板购自北京陆桥技术有限责任公司；大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923购自中国食品药品检定研究院。

3、实验动物及饲养环境

SPF级ICR小鼠：鲁南制药集团股份有限公司提供，质量合格证号：No.0005027。60只，雌雄各半，每笼10只。饲养于鲁南制药集团股份有限公司药理中心动物房，温度：22.5～24.0℃，湿度：40.6％～65.3％。

普通级新西兰兔：购自济南西岭角养殖繁育中心，质量合格证号：No.0014241。3只，单笼饲养。饲养于鲁南制药集团股份有限公司药理中心动物房，温度：20.1～23.5℃，湿度：40.9％～68.2％。

普通级豚鼠：购自济南西岭角养殖繁育中心，动物质量合格证号：No.0014240。3只，每笼饲养3只。饲养于鲁南制药集团股份有限公司药理中心动物房，温度19.6～24.2℃，湿度40％～70％。

4、方法

(1)急性经口毒性试验(最大给药量法)

ICR小鼠20只，体重18～22g，雌雄各半，按20ml/kg经口灌胃给予受试物。灌胃前动物禁食至少16h，自由饮水。灌胃后给予正常饮食，观察14d，记录中毒体征及死亡情况。

(2)急性腹腔注射致病性试验(最大给药量法)

小鼠40只，雌雄各半。剂量设计为500mg/kg。试验时先将受试物用0.9％氯化钠注射液稀释20倍，再按10ml/kg腹腔注射。于腹腔注射后第3d和第7d分别取存活的动物雌雄各5只解剖，并做大体病理学检查。腹腔注射后第14d将剩余动物处死、解剖并做大体病理学检查。根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体征、大体病理学检查及病理组织学检查发现病变的程度进行判定。

(3)溶血试验

用无菌棉拭子蘸取受试物原液，以蛇行线接种于血琼脂平板，置(36±1)℃培养箱中培养24h后，观察有无溶血环产生。同时，用已知溶血阳性菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923作为对照。

(4)抗菌药物敏感试验

用无菌棉拭子将受试物原液均匀涂抹于MH琼脂平板表面，共涂抹3次。每涂抹一次，转动平板60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。用大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株。以无菌操作取出抗菌药物药敏纸片，分别贴在涂有受试物原液和质控菌株菌悬液的平板培养基表面，每个平板放4个纸片。然后将平板置于(36±1)℃恒温培养箱中培养18h后，观察抗菌药物药敏纸片周围有无抑菌环，并量取其直径(包括纸片直径)大小。试验做3个平行。

(5)一次破损皮肤刺激试验

选用皮肤完好的健康豚鼠3只，于试验前24h将其背部脊柱两侧被毛剪掉，左、右去毛面积各约2cm×2cm。涂受试物前，分别在左、右侧去毛皮肤上用75％乙醇清洁、消毒暴露皮肤，待乙醇挥发后，用灭菌注射器针头分别在两块皮区内划一个“#”形破损伤口，取受试物原液0.5ml涂于2cm×2cm的二层纱布上，敷贴于一侧破损伤口表面，玻璃纸覆盖，无刺激胶布固定。另一侧作为空白对照。封闭4h后，去除覆盖物，并用温水清洗除去残留受试物，于去除受试物后的1、24和48h观察涂抹部位皮肤反应。

(6)急性眼刺激试验

选用眼部健康家兔3只，取0.1ml受试物原液滴在左侧眼结膜囊内，将上下眼睑闭合4s，30s后用生理盐水冲洗，右侧用生理盐水作为正常对照。于滴眼后1、24、48、72h观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤及恢复情况，并记录其他损害效应。

5、检测结果

G-19菌株的急性经口毒性试验、急性腹腔注射致病性试验、抗菌药物敏感试验、一次破损皮肤刺激试验、急性眼刺激试验见表2、溶血试验结果见图3。

表2 G-19菌株的安全性评价检测结果

实施例四

1、G-19菌株在苹果树根际的定殖能力测定

(1)G-19菌株的双抗生素筛选及稳定性检测

刮取1环平板培养的G-19菌株菌落接种到不含利福平的LB液体培养基中，28～32℃，180～200r/m培养24h，作为种子液。将种子液以2％(体积百分比)的接种量接种到含5μg/mL利福平(Rif)的LB液体培养基中，摇瓶培养24h；再将该培养液以2％(体积百分比)的接种量接种到含10μg/mL利福平的LB液体培养基中，摇床培养24h；依次类推，使利福平的浓度逐渐由5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、150μg/m直至利福平浓度增加到300μg/mL，培养得到抗利福平的菌株。将得到的抗利福平菌株接种到含300g/mL利福平和5μg/mL壮观霉素(Spe)的LB液体培养基中，对抗利福平和壮观霉素的双抗菌株进行筛选，筛选过程中，LB液体培养基中利福平的浓度为300μg/mL，壮观霉素浓度的递加及筛选方法与抗抗利福平菌株的筛选方法相同，最终获得同时抗利福平和壮观霉素的初始双抗标记菌株。

将筛选的双抗标记菌株在不含利福平和壮观霉素的LB固体培养基和LB液体培养基中，交替培养3～5代，再分别回接到含利福平300μg/mL和壮观霉素300μg/mL的LB液体培养基中进行检测，以证实耐药性的稳定性，最终获得能够稳定遗传的同时抗利福平和壮观霉素的双抗标记菌株。

(2)定殖试验

刮取1环平板培养的G-19双抗标记菌株菌落接种到LB液体培养基中，28～32℃、180～200r/m振荡培养18～20h，作为接种液。将接种液以2％(体积百分比)的接种量接种到同时含有利福平300μg/mL和壮观霉素300μg/mL的LB液体培养基中，28～32℃、180～200r/m振荡培养18～20h；再将该培养液以2％(体积百分比)的接种量接种到LB液体培养基中，28～32℃、180～200r/m振荡培养18～20h，即得到G-19双抗生素标记菌株菌液.

将苹果根部的表土去除，将培养好的G-19双抗生素标记菌株菌液接种到苹果根际，5个重复，每株20ml菌液，然后将表土重新覆盖好。接种菌液后的第5、10、20和30d分别取苹果根际土样，检测双抗生素标记菌株的定殖情况。称取5g根际土，加到装有45mL无菌水的三角瓶中，常温振荡30min，使土壤颗粒及微生物充分分散。用移液器吸取500μL土壤悬液，加到4.5mL无菌水中，振荡混匀，制得10^-2土壤稀释液，再从10^-2土壤稀释液中吸取500μL加到4.5mL无菌水中，充分混匀得10^-3土壤稀释液，以此类推，制备10^-2、10^-3、10^-4系列梯度的土壤稀释液，用移液枪吸取10^-4稀释度稀释液100uL，涂布在同时含有壮观霉素300μg/mL和利福平300μg/mL的PDA固体平板上。置于30℃恒温培养箱培养24～36h，进行菌落计数，结果表明G-19菌株能够在苹果根际稳定定殖，菌体数量达到3.36×10⁵个/g(干土)。

实施例五

G-19菌株菌体发酵培养基优化

分别选择葡萄糖为速效碳源，玉米粉和黄豆饼粉为缓效碳氮源，硫酸铵、磷酸二氢钾和碳酸钙三种无机盐，进行正交试验设计，试验因素与水平的设置分别见表3，各培养基编号及配方见表4。

用接种环挑取G-19菌株，接种到含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，30℃，200r/m培养12h后得G-19菌株种子液，然后将种子液均以2％(体积百分比)的接种量分别接种到表4所述18种培养基中，28～32℃，180～200r/m摇瓶培养24h得到发酵液。对发酵液进行系列梯度稀释，即吸取1mL发酵液加入9mL的无菌水中，为10^-1梯度；混匀后吸取1mL 10^-1梯度液体加入9mL无菌水中，为10^-2梯度；依次稀释获得10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度发酵液稀释液，然后选择10^-5、10^-6、10^-7梯度发酵液稀释液，分别进行涂布平板，30℃条件下培养1-2d，分别进行菌落计数。

表3 因素与水平的设置

表4 正交优化试验设计

用接种环挑取G-19菌株，接种到含50ml LB培养基的250ml三角瓶中，28～30℃，180～200r/m培养12h后得G-19菌株种子液，然后将种子液均以2％(体积百分比)的接种量分别接种到表4所述的18种培养基中，28～32℃，180～200r/m摇瓶培养24h。对发酵液进行系列梯度稀释，即吸取1ml处理后的发酵液加入9ml的无菌水中，为10^-1梯度，混匀后吸取1ml10^-1梯度中的液体加入9ml无菌水中，为10^-2梯度，依次稀释获得10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9梯度发酵液稀释液，然后选择10^-7、10^-8、10^-9梯度发酵液稀释液，分别进行涂布平板，30℃条件下培养1～2d，进行菌落计数。结果发现，12号培养基为该菌株菌体发酵最佳培养基，其组成为葡萄糖5g、玉米粉40g、脱脂豆粉20g、硫酸铵0.5g、磷酸二氢钾0.5g、碳酸钙0.5g和水1000mL。发酵液中菌体数量达到2.1×10¹¹。

实施例六

根皮苷降解菌G-19菌剂制备

(1)菌种活化

将甘油管低温保存的根皮苷降解菌G-19接种到固体LB培养基上，28～32℃培养18～24h，挑取单菌落划线转接，培养12～18h。

(2)种子液制备

用接种环从LB固体培养基上刮取1环活化的G-19菌种，接入到装有液体LB培养基的三角瓶中，转速180～200r/m，温度28～32℃，摇瓶培养12～16h，作为种子液。

(3)发酵培养

将G-19菌株种子液接种到发酵培养基中进行扩大培养，发酵培养基组分为：葡萄糖5g、黄豆饼粉20g、玉米粉40g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸铵0.5g、碳酸钙0.5g和水1L。接种量为1.0～2.0％(体积百分比)，发酵温度为28℃～32℃，转速为180～200r/m，培养时间为24～28h，即得G-19菌株的菌剂

实施例七

G-19菌株对根皮苷引起危害的减除作用盆栽试验

取花盆60个，设为3个处理，即对照组1、对照组2和处理组；每个处理20个花盆。每个花盆装4Kg土，每盆移栽1颗生长水平一致的苹果幼苗。

对照组1：不加根皮苷，每盆栽植1棵苹果幼苗，将灭活的20mL G-19菌剂加水定容至1L浇灌。

对照组2：每个花盆加4.72g的根皮苷，与土壤充分混匀，栽植苹果幼苗后，将灭活的20mL G-19菌剂加水至1L浇灌，土壤中根皮苷的浓度达到5mmol/L(以土壤中的水分记；未浇水前土壤的含水率为25％)。

处理组：每个花盆加4.72g的根皮苷，与土壤充分混匀，栽植苹果幼苗后，将20mLG-19菌剂加水定容至1L浇灌，使土壤中根皮苷的浓度达到5mmol/L(以土壤中的水分记；未浇水前土壤的含水率为25％)。

4个月生长期时，测定苹果苗的株高。

表5 不同处理苹果幼苗平均株高

G-19菌株对根皮苷引起危害的减除作用结果见表5：对照组1和对照组2苹果幼苗平均株高分别为35.8cm和25.5cm，处理组的平均株高为34.0cm。由对照组1和对照组2比较可知，当土壤中根皮苷浓度达到5mmol/L(以土壤中的水分含量及)时，苹果幼苗生长受到强烈的抑制，平均株高降低了28.8％。苹果幼苗表现生长发育不良，树体矮小，生长缓慢衰弱等症状；由对照组2和处理组比较，处理组的平均株高明显的高于对照组2苹果幼苗的平均株高，平均株高增加25％，说明G-19菌株能够有效降解土壤中的根皮苷，有效的解除根皮苷引起的危害。

Claims (4)

1.一株分离的根皮苷降解菌G-19菌株，其保藏号为CGMCC NO.9841，于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种微生物菌剂，包含如权利要求1所述的根皮苷降解菌G-19菌株。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂在防治苹果连作障碍中的应用。

4.如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1) 菌种活化

将根皮苷降解菌株G-19菌株刮取一环划线接种固体LB培养基上，28～32℃培养18～24h，挑取单菌落划线转接，培养12～18h；

2）种子液制备

用接种环从步骤1）培养的LB固体培养基上刮取两环活化的G-19菌株，接入液体LB培养基, 转速180～200r/m，温度28～32℃，摇瓶培养12～16h，作为 G-19菌株种子液；

3）发酵培养

将发酵培养基体积比1.0%～2.0%的G-19菌株种子液接种到发酵培养基中进行扩大培养；发酵温度28～32℃，转速180～200r/m，培养24～28 h，即得到G-19菌株的液体菌剂；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖 5g、黄豆饼粉20g、玉米粉40g、磷酸二氢钾 0.5g、硫酸铵 0.5g、碳酸钙 0.5g和水 1L。