CN1652702A - 减少亚硝胺类的微生物和用其减少亚硝胺类的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于使用微生物进行处理，所述的微生物选自属于少动鞘氨醇单胞菌和荧光假单胞菌的微生物组成的组且能够减少TSNA的量。

Description

减少亚硝胺类的微生物和用其减少亚硝胺类的方法
                        技术领域
本发明涉及烟叶熟化和储存过程中降解烟叶中形成的亚硝胺类的微生物和通过使用该微生物减少熟化过程和/或储存过程中烟叶中形成的亚硝胺类的方法。
                        背景技术
烟叶中含有的亚硝胺类(烟草特定的亚硝胺类，下文称作“TSNA”)在刚收获后的烟叶(即绿叶)中并不存在，而在此后熟化和储存过程中通过烟叶中含有的生物碱与腈之间的反应形成。这种腈由存在于烟叶表面上且具有减少硝酸盐能力的微生物形成。
熟化和随后的储存过程中形成的主要TSNA为N’-亚硝基降烟碱(下文称作“NNN”)、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(下文称作“NNK”)、N’-亚硝基新烟草碱(下文称作“NAT”)、N’-亚硝基假木贼碱(下文称作“NAB”)等。
通常称作减少烟叶中TSNA含量的方法的方法实例包括：(1)抑制TSNA形成的方法；和(2)除去已经形成的TSNA的方法。
抑制TSNA形成的方法的实例包括：通过减少氮肥的量而使烟叶中的生物碱含量下降的方法；减少熟化过程中形成的TSNA的方法，该方法通过采取间接加热类型的熟化室取代直接加热类型的熟化室来进行(该方法主要用于烟熏烟)；育种具有较少生物碱含量的新烟草变种的方法，该发依赖于育种技术的发展；等。
此外，近来报导了通过微波照射抑制TSNA形成的方法(PCT国际公开号2001-503247)。然而，作为上述用微波处理产生的这类快速干燥和熟化没有使烟叶中的成分类型充分改变，而可以在常规熟化过程中以令人满意的方式进行这种改变。因此，比使用常规方法更为快速熟化得到的烟叶在吸烟时表现出极差的气味和味道。
就从烟叶中除去TSNA(由此形成的)的方法而言，对其报导的实例的数量少于抑制TSNA形成的方法的数量。作为这些实例之一，已知通过超临界提取从烟叶中除去TSNA的方法(WO 01/65954)。然而，该方法就其成本而言不切实际。
由于上述情况，所以存在对减少已知烟叶熟化和储存过程中形成的TSNA含量的新方法的需求。
此外，存在对具有相对较少含量的TSNA并对消费者维持令人满意的良好气味和味道的作为香烟原料的烟叶的需求。
因此，本发明的目的是提供能够减少常规熟化和储存过程中形成的TSNA含量的方法。
另外，已知属于曲霉属的为分离自未精制的大豆来源的丝状真菌的微生物可降解亚硝胺类(日本专利申请KOKAI公开号10-276681)。然而，已经指出属于曲霉属的微生物需要高含湿量才能存活，这种高含湿量可以对烟叶的质量、尤其是对其气味和味道产生不良影响。因此，在处理烟叶中应用如上所述的这类微生物可以使烟草质量产生问题。
                       发明内容
本发明的第一个方面提供了减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物处理烟叶的步骤，所述的微生物具有减少TNSA的能力且选自少动鞘氨醇单胞菌和荧光假单胞菌组成的组。
本发明的第二个方面提供了减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于包括用选自少动鞘氨醇单胞菌LG5菌株和荧光假单胞菌LG38菌株组成的组的微生物处理烟叶的步骤。
本发明的第三个方面提供了属于少动鞘氨醇单胞菌或荧光假单胞菌且具有减少烟叶中至少一种类型的TSNA含量的能力的微生物，所述的至少一种类型的TSNA选自N’-亚硝基降烟碱、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亚硝基新烟草碱和N’-亚硝基假木贼碱组成的组，其中这些TSNA在烟叶熟化和储存过程中形成。
本发明的第四个方面提供了能够减少烟叶中TSNA含量的少动鞘氨醇单胞菌LG5菌株(FERM BP-7830)。
本发明的第五个方面提供了能够减少烟叶中TSNA含量的荧光假单胞菌LG38菌株(FERM BP-7831)。
                 本发明的最佳实施方式
作为对烟叶熟化和储存过程中形成TSNA的研究和分析结果，本发明的本发明者已经发现在存在于烟叶上的微生物中存在可以降解TSNA的微生物，由此完成了本发明。
在本发明的本发明者分析熟化烟叶中TSNA的形成过程时，他们从存在于烟叶上的微生物中分离了可以降解形成的TSNA的微生物。此外，本发明的本发明者发现通过用所述的微生物处理熟化的烟叶和/或熟化过程后储存的烟叶可以减少烟叶中的TSNA含量。
已经基于细菌学特性将在分离(收集)的微生物中尤其表现出高降解活性的两种类型的微生物分别鉴定为动鞘氨醇单胞菌和荧光假单胞菌。本发明的本发明者命名为菌株少动鞘氨醇单胞菌“LG5”(下文称作“LG5”或“LG5”菌株)和菌株荧光假单胞菌“LG38”(下文称作“LG38”或“LG38”菌株)。已经于2001年12月18日将LG5和LG38寄存在微生物国际专利保藏所(International Patent Organism Depositary)(IPOD)，国家高级工业化科学和技术研究院(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并分别给予寄存号FERM BP-7830和FERM BP-7831。
这些微生物LG5和LG38有效地减少了烟叶中的TSNA，而没有对熟化的烟叶和/或储存中的烟叶的质量产生任何不良影响。
此外，本发明的方法可以通过用微生物处理烟叶而便利地减少TSNA含量，但不改变常规的熟化方法。因此，可以可靠地维持该烟叶的质量、气味和味道。
菌株LG5和LG38的活性如下。
LG5具有特异性降解NNK的活性。LG38具有降解NNN、NNK、NAT和NAB的活性。
本发明处理的烟叶可以为任意烟草，条件是该烟草可以进行常规的熟化操作。其具体的实例包括作为空气熟化类型(air-cured type)的日本家用烟草(Japanese domestic tobacco)，白莱烟(Burley tobacco)和用设备熟化的烟熏烟(flue-cured tobacco)，但并不限于它们。
对用本发明微生物处理烟叶的时间没有特别限定且可以从烟叶中形成TSNA前立即到将烟叶加工成香烟之间的任意时间进行处理。优选在熟化烟叶和/或储存烟叶期限中进行处理。就在熟化过程中进行处理而言，优选在收获后TSNA形成前立即到变黄阶段和变褐阶段之间的期限中进行处理。就在储存过程中进行处理而言，优选在熟化过程后开始储存时进行处理，不过，可以在储存期过程中的任意时间进行处理。如果需要，基本上可以由操作者从开始熟化过程到完成储存过程之间的期限中选择处理时间。
或者，可以接受的是在收获前立即在田地上用微生物处理烟叶且然后收获并熟化。
用本发明微生物处理的次数并不限于一次。可以在处理期中连续进行两次以上处理，其中每次处理之间有预定的间隔。
本发明的处理并不限于在熟化和/或储存过程中的处理且可以在将烟叶加工成香烟过程中进行处理。
可以通过任意已知方法进行本发明的处理，其实例包括喷悬浮有微生物的混悬液和涂布含有微生物细菌细胞的粉末层。即操作者可以选择适当的方法进行处理。另外可以接受的是将烟叶浸入含有微生物的液体。
如上所述，优选用于本发明的微生物为LG5菌株和LG38菌株。不过，本发明并不限于这些菌株。属于少动鞘氨醇单胞菌或荧光假单胞菌且具有减少TSNA能力的任意微生物种类均包括在本发明范围内。
在本说明书中，术语“减少TSNA”表示减少烟叶中TSNA的含量。例如，降解熟化和储存过程中形成的烟叶中的每种TSNA成分包括在术语“减少TSNA”范围内。
作为用于培养本发明中所用微生物的培养基，可以使用用于培养微生物的各种类型的已知培养基。
在培养微生物的培养条件方面，温度可以在25-35℃、优选28-32℃且pH可以在6.0-8.0、优选约7.0。
在本发明中，在培养预定期限后，通过离心收集微生物。可以使用悬浮于混悬液中后收集的细菌细胞。另一方面，可以使用通过冻干得到的粉末形式的收集的细菌细胞。
在将收集的细菌细胞悬浮于特定的缓冲液以制备微生物混悬液的情况中，可以将无菌蒸馏水、磷酸盐缓冲液等用作缓冲液。
悬浮于缓冲液中的细菌细胞的浓度可以为107-1012、优选108-1010个细胞/1ml缓冲液。在用于用微生物处理烟叶时，优选以如上所述的这类浓度悬浮细菌细胞。
本发明可以通过使用如上所述获得的细菌细胞进行使用微生物处理烟叶。
通过将无菌蒸馏水加入到含有必须量细菌细胞的细菌混悬液中来制备接种入烟叶的微生物接种溶液。将由此制备的接种溶液均匀地喷在烟叶上。可以在熟化过程到储存过程之间的任意时间进行这种处理。就使用空气熟化的烟草的情况而言，可以在熟化过程和此后的储存期中的任意时间进行这种处理。就使用烟熏烟的情况而言，在熟化过程的开始阶段(变黄阶段)或熟化过程后的储存过程中进行这种处理。优选在上述过程中的变黄阶段进行这种处理。就空气熟化的烟草的情况而言，优选在熟化过程中的变褐阶段进行这种处理。
在喷的接种溶液的量方面，当在收获或熟化过程的开始阶段进行处理时，每1片烟叶上施用2-10ml接种溶液。当在熟化过程的中间阶段或此后进行处理时，每1片烟叶上施用0.5-3ml接种溶液。
在处理次数方面，在熟化和/或储存过程中至少处理一次是足够的。优选在熟化和/或储存过程中进行2-3次处理，每次处理之间有一定间隔。
本发明的这些方面没有对熟化条件进行显著改变，但用微生物处理烟叶且由此能够减少TSNA的含量，而不会对烟叶的天然气味和味道产生不良影响。
实施例
实施例1
1)从烟叶中分离微生物
从生长在Oyama-shi，Tochigi县田地上的烟叶中收集微生物。
收集3次微生物，即在收获烟叶后立即收集、在熟化期中的第3天收集(即当叶子的颜色完全变黄时)并在熟化期中的第8天收集(即当叶子的颜色完全变褐时)。
收获属于白莱烟的Michinoku 1的叶茎部位并将收获的烟叶的叶片切短作为样品。将由此获得的样品精细地切成5mm×5mm的正方形。由此将约10g样品放入300ml锥形瓶。向其中加入200ml的10mM磷酸盐缓冲液(pH：7.0)并匀化该混合物。将由此获得的混悬液用作含有来源于收获时的烟叶的微生物的“收获时混悬液”。
使用如上所述收获且然后进行熟化过程的烟叶、按照与收获期收集微生物类似的方式从熟化期中的烟叶中收集微生物(即在熟化过程的第3天收集，此时颜色完全变黄；且在熟化过程的第8天收集，此时颜色完全变褐)。特别将如上所述收获的Michinoku 1的叶茎部位悬挂在钢管室内，它是一种常用的空气熟化烟草的熟化室。此后再第3天和第8天，将由此熟化的烟叶的叶片部分切短成样品。将由此获得的样品精细地切成5mm×5mm的正方形。收集由此切成的约10g样品并放入300ml锥形瓶。向其中加入200ml的10mM磷酸盐缓冲液(pH：7.0)并匀化该混合物。将由此获得的混悬液用作含有来源于熟化期的烟叶的微生物的“熟化时混悬液”。
在3次不同时间收集的每次中，从取样后2小时内匀化收集的烟叶。
用上述磷酸盐缓冲液将收获时混悬液和熟化时混悬液分别稀释成可以分离微生物的浓度(特别为102-105倍)。通过在YG板上滴1次0.1ml施用每种由此获得的稀释混悬液(培养基的浓度如下：1.0g酵母提取物；1.0g葡萄糖；0.3g K2HPO4；0.2g KH2PO4；0.2g MgSO4·7H2O；15.0g琼脂；和调节量的蒸馏水至制成总体积为1000ml培养基，pH6.8)。在30℃下将由此施用的微生物培养7天。培养后，通过使用新制的YG板将生长的菌落分离成单菌落。将由此分离的的微生物保存在-80℃下至用于实验为止。
在如上所述的这类方式中，从熟化时的烟叶中分离了87株微生物菌株且从变褐的烟叶中分离的176株微生物菌株。具有不同菌落形态的菌株选自这些收集的菌株并用于此后的实验。
2)降解TSNA的微生物的初步筛选
在来源于1)中收集的烟叶的菌株中，将包括从收获阶段的烟叶中收集的14株菌株和从熟化阶段烟叶中收集的37株菌株在内的51株菌株选作候选菌株用于初步筛选。
a)培养基的选择
检验用于筛选降解TSNA的微生物的培养基。通过使用在上述1)中选择的菌株检验每一菌株在含有NNN、NNK、NAT和NAB的培养基上的生长情况。结果是当将1/10 TS肉汤用作基础培养基时，获得了最佳结果。因此，将1/10 TS肉汤用作随后培养中的基础培养基。1/10 TS肉汤自身的组成和含有1/10 TS肉汤和微生物的培养基的组成依次如下所示。
[1/10 TS肉汤]
-终体积                                    通过添加蒸馏水调节至
                                           1000ml
-酪蛋白                                    1.7g
-D-葡萄糖                                  0.25g
-NaCl                                      0.5g
-K2HPO4                                 2.5g
-1/10胰胨豆胨(由Difco Co.，Ltd.生产，细菌
用胰胨豆胨肉汤；大豆-酪蛋白消化培养基)
[用于筛选降解TSNA的微生物的培养基]
-终体积                                    35ml
-1/10 TS肉汤(含有5ppm NNN、5ppm            30ml
NAT、5ppmNAB和5ppmNNK)
-接种用微生物混悬液                        5ml
通过下列方法制备用于筛选降解TSNA的微生物的上述培养基。将含有1000ppm NNN的150μl二氯甲烷、含有1000ppm NAT的150μl二氯甲烷、含有1000ppm NAB的150μl二氯甲烷和含有1000ppm NNK的150μl二氯甲烷放入锥形瓶且然后使瓶中的二氯甲烷完全挥发。接下来向瓶中加入1/10TS肉汤以便将NNN、NAT、NAB和NNK的浓度分别调节至5ppm/10ml。在NNN、NAT、NAB和NNK溶解后，将30ml该混合物各自放入50ml锥形瓶。下一步将5ml用于接种的微生物混悬液加入到50ml锥形瓶中，由此得到用于筛选降解TSNA的微生物的培养基。将该培养基在30℃下保温24小时，同时进行振摇。
b)降解TSNA的微生物的初步筛选
通过使用由此制备的培养基对降解TSNA的微生物进行初步筛选。
在振摇的同时在1/10 TS肉汤中各自培养用于初步筛选的候选菌株且然后通过离心收集每种菌株的细菌细胞。用无菌蒸馏水将由此收集的细菌细胞洗涤两次并悬浮于无菌蒸馏水中。接下来用无菌蒸馏水将微生物在每一混悬液中的浓度调节至108-1010cfu/ml，由此制备了每一候选菌株的混悬液。
将由此获得的5-10株混悬液形式的候选微生物菌株彼此混合，其中混合的5-10株菌株来源于相同阶段的烟叶。由此制备了7组候选微生物的混悬液混合物。
按照与上述1)中相似的方式培养这7组候选微生物的混悬液混合物，其中将1/10 TS肉汤用作筛选降解TSNA的微生物的培养基，但不包括使用上述7组候选微生物的混悬液混合物。
作为对照组，加入5ml无菌蒸馏水取代候选微生物混悬液。
在30℃下和振摇的同时将7组混合的候选微生物混悬液和对照组保温24小时。
此后测定相应的TSNA的含量。
通过下列方法测定相应的TSNA的含量。特别使用气相色谱、按照Spiegelhalder改进的方法分别测定获自每一培养基的样品中含有的NNN、NAT、NAB和NNK含量(Spiegelhalder B.，Kubacki S.和Fischer S.(1989)Beitr.Tabakforsch.Int.，14(3)，135-143；Fischer S.和Spiegelhalder B.(1989)Beitr.Tabakforsch.Int.，14(3)，135-143)。
首先通过使用如下的柱色谱法纯化每一培养基。首先通过使用滤纸(ADVANTEC，No.5)过滤整个培养基。然后使10ml的每一滤液上填充了Kieselgur(颗粒直径：60-160nm，由MERCK Co.，Ltd.生产)和抗坏血酸的柱。通过用二氯甲烷溶解级分收集样品必需的级分。将由此获得的级分用作气相色谱的样品。通过使用安装了柱DB-17(由J & W Co.，Ltd.生产)和检测器TEA-543(由Thermedics Co.，Ltd.生产)的气相色谱HP 6890(由Hewlett-Packard Co.，Ltd.生产)分析由此获得的样品。
上述7组和对照组中相应TSNA含量的测定结果如表1中所示。
                                   表1  初步筛选结果
 组         NNN         NAT        NAB         NNK       总TSNA
 μg/10mL    (％)  μg/10mL  (％)  μg/10mL  (％)  μg/10mL   (％)  μg/10mL   (％)
 1   1.34    48.13   2.40  51.95   2.04  51.54   1.37   38.29   7.16   47.87
 2   1.96    70.26   3.03  65.39   2.96  74.62   1.77   49.48   9.71   64.95
 3   2.16    77.59   3.76  81.33   2.92  73.56   2.48   69.50   11.32   75.75
 4   1.89    67.98   4.27  92.26   3.98  100.26   2.81   78.71   12.95   86.62
 5   2.92   104.71   4.07   87.97   3.72   93.68   2.99   83.64  13.69  91.57
 6   2.43   87.25   4.36   94.13   3.86   97.19   2.76   77.34  13.40  89.65
 7   2.33   83.46   3.71   80.12   2.97   74.44   2.38   66.71  11.38  76.12
 对照组   2.79   4.63   3.97   3.57  14.95
表1中的1组和2组各自表示从收获后的烟叶中立即收集的菌株混悬液混合物。3组、4组和5组各自表示从属于熟化过程的开始阶段的变黄阶段(熟化过程的第3天)的烟叶中收集的菌株混悬液混合物。6组和7组各自表示从变褐阶段(熟化过程的第8天)的烟叶中收集的菌株混悬液混合物。在该表中，“％”表示各组中相应的TSNA的含量(％)，此时将对照组中的相应含量表示为100％。
正如从表1中明显看出的，在所有微生物混合物的组中，TSNA的含量均比对照组的TSNA含量下降。特别就TSNA的总量而言，与对照组的TSNA总量相比，1组和2组的TSNA总量分别下降至47.87％和64.95％(表1)。
从这些结果中证实已经成功地从烟叶中分离了降解TSNA的多种类型的有用的微生物。
3)降解TSNA的微生物的二次筛选
基于上述2)的结果，进一步对表现出极佳降解TSNA能力的1组和2组进行用于二次筛选的测试。
对1组和2组中含有的14株微生物菌株中的每一种测试了其降解相应TSNA的能力。
按照与上述2)中所述类似的方式测试14株菌株中每一种降解相应TSNA的能力，但每一微生物混悬液(混悬液各自与1/10 TS肉汤混合)中含有的微生物类型的数量限于选自上述1)中收集的微生物菌株中的一种菌株。
每一测定的含量值为通过两次重复测定获得的平均值。
由此获得的结果如表2中所示。
                                                       表2  每一菌株降解TSNA的能力
  测试菌株                            μg/10mL                                  (％)   组号
   NNN    NAT    NAB    NNK    TSNA    NNN     NAT    NAB    NNK     TSNA
  未加    2.21    2.61    1.95    2.10    8.87
  LG1    3.23    3.69    2.72    2.62    12.27    146.35     141.24    139.50    125.21     138.34    1
  LG2    2.32    2.48    1.84    1.43    8.06    104.75     94.79    94.59    68.01     90.90    2
  LG3    2.28    2.90    2.15    2.10    9.43    102.98     110.96    110.63    100.39     106.40    2
  LG5    2.56    3.10    2.28    0.07    8.01    116.05     118.57    117.09    3.24     90.36    2
  LG9    2.33    3.27    2.37    2.06    10.02    105.42     125.00    121.54    98.09     113.00    2
  LG38    1.49    1.97    1.30    1.27    6.03    67.43     75.40    66.66    60.63     68.00    1
  LG43    1.92    2.61    1.64    1.22    7.39    86.65     99.98    84.43    58.32     83.40    2
  LG44    1.76    3.02    1.89    1.85    8.52    79.66     115.54    97.07    88.51     96.15    2
  LG48    1.88    2.21    1.60    1.63    7.33    85.28     84.53    82.22    78.02     82.67    2
  LG51    2.08    2.30    1.69    1.25    7.32    94.02     87.90    86.71    59.86     82.54    2
  LG52    2.67    3.45    2.58    2.41    11.12    120.98     132.18    132.60    115.07     125.44    2
  LG64    3.92    4.08    2.90    3.28    14.16    177.18     156.02    148.71    156.32     159.79    1
  LG77    2.89    3.12    2.24    0.97    9.21    130.73     119.43    114.84    46.15     103.92    1
  LG81    2.91    3.48    2.48    2.86    11.73    131.53     133.36    127.47    136.44     132.34    1
正如从表2中明显看出的，LG38菌株、LG48菌株、LG51菌株和LG43菌株能够降解NNN、NAT、NAB和NNK。特别是LG38菌株分别将NNN、NAT、NAB和NNK减少至67.43％、75.40％、66.66％和60.63％。LG38菌株将总TSNA含量减少至68.00％。
此外，LG2菌株、LG5菌株和LG77菌株能够特别降解NNK。特别是LG5菌株将NNK含量减少至3.24％。
基于上述结果，选择了能够特别降解NNK的LG5菌株和特别降解相应的TSNA的LG38菌株。
上述结果表明可以通过用上述微生物处理烟叶显著减少烟叶中的TSNA。上述微生物分离自烟叶且由此在将它们置于烟叶上时表现出极佳的稳定性。推断由于具有固定在烟叶上的能力，所以所述的微生物可以以足够稳定的方式在烟叶上表现出降解TSNA的活性。
4)微生物的鉴定
将由此筛选的LG5菌株LG38菌株的细菌学特性概括在表3和表4中。
             表3
      LG5菌珠的细菌学特性
      测试项目     特性
    形状     棒形
    革兰氏染色     -
    孢子     -
    游动性     +
    倾向于氧的行为     需氧
    氧化酶     +
    过氧化氢酶     +
    OF     -
    菌落的色调     淡黄色
    硝酸盐的减少     -
    吲哚的产生     -
    葡萄糖的发酵     -
    精氨酸双水解酶     -
    脲酶   -
    七叶苷的降解   +
    明胶的液化能力   -
    β-半乳糖苷酶   -
    利用
    葡萄糖   +
    L-阿拉伯糖   +
    D-甘露糖   -
    D-甘露糖醇   -
    N-乙酰基-D-葡糖胺   +
    麦芽糖   +
    葡糖酸钾   +
    正癸酸   -
    己二酸   -
    dl-苹果酸   +
    柠檬酸钠   -
    乙酸苯酯   -
           表4
  LG38菌珠的细菌学特性
      测试项目     特性
    形状     棒形
    革兰氏染色     -
    孢子     -
    游动性     +
    倾向于氧的行为     需氧
    氧化酶     +
    过氧化氢酶     +
    OF     ○
    菌落的色调     淡黄色
    荧光色素的产生   -
    硝酸盐的减少   +
    吲哚的产生   -
    葡萄糖的发酵   -
    精氨酸双水解酶   -
    脲酶   -
    七叶苷的降解   +
    明胶的液化能力   -
    β-半乳糖苷酶   -
    利用
    葡萄糖   +
    L-阿拉伯糖   +
    D-甘露糖   +
    D-甘露糖醇   +
    N-乙酰基-D-葡糖胺   -
    麦芽糖   -
    葡糖酸钾   +
    正癸酸   +
    己二酸   -
    dl-苹果酸   +
    柠檬酸钠   +
    乙酸苯酯   -
基于上述结果，将LG5菌株鉴定为属于少动鞘氨醇单胞菌的微生物并将LG38鉴定为属于荧光假单胞菌的微生物。
借助于日本食品研究实验室(Japan Food Research Laboratories)对上述细菌进行鉴定。已经于2001年12月18日在微生物国际专利保藏所(International Patent Organism Depositary)寄存了LG5(FERM BP-7830)。类似地，已经于2001年12月18日在微生物国际专利保藏所(InternationalPatent Organism Depositary)寄存了LG38(FERM BP-7831)。
实施例2：通过用LG38菌株处理减少熟化过程中的TSNA含量
将LG38菌株接种入1/10 TS肉汤并在30℃下培养72小时。培养后，对含有细菌细胞的培养基以5000rpm进行离心以使细菌细胞分离并收集。用无菌蒸馏水将由此收集的细菌细胞洗涤两次并将其悬浮于无菌蒸馏水中。通过用无菌蒸馏水稀释该混悬液将混悬液中微生物的浓度调节至108-1010cfu/ml。
用由此调节至预定浓度的微生物混悬液处理已经收获并进行熟化过程的白莱烟(Kitakami 1)的烟叶。进行三次处理，即在收获后立即处理、在收获后3天处理和在收获后8天处理。在每次处理中，通过喷射将所述混悬液喷在烟叶的上表面和下表面，使得每1片烟叶上喷有10ml所述混悬液。
通过使用钢管室熟化由此处理的烟叶。在熟化过程的第10天和第21天收集烟叶。切割由此收集的烟叶以便分离叶片和茎。然后通过使用混合器匀化叶片和茎。将叶片部分用于测定TSNA含量。
按照于上述2)中所述类似的方式对主要4种类型的TSNA(NNN、NNK、NAT和NAB)进行测定。
将总TSNA含量表示为4种主要类型TSNA(NNN、NNK、NAT和NAB)中相应含量的总量。将结果表示在表5中。
                       表5
                TSNA的含量(μg/g)
         收获后的时间(天数)
      处理    第0天     第10天     第21天
  未处理(对照组)    0.53     0.98     3.01
  水处理    0.53     3.48     3.45
  LG38菌株处理    0.53     1.09     2.76
表5中用水处理的组表示仅用不含每次处理中的细菌细胞的水处理的组。
从表5中得知所有组中TSNA的含量随时间的消耗而增加且用水处理的组中TSNA的含量特别明显。当将用LG38菌株处理的组于不接受处理的组比较时，前者在第21天时表现出的TSNA含量低于后者。
这些结果证实LG38菌株能够减少TSNA含量。
此外，还研究了亚硝酸盐(-氮)含量对用LG38处理的作用。
对如上所述处理的烟叶的亚硝酸盐-氮含量进行测定。下文描述了测定方法。
首先从各组烟叶中收集0.5g叶片并放入50ml离心管。接下来向其中加入25ml下述提取溶液。将该混合物搅拌30分钟且然后提取亚硝酸盐。通过使用滤纸(ADVANTEC，No.1)过滤提取物。收集10ml滤液，向其中加入0.5g活性炭并将该混合物搅拌15分钟。此后通过使用滤纸(ADVANTEC，No.5)除去活性炭。将由此获得的滤液用作测定亚硝酸盐-氮含量的样品。
提取溶液：
KCl                                   (1％KCl)
磺酰胺(sulfanylamide)                 (0.5％磺酰胺)
Triton X-100                          (0.1％Triton X-100)
在测定提取物中亚硝酸盐-氮含量的过程中，使用自动分析仪(由BRAN+LUEBBE Co.，Ltd.，AACSII生产)并通过将550nm处滤波器的透射比转化成亚硝酸盐-氮含量得到亚硝酸盐-氮含量。为了使亚硝酸盐-氮着色，使用1％的磺酰胺和0.1％的N-萘基乙二胺二盐酸盐。结果如表6中所示。
                 表6
       亚硝酸盐-氮的含量(μg/g)
    收获后的时间(天数)
    处理     第0天     第10天
  未处理(对照组)     0.71     1.25
  水处理     0.71     3.29
  LG38菌株处理     0.71     1.20
从表6中明显看出，在熟化过程的第10天用水处理的组中属于TSNA形成中的物质的亚硝酸盐-氮含量显著增加。相反，当在熟化过程中第10天将用LG38菌株处理的组与不接受处理的组比较时，前者的亚硝酸盐-氮含量稍低于后者的亚硝酸盐-氮含量。
基于细菌学特性将LG38菌株鉴定为能够减少硝酸盐的菌株。然而，上述结果证实与未接受处理的组相比，LG38菌株显著抑制硝酸盐还原成亚硝酸盐。
实施例3：用LG5菌株处理对NNK含量的作用
按照与实施例2中所述类似的方式测定NNK含量，但用LG5取代实施例2方法中使用的微生物。
结果如表7中所示。
                         表7
                   NNK的含量(μg/g)
           收获后的时间(天数)
      处理     第10天     第21天     第32天
  未处理(对照组)     0.15     0.52     0.29
  水处理     0.71     0.61     0.32
  LG5菌株处理     0.59     0.78     0.22
正如从表7中明显看出的，在不接受处理的组中，NNK含量增加至第21天，而在第32天的NNK含量(当熟化过程完成时)低于第21天的含量。在用水和用LG5菌株处理的两组中，直到第21天NNK含量仍相对较高，而在不接受处理的组合中，在第32天时的NNK含量低于第21天时的含量。当将用LG5菌株处理的组与不接受处理的组进行比较时，前者第32天时的NNK含量稍低于后者第32天时的NNK含量。这些结果证实LG5菌株能够减少NNK含量。
应注意将本说明书中涉及的所有参考文献的全部内容引入本文作为参考。
本领域技术人员易于设计本发明的进一步优点和改变。由这类较大范围确定的本发明并不限于如上所示和所述的本发明的具体和有代表性的方面。因此，能够对本发明进行各种修改而不会脱离由待批权利要求及其等同范围所定义的本发明全面的实质和范围。
实施例4：用降解TSNA的细菌处理对烟叶粉末中TSNA含量的作用
分别将LG5菌株和LG38菌株接种在1/10 TS肉汤上并在30℃下培养72小时。对含有细菌细胞的培养基以5000rpm进行离心以便收集细菌细胞。用无菌蒸馏水将细菌细胞洗涤两次并将其悬浮于无菌蒸馏水中。将各混悬液中细菌细胞的浓度调节至108-1010cfu/ml，由此得到微生物混悬液作为接种物。
在LG5菌株的实验中，使用Japan Tobacco Inc的生长在烟叶研究中心(Leaf Tobacco Research Center)(Oyama-shi，Tochigi县)的烟草植物(品种：Kitakami 1)的切碎冻干粉。在LG38菌株的实验中，使用与如上所述相同的烟草植物的叶茎部位的冻干粉。
将经测定量的每种相应类型的烟草粉放入研钵并向其中加入微生物混悬液，使得该混合物的含湿量达到预定值。用研杵混合该混合物，使得粉末表现出含湿量的均匀分布。经由此获得的经测定量的粉末放入锥形瓶并始终保留在预定温度下。
分别对取自上述用微生物处理前的烟草粉末的样品和取自处理后保留4周的烟草粉末进行分析。将5g各样品放入200ml锥形瓶，向其中加入100ml的0.01M MaOH水溶液(含有100μg/ml的乙基汞硫代水杨酸钠)并通过使用搅拌器在室温下提取2小时。此后，用滤纸(ADVANTEC，No.5)过滤提取物。
接下来通过实施例1中所述的方法分析NNN、NNK、NAT和NAB。
用微生物处理前和处理后4周的TSNA含量如表8和9中所示。
         表8用LG38菌株处理导致的烟叶粉末中TSNA含量的改变
 处理   测试菌株   含湿量(％)  处理温度(℃)               处理前
    NNN(μg/g)     NAT(μg/g)    TSNA(μg/g)
  1    LG38     20     20     4.87    2.92    7.79
  2    LG38     20     30     4.87    2.92    7.79
  3    LG38     40     20     4.87    2.92    7.79
  4    LG38     40     30     4.87    2.92    7.79
 处理             处理后4周    NNN含量的改变(处理后-处理前)(μg/g)    NAT含量的改变(处理后-处理前)(μg/g)   TSNA含量的改变(处理后-处理前)(μg/g)
    NNN(μg/g)     NAT(μg/g)    TSNA(μg/g)
 1    4.80     2.91    7.71     -0.07      -0.01     -0.08
 2    4.67     2.55    7.22     -0.20      -0.37     -0.57
  3     3.93     2.65     6.58     -0.94     -0.27     -1.21
  4     3.46     2.61     6.07     -1.41     -0.31     -1.72
*未显示NAB和NNK的含量值，因为这些数值低于检测极限。
              表9用LG5菌株处理导致的烟叶粉末中NNK含量的改变
 处理  测试菌株  含湿量(％)   处理温度(℃)   处理前  处理后4周  NNK含量的改变(处理后-处理前)(μg/g)
    NNK(μg/g)    NNK(μg/g)
  1   LG5    20     20     0.90    0.63     -0.27
  2   LG5    20     30     0.90    0.33     -0.57
  3   LG5    40     20     0.90    0.00     -0.90
  4   LG5    40     30     0.90    0.21     -0.69
*未显示NAB的含量值，因为它低于检测极限。
从上述实验中已经证实LG5菌株特别降解NNK且LG38降解NNN、NAT、NAB和NNK。
与处理前相比，用LG5菌株处理后4周的烟草植物切碎粉末中的NNK含量下降。当将用LG38菌株处理后4周的烟草植物叶茎部位粉末中的NNN和NAT含量与处理前比较时，在所有处理的组中NNN和NAT含量均下降。即在测试烟草粉末的实验中，按照与上述实验中观察到的类似的方式，LG5菌株降解NNK且LG38菌株降解NNN和NAT。
实施例5：用降解TSNA的细菌处理对储存中的烟叶中的TSNA含量的作用
将LG38菌株接种入1/10 TS肉汤并在30℃下培养72小时。培养后，对含有细菌细胞的培养基以5000rpm进行离心以便收集细菌细胞。用无菌蒸馏水将由此收集的细菌细胞洗涤两次并将其悬浮于无菌蒸馏水中。将混悬液中细菌细胞的浓度调节至108-109cfu/ml，由此得到微生物混悬液作为接种物。
将由此制备的微生物混悬液喷在处于钢管室熟化过程中的白莱烟烟叶的上表面和下表面(干燥叶茎的最终阶段，第29天，品种：Kitakami 1)，使得每1片烟叶上喷有10ml所述的混悬液。将由此处理的烟叶在钢管室内再熟化3天且然后用于储存测试。
分析样品的收集：在开始储存烟叶前，将取自钢管室的熟化烟叶的一半叶片选作样品，此后进行处理。储存剩余一半带茎的叶片。在温度和湿度各自保持恒定的预定条件下进行储存。在储存条件方面，分别设定3组：温度20℃和湿度70％；温度20℃和湿度80％；以及温度30℃和湿度80％。在储存开始后1个月和3个月进行取样。在与上述相同的条件下储存熟化的烟叶，但不用微生物处理烟叶，并将获得的烟叶用作对照组样品。将由此取样的烟叶分离成叶片和茎且然后通过使用混合器磨碎冻干的叶片样品。仅将叶片样品用于测定TSNA含量。
将如上所述处理的5g各组叶片样品放入200ml锥形瓶，向其中加入100ml的0.01M MaOH水溶液(含有100μg/ml的乙基汞硫代水杨酸钠)并通过使用搅拌器在室温下提取2小时。此后，用滤纸(ADVANTEC，Co.，Ltd.，No.5)过滤提取物。
通过实施例1中所述的方法分析NNN、NNK、NAT和NAB。
结果如表10中所示。
                                        表10  用微生物处理导致的储存中的烟叶中TSNA含量的改变
  处理  储存温度(℃)  储存湿度(％)                         开始储存时                         储存后1个月
   NNN(μg/g)     NAT(μg/g)    NAB(μg/g)     NNK(μg/g)    TSNA(μg/g)    NNN(μg/g)     NAT(μg/g)     NAB(μg/g)    NNK(μg/g)    TSNA(μg/g)
未处理   20   70    0.62    1.63    0.00    0.18    2.43    0.64     1.79    0.00    0.03    2.46
未处理   20   70    1.37    3.32    0.05    0.37    5.11
未处理   30   70    0.86    1.71    0.00    0.13    2.70    0.98     1.92    0.00    0.00    2.90
未处理   30   70    0.51    1.44    0.01    0.21    2.17
未处理   30   80    0.84    1.69    0.00    0.13    2.66    0.92     1.65    0.00    0.00    2.57
未处理   30   80    0.95    2.09    0.00    0.16    3.20
LG38   20   70    0.51    1.08    0.00    0.09    1.68    0.45     0.94    0.00    0.03    1.42
LG38   20   70    1.07    2.27    0.00    0.14    3.48
LG38   30   70    0.62    1.36    0.00    0.11    2.09    0.55     1.20    0.00    0.00    1.75
LG38   30   70    1.01    1.40    0.00    0.14    2.55
LG38   30   80    0.54    1.24    0.00    0.14    1.92    0.52     1.18    0.00    0.00    1.70
LG38   30   80    0.49    1.19    0.00    0.09    1.77
  处理     TSNA含量的改变(储存1个月后-储存前)(μg/g)                                储存后3个月     TSNA含量的改变(储存3个月后-储存前)(μg/g)
      NNN(μg/g)      NAT(μg/g)      NAB(μg/g)     NNK(μg/g)    TSNA(μg/g)
未处理         0.03
未处理      1.52     3.55     0.07     0.00    5.14          0.03
未处理         0.20
未处理      0.98     2.94     0.04     0.00    3.96          1.79
未处理         -0.09
未处理      2.01     2.22     0.02     0.00    4.25          1.05
LG38         -0.26
LG38      1.08     2.13     0.00     0.00    3.21          -0.27
LG38         -0.34
LG38      1.19     1.42     0.00     0.00    2.61          0.06
LG38         -0.22
LG38      0.60     1.06     0.00     0.00    1.66          -0.11
在未处理的组中，储存后1个月TSNA的含量在“20℃-70％组”和“30℃-70％组”中增加。特别地，在未处理的组中，储存后3个月TSNA的含量在“30℃-70％组”和“30℃-80％组”中显著增加。在用LG38菌株处理的组中，观察到TSNA含量在1个月和3个月后均下降的趋势。在用LG38菌株处理的组中，储存后1个月TSNA含量特别显著地下降。

Claims (15)

1.减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物处理烟叶的步骤，所述的微生物具有减少TNSA的能力且选自少动鞘氨醇单胞菌和荧光假单胞菌组成的组。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于在收获烟叶前立即和/或从开始熟化过程到完成储存过程的时限中用能够减少TNSA的微生物对烟叶进行处理。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于用能够减少TNSA的微生物处理烟叶的步骤通过将所述微生物的细菌细胞以混悬液态或干态喷或涂布在烟叶上来进行。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于用能够减少TNSA的微生物处理烟叶的步骤通过将所述微生物的细菌细胞以混悬液态或干态喷或涂布在烟叶上来进行。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于TSNA是至少一种类型的TSNA，它选自N’-亚硝基降烟碱、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亚硝基新烟草碱和N’-亚硝基假木贼碱组成的组。
6.权利要求1的减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于烟叶获自烟草品种，所述的烟草品种选自日本家用品种和白莱烟品种组成的组。
7.减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物处理烟叶的步骤，所述的微生物能够减少TNSA且选自少动鞘氨醇单胞菌LG5菌株和荧光假单胞菌LG38菌株组成的组。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于在收获烟叶前立即和/或从开始熟化过程到完成储存过程的期限中用能够减少TNSA的微生物对烟叶进行处理。
9.权利要求7所述的方法，其特征在于用能够减少TNSA的微生物处理烟叶的步骤通过将所述微生物的细菌细胞以混悬液态或干态喷或涂布在烟叶上来进行。
10.权利要求7所述的方法，其特征在于所述的TSNA是至少一种类型的TSNA，它选自N’-亚硝基降烟碱、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亚硝基新烟草碱和N’-亚硝基假木贼碱组成的组。
11.权利要求7的减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于烟叶获自烟草品种，所述的烟草品种选自日本家用品种和白莱烟品种组成的组。
12.属于少动鞘氨醇单胞菌或荧光假单胞菌且具有减少烟叶中至少一种类型的TSNA含量的能力的微生物，所述的至少一种类型的TSNA选自N’-亚硝基降烟碱、4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亚硝基新烟草碱和N’-亚硝基假木贼碱组成的组，其中这些TSNA在烟叶熟化和储存过程中形成。
13.能够减少烟叶中TSNA含量的少动鞘氨醇单胞菌LG5菌株(FERMBP-7830)。
14.能够减少烟叶中TSNA含量的荧光假单胞菌LG38菌株(FERMBP-7831)。
15.减少烟叶中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物处理烟叶的步骤，所述的微生物具有降解TSNA的能力且选自少动鞘氨醇单胞菌和荧光假单胞菌组成的组。
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