CN113717897A - 一株霍氏肠杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体涉及一株霍氏肠杆菌及其应用。所述霍氏肠杆菌菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22156。该菌可作为发酵菌株在复烤后烟叶发酵中发挥作用。本申请的霍氏肠杆菌可发酵复烤后烟叶使糠醛、苯乙醛、香叶醇、茄酮、(E)‑β‑大马酮、二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c、巨豆三烯酮d、法尼基丙酮等香味物质增加，提高了烟叶的香气质和香气量、降低刺激，增加甜润感，能改善卷烟的口感。

Description

一株霍氏肠杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体涉及一株霍氏肠杆菌及其应用。
背景技术
在卷烟工业生产中，不同地区的烟叶有其独特的特点，卷烟厂根据需求向各地烟农购买烟叶，但由于收购的烟叶质量参差不齐，往往会出现难以进入卷烟配方的烟叶。为处理这一类烟叶烟草企业往往要花费大量的经费，部分烟叶一方面有可能因库存年限过长而导致废弃，另一方面在仓库囤积占用人力物力，已经严重影响到了企业的效益。这一类香气量少、香气质差、杂气大、刺激性大的烟叶统称为不适用、难适用烟叶。这类烟叶的产生主要是由于烟叶农业种植和卷烟工业生产存在的结构性矛盾造成，工业企业目前积压这类烟叶大量库存，如何有效利用这类不适用烟叶已经成为行业亟需解决的重大问题。
随着生物科技的不断进步，生物技术已渗透到各个科技和产业领域，微生物处理烟叶技术已经逐步运用到了烟草工业生产中。目前微生物和酶处理技术已经可以用于烟叶处理，烟草薄片生产，烟用香料制备等方面。相关研究显示可以通过对烟叶中淀粉、纤维素和蛋白质的降解处理提升烟草的吸食品质，例如降解过高含量的淀粉可以降低卷烟抽吸时的枯焦气息，降解过高含量的蛋白质可以降低卷烟抽吸时的苦味及蛋白质燃烧时特有的烧焦羽毛气味。现阶段大量研究表明，利用从烟草土壤、烟叶表面、初烤烟叶表面等筛选出的微生物在处理烟叶后能够增加烟叶的香气质和香气量并降低烟叶的杂气、刺激性。
发明内容
本发明为提高烟草品质，提供了一株霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株有效提高烟叶品质的霍氏肠杆菌，该霍氏肠杆菌的分类学命名为Enterobacter hormaechei，该菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22156；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355。
在一些实施方式中，前述霍氏肠杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ IDNO.1所示的序列。
本发明进一步提供快速培养前述所述霍氏肠杆菌的培养方法，其步骤如下：将霍氏肠杆菌菌液按1～3％的接种量，接种到培养基1中，温度25～35℃，转速100～150r/min，培养12～18h即可。
在一些实施例中，所述培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
本发明再进一步将前述所述的霍氏肠杆菌用于发酵复烤后的烟叶以提高烟叶品质。
本发明将霍氏肠杆菌应用于发酵复烤后的烟叶，发酵后，能够显著提高烟叶香气质和香气量、降低刺激，增加甜润感，能改善复烤后的烟叶的口感。
在一些具体实施例中，本发明提供一种霍氏肠杆菌在发酵复烤后的烟叶上的应用方法，包括以下步骤：
1)培养基的配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
2)菌株活化：将霍氏肠杆菌活化培养，得到霍氏肠杆菌活化液；菌株活化条件为：25～35℃、100～150r/min条件下震荡培养12～18h；
3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比1～3％接种到上述步骤1)中的培养基中形成种子液，接种后的发酵培养条件同活化培养条件，培养时间为12～18h。种子液按1～3％接种量接种于LB培养基中，培养条件同活化培养条件，培养至OD600 0.8～1，获得发酵液；
4)将步骤3)中所得的发酵液在4℃、10000r/min条件下进行高速离心，用无菌水进行复溶，将得到的悬浮液按0.20×107～0.35×107cfu/g对复烤后的烟叶进行均匀喷洒；
5)将步骤4)中处理好的烟叶在温度为30～37℃，湿度为60～80％的恒温恒湿箱中发酵16～30h。
通过GC-MS检测烟末中的香气成分后发现，糠醛、苯乙醛、香叶醇、茄酮、(E)-β-大马酮、二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c、巨豆三烯酮d、法尼基丙酮的含量都有所提高。
大马酮类化合物具有类似玫瑰的清甜香气可以赋予烟气清甜感；有新鲜萝卜样香味，茄酮能醇和、丰满烟气；巨豆三烯酮本身具有干草样甜香，其量的增加可以提高烟草甜香，使烟气和顺。苯乙醛具有优雅的花香
本发明的有益效果在于：
(1)霍氏肠杆菌可以在16～30h内发酵复烤后的烟叶，并且对其品质的改善明显。说明该菌可用于烟叶的发酵；另一个有益效果在于将霍氏肠杆菌直接应用于发酵复烤后的烟叶上；发明人对烟叶中是否添加霍氏肠杆菌带来的效果进行了产品检测，选取了11位品烟人员进行品鉴，总结品烟人的品鉴评价如下表：
对照 香气量和香气质不足，生杂气、木质气较大，甜感不明显
处理 香气质提升，杂气降低，有清甜感，口感柔绵，润感提升
(2)在烟叶的陈化期间，本申请的霍氏肠杆菌可增加复烤后的烟叶的香味物质，从而增加烟叶香味。
附图说明
图1为霍氏肠杆菌的平板图；
图2为霍氏肠杆菌的电镜图；
图3为霍氏肠杆菌的生长曲线；
图4空白复烤后的烟叶中性成分总离子流图；
图5霍氏肠杆菌处理后的烟叶中性成分总离子流图。
具体实施方式
实施例1
本实施方式提供一株有效对烟叶增香除杂的霍氏肠杆菌，所述霍氏肠杆菌菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22156；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355。
所述霍氏肠杆菌菌株为革兰氏阴性菌，如图2所示，菌株大小为0.6～0.8μm×1.5～2.0μm，呈细杆状，无鞭毛，如图1所示，在平板上为黄色圆斑状。前述霍氏肠杆菌的16SrDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
有效对烟叶增香除杂的霍氏肠杆菌的培养方法，其步骤如下：将霍氏肠杆菌菌液按1～3％的接种量，接种到培养基中，温度30～37℃、转速100～150r/min条件下培养12～18h即可。
所述培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
实施例2
一、实验准备
液体LB培养基的公开配方：
酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
种子液的制备：
将保存在斜面中的霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei.)接种到30mL的LB培养基中，培养12h后备用。
二、微生物处理
将霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)菌株接种到液体LB培养基中，在25～35℃、100～150r/min的摇床上培养过夜。培养过夜的菌液按1～3％的接种量接种于空白LB培养基中，待OD600为0.8～1时将培养好的菌液于4℃、10000r/min下离心10min，弃去上清，用等量的无菌水进行复溶，再次在离心机中进行离心，弃去上清，用成倍的无菌水进行复溶。
将复溶好的菌悬液摇匀；
将得到的菌悬液按0.20×107～0.35×107cfu/g均匀的喷洒到烟叶(YNO118BEQ)表面，放置温度为30～37℃，湿度为60～80％的恒温恒湿箱中发酵16～30h；加等量无菌水处理烟叶为对照组。
称取发酵完全的烟叶，按照行业标准进行切丝，卷制成卷烟，将卷烟放到温度22℃，相对湿度为60％的恒温恒湿箱中平衡48h。用于评吸实验使用，再称取适量烟叶用多功能粉碎机打碎成烟末，过40mm的分样筛，称取过筛后的烟叶粉末30g置于1000ml的圆底烧瓶中，再向其中加入沸石和400ml的纯净水，量取100ml的二氯甲烷倒入250ml的圆底烧瓶中。将两个烧瓶放到同时蒸馏萃取装置上，蒸馏时间2.5h。
将得到的萃取液分别用5％的HCl和5％的NaOH进行酸碱萃取，得到中性萃取液，向其中加入适量的无水硫酸钠除水，同时加入100μL的2,6-二氯甲苯作为内标冷藏干燥过夜，冷藏干燥过夜后进行浓缩蒸馏，浓缩至1mL。过有机膜后进行GC-MS检测。
用于GC-MS检测。
GC-MS的检测方法如下：色谱条件：Agilent 19091S-436HP-5MS毛细管柱(60m×250μm×0.25μm)；进行口温度：280℃；载气：99.999％高纯度氦气，流速：1.0ml/min；分流模式为不分流进样，进样量为1.0μL。
升温程序：初始温度为50℃，保持3min，然后以5℃/min的升温速度升至120℃，保持10min，以4℃/min升至180℃，保持10min，以0.6℃/min升至210℃，再以4℃/min升至280℃结束；
质谱条件：采用SCAN模式，传输线温度280℃；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；离子源为XTR-EI源，电子能量为70eV；溶剂延迟时间为8min；扫描范围：10～550u。GC-MS检测结果如图3、4与表1所示，
表1霍氏肠杆菌处理烟叶前后中性香气物质对比图
Figure BDA0003282044530000041
Figure BDA0003282044530000051
结果表明：经过发酵，烟叶中的糠醛、苯乙醛、香叶醇、茄酮、(E)-β-大马酮、二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c、巨豆三烯酮d、法尼基丙酮的含量均有大幅提高。
评吸实验结果如表2所示。
表2感官评吸评价表
对照 香气量和香气质不足，生杂气、木质气较大，甜感不明显
处理 香气质提升，杂气降低，有清甜感，口感柔绵，润感提升
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
序列表
Figure BDA0003282044530000061
序列表
<110> 浙江中烟工业有限责任公司
<120> 一株霍氏肠杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaagcagct tgctgcttcg ctgacgagtg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg 60
cctgatggag ggggataact actggaaacg gtagctaata ccgcataacg tcgcaagacc 120
aaagaggggg accttcgggc ctcttgccat cggatgtgcc cagatgggat tagctagtag 180
gtggggtaac ggctcaccta ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac 240
actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 300
tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtatgaaga aggccttcgg gttgtaaagt 360
actttcagcg gggaggaagg cgttaaggtt aataaccttg tcgattgacg ttacccgcag 420
aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa 480
tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc 540
gggctcaacc tgggaactgc attcgaaact ggcaggctag agtcttgtag aggggggtag 600
aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg 660
ccccctggac aaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 720
ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtcg acttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct 780
tccggagcta acgcgttaag tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa 840
atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga 900
agaaccttac ctactcttga catccagaga acttagcaga gatggtttgg tgccttcggg 960
aactctgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag 1020
tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg ttaggccggg aactcaaagg 1080
agactgccag tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac 1140
gagtagggct acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga gaagcgacct cgcgagagca 1200
agcggacctc ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag 1260
tcggaatcgc tagtaatcgt ggatcagaat gccacggtga atacgttccc gggccttgta 1320
cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagc 1369

Claims (8)

1.一株霍氏肠杆菌，其特征在于：该霍氏肠杆菌已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22156。
2.如权利要求1所述的霍氏肠杆菌，其特征在于，前述霍氏肠杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.如权利要求1或2所述的霍氏肠杆菌的培养方法，其特征在于其步骤如下：将霍氏肠杆菌菌液按1～3％的接种量，接种到培养基中，温度25～35℃，转速100～150r/min，培养12～18h即可。
4.如权利要求1或2所述的霍氏肠杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
5.如权利要求1或2所述的一株霍氏肠杆菌用于发酵复烤后的烟叶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该应用包括将菌株进行培养获得发酵液，将发酵液喷洒在烟叶上进行发酵。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，相较于发酵前的烟叶，发酵后烟叶中的糠醛、苯乙醛、香叶醇、茄酮、(E)-β-大马酮、二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c、巨豆三烯酮d、法尼基丙酮香味成分增加。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：
1)培养基的配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
2)菌株活化：将霍氏肠杆菌活化培养，得到霍氏肠杆菌活化液；菌株活化条件为：25～35℃、100～150r/min条件下震荡培养12～18h；
3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比1～3％接种到上述步骤1)中的培养基中形成种子液，接种后的发酵培养条件同活化培养条件，培养时间为12～18h；种子液按1～3％接种量接种于LB培养基中，培养条件同活化培养条件，培养至OD600 0.8～1，获得发酵液；
4)将步骤3)中所得的发酵液在4℃、10000rpm/min条件下进行高速离心10min，使用无菌水进行复溶，将得到的悬浮液按照0.20×107～0.35×107cfu/g对复烤后的烟叶进行均匀喷洒；
5)将步骤4)中处理好的烟叶在温度为30～37℃，湿度为60～80％环境中发酵16～30h。
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