CN115725433B

CN115725433B - 一种霍氏肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115725433B
Application number: CN202210252839.9A
Authority: CN
Inventors: 王燕; 李江波; 管麟; 王春伟; 赵晓军
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN115725433A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种霍氏肠杆菌及其应用，具体为霍氏肠杆菌TY18，该霍氏肠杆菌TY18保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2022258。本发明提供的霍氏肠杆菌TY18对三唑酮、三唑醇、丙环唑、己唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑、烯唑醇、氟硅唑9种农药均有降解效果。

Description

一种霍氏肠杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种霍氏肠杆菌及其应用。

背景技术

三唑酮，化学名称为1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-l-基) -α-丁酮，又名粉锈宁，百里通，是一种生产上常用的内吸性广谱类三唑类杀菌剂，主要用于防治各种作物上的白粉病、锈病、叶枯病和灰霉病等多种真菌性病害，也可调节植物的生长。三唑酮在我国的使用量远高于其他三唑类农药，其原药总消费量占三唑类杀菌剂的30％以上。

在应用中发现，三唑酮的稳定性强，有很好的移动性和吸附性，在水体和土壤等环境中容易持续积累，造成土壤及水体环境污染。对破坏生态系统造成，甚至危及人体健康[刘娜,金小伟,穆云松,冯承莲,吴丰昌,王业耀.三唑酮在水环境中的环境行为、毒性效应及生态风险.生态毒理学报,2017,12(4):65-75.]。美国环境保护署(US EPA 2006)经过调查发现，三唑酮急性经口对淡水鱼和无脊椎动物具有中等毒性，对啮齿动物在高剂量下被认定为致癌物和生殖毒性物，可损伤大鼠肝脏，且对人体具有致癌性，已被列为“潜在人类致癌物”。因此，如何降解三唑酮在环境中的残留备受关注。

对于农药污染的环境修复主要有物理修复、光化学修复、动植物和微生物修复等途径。其中微生物修复具有简便、快速、安全、高效的特点，且微生物种类多样、分布广泛，对环境适应性强，因此，将微生物用于环境中三唑酮的降解及污染环境的生物修复，具有很好的应用前景(田春燕,徐军,董丰收,刘新刚,吴小虎,郑永权.微生物降解三唑类杀菌剂研究进展.农药学学报,2016,18(2): 141-150)。因此，不断研究新的菌株在降解三唑类杀菌剂方面具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明第一个方面提供一株霍氏肠杆菌，其保藏名称为霍氏肠杆菌TY18，保藏编号为CCTCC NO:M 2022258，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

优选地，所述霍氏肠杆菌在降解三唑类农药中的用途。

本发明第二个方面提供一种所述霍氏肠杆菌的发酵方法，是将所述霍氏肠杆菌TY18接种于LB液体培养基中，28～32℃、pH 7.0～8.0下振荡培养14～18h。

本发明第三个方面提供了根据上述发酵方法得到的发酵液。

本发明第四个方面提供了发酵液在降解三唑类农药中的用途。

优选地，所述三唑类农药为三唑酮、三唑醇、丙环唑、己唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑、烯唑醇、氟硅唑中的一种或几种。

本发明第五个方面提供一种用于降解三唑类农药的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述霍氏肠杆菌株TY18和/或所述发酵液，以及可接受的辅料或载体。

本发明第六个方面提供一种所述霍氏肠杆菌的富集培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

取三唑类农药长期污染的土壤，接于含10mg/L三唑类农药的CSM富集培养液中，在28～32℃、160～200r/min下培养5～7d；

取上述接种土壤后的CSM富集培养液加入到含100mg/L三唑类农药的CSM 富集培养液中，培养5～7d；继代培养4～7次后，采用稀释涂平板法从中分离获得所述霍氏肠杆菌TY18；继续在含100mg/L三唑类农药的CSM固体培养基平板上于28～32℃下培养3～5d，即得纯化后的霍氏肠杆菌TY18单菌落。

优选地，所述CSM富集培养液按重量份数计是由以下原料制成：葡萄糖1份、KH₂PO₄0.5份、K₂HPO₄ 1.5份、NaCl 0.5份、MgSO₄·7H₂O 0.5份、水1000 份；所述CSM富集培养液pH为7.0；

所述CSM固体培养基是向所述CSM富集培养液中加入15份琼脂，所述CSM 固体培养基pH为7.0。

优选地，所述土壤的接种量与所述含10mg/L三唑类农药的CSM富集培养液中三唑类农药的质量比为10000∶1～1.5；

所述接种土壤后的CSM富集培养液与所述含100mg/L三唑类农药的CSM 富集培养液的体积比为1∶8～10。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的霍氏肠杆菌TY18对三唑酮的降解率达到55.91％，对三唑醇、丙环唑、己唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑、烯唑醇、氟硅唑8种农药也均有一定降解效果，降解率为26.63～43.93％。

生物保藏信息说明：

生物材料：TY18，分类学命名：霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaeechei)，已于2022年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2022258。

附图说明

图1是菌株TY18在NA培养基上28℃下培养2d的形态特征(A)和在CSM 培养基上对三唑酮的降解圈(B)；

图2是基于16S rRNA和gyrB基因序列构建菌株TY18的系统发育树图，A： 16SrRNA；B：gyrB基因；

图3是菌株TY18的生长曲线；

图4是菌株TY18对三唑酮的降解效果及生长量变化。

具体实施方式

下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以下给出本发明实施例中使用到的各种培养基的具体组成。

牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、琼脂粉15g，pH 7.0。

LB液体培养基：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL， pH 7.0。

CSM富集培养液：葡萄糖1.0g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 1.5g、NaCl 0.5g、 MgSO₄·7H₂O0.5g、水1000mL，pH 7.0。

筛选培养基(CSM固体培养基)：葡萄糖1.0g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 1.5g、 NaCl0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、15g琼脂、水1000mL，pH 7.0。

若未特别指明，实施例中所使用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中的霍氏肠杆菌分离自山西农业大学试验田，采用富集培养法筛选出一株编号为TY18的三唑酮降解菌株。通过对所获得菌株进行形态特征、生理生化特性及16SrRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该菌株的培养方法、对三唑酮的降解效果进行了深入研究，为三唑酮降解提供了新的降解微生物资源，解决因三唑酮超标引起的环境污染问题奠定基础。

实施例1

霍氏肠杆菌菌株TY18的分离及筛选：

霍氏肠杆菌菌株TY18来源于山西省晋中市太谷区山西农业大学试验田三唑酮长期污染的土壤中。该霍氏肠杆菌经过富集培养法培养、稀释分离法分离及纯化获得，可利用三唑酮作为其生长的唯一氮源。具体的，包括以下步骤：

将三唑酮长期污染的土壤样品过20目筛，称取10g土壤样品，接于含10mg/L 三唑酮的100mL CSM富集培养液中，于28℃、160r/min振荡培养7d。取10mL 接种土壤后的CSM富集培养液加入到90mL含有100mg/L三唑酮的CSM富集培养液中，培养7d。振荡培养7d后仍以该方法依次转移至三唑酮质量终浓度为 150mg/L的CSM富集培养液中驯化。继代培养5次后，CSM富集培养液中三唑酮的浓度逐渐增加到400mg/L。

将继代培养后的CSM富集培养液用无菌水按10^-3、10^-4和10^-5进行梯度稀释，取100μL涂布于含100mg/L三唑酮的CSM固体培养基平板上，28℃恒温培养4d。通过平板划线法对菌落在NA培养基上进行纯化。

挑取纯化后的单菌落接于LB液体培养基中于pH7.0～8.0条件下，28～32℃摇床振荡培养14～18h，获得发酵培养液即为含菌悬液。

在含有100mg/L三唑酮的CSM固体培养基平板上均匀打4个直径为8mm 孔洞，吸取50μL菌液缓慢注入对向的2个孔洞中，同时在另外两个孔洞中注入等量LB液体培养基作为对照。28℃培养4d，每隔24h观察接菌处是否有透明圈产生，初步判断该菌株对三唑酮有降解能力，从中筛选出一株编号为TY18的三唑酮降解菌株。图1(B)是菌株TY18在CSM固体培养基上对三唑酮的降解圈。

将获得的具有降解作用的菌株于4℃冰箱保存。

实施例2

霍氏肠杆菌菌株TY18的分离及筛选：

具体包括以下步骤：

将三唑酮长期污染的土壤样品过20目筛，称取10g土壤样品，接于含15mg/L 三唑酮的100mL CSM富集培养液中，于28℃、160r/min振荡培养7d。取10mL 接种土壤后的CSM富集培养液加入到100mL含有100mg/L三唑酮的CSM富集培养液中，培养7d。振荡培养7d后仍以该方法依次转移至三唑酮质量终浓度为 150mg/L的CSM富集培养液中驯化。继代培养5次后，CSM富集培养液中三唑酮的浓度逐渐增加到400mg/L。

在含有100mg/L三唑酮的CSM固体培养基平板上均匀打4个直径为8mm 孔洞，吸取50μL菌液缓慢注入对向的2个孔洞中，同时在剩余的两个孔洞中注入等量LB液体培养基作为对照。28℃培养4d，每隔24h观察接菌处是否有透明圈产生，初步判断该菌株对三唑酮有降解能力，从中筛选出一株编号为TY18的三唑酮降解菌株。

采用实施例1-2的方法均筛选得到降解菌株TY18，且菌株的性质及降解效果无差别，故以下仅以实施例1分离筛选的降解菌株TY18为例对菌株的性质及降解效果进行说明。

实施例3

霍氏肠杆菌菌株TY18的形态特征及生理生化特性：

将实施例1筛选得到的降解细菌菌株TY18接种于NA培养基上，28℃条件下培养48h。根据细菌菌株生长的菌落形态特征，包括大小、光泽、隆起、形状、透明度、均匀度、边缘等，以及菌株生理生化特性等，参照《常见细菌系统鉴定手册》[东秀珠,蔡妙英.2001.北京:科学出版社.]进行鉴定。

图1(A)是霍氏肠杆菌菌株TY18在NA培养基上28℃下培养48h后的菌体形态特征。菌株TY18在NA培养基上菌落近圆形，菌落颜色为白色，无芽孢，表面光滑，边缘整齐，不透明。

具体生理生化试验结果见表1。

表1菌株TY18的生理生化特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

由表1可知，菌株TY18在30～40℃可以生长，pH5.7和6.8均可以生长。不产生吲哚，不产生硫化氢。菌株TY18可以利用半乳糖醇、L-鼠李糖、D-甘露糖和蔗糖，但不能利用D-山梨糖醇、甘油和棉子糖。V-P试验、柠檬酸利用、D- 葡萄糖产酸、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶和丙二酸利用呈阳性，明胶水解、尿素水解、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶呈阴性。

根据形态特征及生理生化试验结果，初步鉴定菌株TY18属于肠杆菌属(Enterobacter sp.)。

实施例4

霍氏肠杆菌菌株TY18的分子鉴定：

将实施例1筛选得到的降解细菌菌株TY18接种于LB液体培养基，于28℃、 180r/min条件下振荡培养12h。采用BioFlux BSC12S1细菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)，按照说明书操作步骤提取细菌的DNA。

16S rRNA基因序列分析采用25μL PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL， dNTP(10mM) 2μL，MgCl₂ 1μL，浓度10mM的通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)各1μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶 0.5μL，ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，34个循环(94℃ 45s，45℃1min，72℃90s)，72℃10min。PCR扩增产物纯化后测序。

促旋酶B亚基(gyrB)基因序列分析采用25μLPCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mM) 2μL，MgCl₂ 1μL，浓度10mM的引物UP-1 (5’-GAAGTCATCATGACC GTTCTGCACTGCATCGGGATCGGGATCGAAAGTTCTGA-3’)和UP-2(5’-AGCAGGG TACGGATGTGCGAGCCAGTCATCGACAGTCATCGGCAGTCATCGGTCAT-3’) 各1μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸2min， 35个循环；72℃温育8min。

将所得的PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件80V，40min。

将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。16S rRNA基因序列的测序引物与PCR扩增引物相同，gyrB基因序列扩增引物为UP-1S (5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)和UP-2Sr (5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)。

获得菌株TY18的16S rRNA序列(1042bp)和gyrB基因序列(1000bp)，将测序结果与NCBI数据库中的序列进行Blast比对，下载相关序列，使用MEGA 5.05 软件中的最大似然法构建系统发育树。

16S rRNA系统发育分析表明菌株TY18与Enterobacter hormaechei BHW6(MN696244.1)、C45(CP042551.1)和PB18(MN689678.1)聚于同一分支。gyrB基因序列系统发育分析表明菌株TY18与Enterobacter hormaechei ME-1 (CP041733.1)聚于同一分支(图2)。

经上述微生物学分类与鉴定，确定获得的菌株属于霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)。

实施例5

霍氏肠杆菌菌株TY18的生长曲线测定：

挑取实施例1筛选得到的新鲜霍氏肠杆菌菌株TY18单菌落接种于LB液体培养基中，于28℃、180r/min条件下振荡培养12～14h，即得到种子液。调整 OD₆₀₀＝1，以1％的接种量接入新的LB培养基中继续振荡培养，每隔1h取一次样，通过紫外可见分光光度计检测菌株生长量(OD₆₀₀)。以培养时间为横坐标，菌株生长量(OD₆₀₀)为纵坐标制作生长曲线。

菌株TY18在接种后的2～12h为菌体繁殖速度最快的对数生长期，细菌细胞数量显著增长，12h后进入稳定期，菌株生长量(OD₆₀₀)相对稳定(图3)。

实施例6

霍氏肠杆菌菌株TY18对三唑酮的降解特性：

用无菌水调整发酵液OD₆₀₀＝1，取1mL发酵液接于100mL含有100mg/L三唑酮的CSM液体培养基中，于28℃、160r/min振荡培养。于1、2、3、4、5、6 和7天后，分别吸取CSM培养液用于进一步分析。

三唑酮提取条件：取2mLCSM培养液于50mL离心管中，加入20mL二氯甲烷，置于涡旋震荡仪上涡旋5min充分混匀后，倒入分液漏斗中，充分震荡混匀3min后，静置15min，将下层二氯甲烷缓慢接入旋蒸瓶中。再用20mL二氯甲烷重复提取1次。将有机相于30℃旋转蒸发至近干，加入2mL二氯甲烷经0.22μm 滤膜过滤后进行GC-MS分析。

使用GC-MS测定三唑酮含量。Trace-1300气相色谱仪与Trace-ISQ四重质谱仪(ThemoFisher Scientific)联用，使用DA-FFAP毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm， AgelaTechnologies)。电喷雾离子源，全扫描模式(m/z 25-450)，以高纯度氦气(99.999％)作为载气，进样量1μL。GC柱升温程序：初始温度40℃保持1min，以30℃/min升至130℃，然后以10℃/min达到230℃并保持26min。传输线和离子源的温度均设置为250℃。

通过紫外可见分光光度计测定降解菌株的生长量(OD₆₀₀)。

霍氏肠杆菌菌株TY18对三唑酮的降解特性研究结果表明：接种菌株TY18 后，三唑酮含量量逐渐减少。并且，随着三唑酮浓度逐渐下降，菌株TY18的生长量(OD₆₀₀)从最初的OD₆₀₀0.053逐渐增加到2.215，表明菌株TY18能够以三唑酮为唯一氮源，在CSM固体培养基中生长(图4)。

实施例7

霍氏肠杆菌菌株TY18对其他三唑类农药的降解效果测定。

采用GC-MS方法测定霍氏肠杆菌菌株TY18对其他三唑类农药的降解效果。农药的提取方法和GC-MS检测方法同实施例6。结果见表2。

表2菌株TY18对三唑类农药的降解率

结果表明：菌株TY18对三唑醇、丙环唑、己唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑、烯唑醇、氟硅唑8种农药均有一定降解效果，降解率在26.63～43.93％之间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)，其特征在于，其为霍氏肠杆菌TY18，保藏编号为CCTCC NO:M 2022258，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述霍氏肠杆菌在降解三唑类农药中的用途。

3.一种权利要求1所述霍氏肠杆菌的发酵方法，其特征在于，是将所述霍氏肠杆菌TY18接种于LB液体培养基中，28～32℃、pH 7.0～8.0下振荡培养14～18h。

4.根据权利要求3所述的发酵方法得到的发酵液。

5.权利要求4所述的发酵液在降解三唑类农药中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述三唑类农药为三唑酮、三唑醇、丙环唑、己唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑、烯唑醇、氟硅唑中的一种或几种。

7.一种用于降解三唑类农药的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1中所述霍氏肠杆菌株TY18和/或权利要求4所述的发酵液，以及可接受的辅料或载体。