CN105483036B - 一种粘质沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌及其应用，属于微生物领域。该粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQ IN NO:1所示。该制备方法包括：在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品，加入无菌水中并充分振荡，静置后得到上清液，将上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上，在培养基上加入重金属离子培养，从培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上，得到原始菌株；在液体培养基上接种原始菌株，恒温振荡培养过夜，得到菌液，取菌液稀释后分别放置于灭菌平皿中，进行紫外线照射后涂布于固体培养基上，恒温静置培养后进行富集重金属分析并得到所述粘质沙雷氏菌。所述粘质沙雷氏菌对Cr²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺具有良好的吸附性能，是良好的生物吸附材料。

Description

一种粘质沙雷氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种粘质沙雷氏菌及其应用。

背景技术

随着我国工业的快速发展，重金属污染也越来越严重，重金属污染会导致土壤微生物活性降低，使土壤肥力和质量严重下降，重金属还会通过食物链在人体内富集，危害人体健康。因此，重金属污染的治理迫在眉睫。

重金属污染的传统处理方法包括：化学沉淀法、离子交换法、活性炭及硅胶吸附法、电化学法及膜分离法等，但是采用传统方法处理重金属离子的成本较高。近年来，生物修复技术因成本低廉而得到了广泛的应用，取得了较理想的结果。然而，国内外关于生物修复重金属污染的研究较少，使得现有已开发的微生物吸附材料的种类少，而且现有的微生物吸附材料的吸附能力差。

发明内容

为了解决现有技术中微生物吸附材料吸附能力差的问题，本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌，所述粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQ IN NO:1所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种制备上述的粘质沙雷氏菌的方法，所述方法包括：

在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品，将所述土壤样品加入无菌水中并充分振荡，静置后得到上清液，将所述上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上，在所述培养基上加入重金属离子，将所述培养基倒置并于28℃培养7d，从所述培养基上挑取表面光滑的圆形单菌落接种到斜面培养基上，在所述斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株；

在液体培养基上接种所述原始菌株，于37℃恒温振荡培养过夜，得到菌液，取1mL所述菌液稀释至10^-5倍，分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液，进行紫外线照射后分别吸取200μL所述稀释菌液涂布于含有6.0mg/L 3-氨基-9-乙基咔唑的基本固体培养基上，于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析得到所述粘质沙雷氏菌。

具体地，采用紫外线灯进行所述紫外线照射，所述紫外线灯的参数为：功率25W，紫外线波长253nm。

具体地，在进行紫外线照射时，6个铺有10mL稀释菌液的所述灭菌平皿的照射时间分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。

具体地，将所述上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释，得到浓度为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的菌液分别涂布到所述培养基上。

具体地，所述培养基为含有Cr²⁺的肉汤培养基。

具体地，所述方法还包括：将所述粘质沙雷氏菌进行摇瓶发酵培养，所述摇瓶发酵培养的条件为：发酵温度35-37℃，发酵时间30-36h，转速200-225r/min。

具体地，所述方法还包括：将所述粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中进行试发酵，所述试发酵的条件为：装入4-7L发酵培养基，接种量3-5％，接种菌液浓度为2×10⁸CFU/mL，发酵温度35-37℃，pH 6.5-7.5，发酵时间30-36h，转速300-400r/min，通气量1：1。

具体地，在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括：Cd²⁺、Pb²⁺和Cr²⁺。

又一方面，本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌的应用，所述粘质沙雷氏菌用于修复重金属污染。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌对Cr²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺具有良好的吸附性能，是良好的生物吸附材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将结合附图对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的系统发育树图。

该细菌已于2015年7月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)XA07；保藏编号：CCTCCM 2015476；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

本发明实施例提供一种制备上述粘质沙雷氏菌的方法，该方法包括：

筛选：在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取深度为15-20cm的土壤样品，将1g土壤样品加入9ml无菌水中并充分振荡，静置5min后得到上清液，将上清液稀释后分别涂布到培养基上，在培养基上加入重金属离子，将培养基倒置并于28℃培养箱中培养7d，从培养基上挑取表面光滑圆形单菌落接种到斜面培养基上，在斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株。如果发现有非纯培养的菌株，再用接种环挑取少许菌苔在平板上划线分离，直至分离得到纯培养的原始菌株。

诱变和富集驯化：在液体培养基上接种原始菌株，于37℃恒温振荡培养过夜，得到菌液，取1mL菌液稀释10^-5倍，分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液，进行紫外线照射后分别吸取200μL稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)的基本固体培养基上，于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析并得到粘质沙雷氏菌，该粘质沙雷氏菌的分类命名：沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)XA07；保藏日期：2015年7月29日；保藏编号：CCTCC M 2015476；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。

具体地，采用紫外线灯进行紫外线照射，紫外线灯的参数为：功率25W，紫外线波长253nm，阴极离光源距离40cm。

具体地，在进行紫外线照射时，6个铺有10mL稀释菌液的灭菌平皿的照射时间可以分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。

具体地，当土壤样品加入无菌水振荡时，可以采用涡旋器振荡10min使土壤样品和无菌水振荡充分。

具体地，将上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释，分别得到浓度为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的菌液分别涂布到培养基上。

具体地，培养基为含有Cr²⁺的肉汤培养基(LB平板培养基)。LB(Luria-Bertani)平板培养基的成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g和去离子水1000mL，pH 6.8-7.2。

具体地，液体培养基为LB液体培养基，LB液体培养基的成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g和去离子水1000mL，pH 6.8-7.2。

具体地，在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括：Cd²⁺、Pb²⁺和Cr²⁺。

具体地，将所获得的粘质沙雷氏菌的摇瓶发酵培养条件为：发酵温度35-37℃，发酵时间30-36h，转速200-225r/min。

具体地，所获得的粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中试发酵条件为：装入4-7L发酵培养基，接种量3-5％，接种菌液浓度为2×10⁸CFU/mL，发酵温度35-37℃，pH 6.5-7.5，发酵时间30-36h，转速300-400r/min，通气量1：1。

进一步地，摇瓶发酵培养基和发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基。LB培养基成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、去离子水1000mL，pH 6.8-7.2。

其中，所获得的粘质沙雷氏菌可以在pH 4-10、以及盐浓度10％以下环境中生长；在18℃-36℃条件下，粘质沙雷氏菌能够在平板培养基中生长良好，而在4℃和42℃的极端环境下，粘质沙雷氏菌也能够在平板培养基中生长。

将粘质沙雷氏菌XA07进行Biolog(GN2/GP2)自动鉴定分析(GP板透光率：28％±3％，GN板透光率：52％±3％)，具体步骤包括：

挑取待测的粘质沙雷氏菌XA07的菌苔接种于Biolog平板上，在28℃下培养至对数生长期。用灭菌棉签蘸取Biolog IF液体后将平板上的菌苔刮下，再溶入Biolog IF液体中，振荡混匀得到菌悬液；使用Biolog浊度仪调浊度至指定范围(GP板透光率：28％±3％，GN板透光率：52％±3％)；再用移液枪将菌悬液加入Biolog鉴定板中，每孔150μL；然后在28℃培养16-24h取出Biolog鉴定板，用BiologMicroStation分析仪对Biolog鉴定板进行数据读取和分析，具体结果见表1。

表1：自动鉴定结果

将得到的粘质沙雷氏菌XA07进行16S rRNA基因序列分析，并得出其16S rRNA的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出该菌种属于沙雷氏菌属，发明人将其命名为XA07。

具体地，将粘质沙雷氏菌XA07的16S rRNA基因序列分析，具体方法包括：

(1)染色体DNA(小量)的提取

1.取1.5mL粘质沙雷氏菌XA07菌液加入1.5mL Eppendorf(EP)管(微量离心管)中，12000r/min离心5min。

2.静置弃上清，得到沉淀，向该沉淀中加入900μL磷酸缓冲液(PBS)重悬沉淀，于4℃12 000r/min离心5min。

3.再静置弃上清，得到沉淀，向该沉淀中加入300TE(Tris-EDTA缓冲液)和200μL10mg/mL溶菌酶，通过吹吸混匀，于37℃温育1h，在温育期间每隔15min颠倒混匀一次。

4.向EP管中加入600TENS裂解液(200mmol/LNaCl，100mmol/L Tril-HCl pH8.0，2.0％SDS，50mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100)和20mg/mL蛋白酶K 10μL，颠倒混匀，于55℃温育1h，在温育期间每隔15min颠倒混匀一次。

5.将EP管于4℃12000r/min离心5min，取上清液。

6.向上清液中加入体积比为25︰24︰1的苯酚︰氯仿︰异丙醇并充分混匀，于4℃12000r/min离心10min。

7.重复步骤6。

8.将上清液转入新的EP管中，向新的EP管中加入1/10上清液体积的3mol/L醋酸钠，2倍上清液体积的无水乙醇，混匀，于-20℃下放置60min后，于4℃12000r/min离心10min。

9.弃上清，得到沉淀，将装有沉淀的EP管倒扣在吸水纸上，吸水纸吸干液体后将EP管中的沉淀风干，风干后得到粘质沙雷氏菌XA07的染色体DNA，向染色体DNA中加入30μL无菌水和10mg/mL RNase A 0.5μL，于-20℃保存。

(2)PCR扩增

以刚提取的染色体DNA为模板，利用由上海英骏生物技术有限公司合成的引物(上游引物27F，5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’，下游引物1527R，5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)进行16S rRNA基因序列的PCR扩增，具体PCR扩增体系见表2。

表2：PCR扩增体系

PCR扩增条件：

Step1，预变性94℃10min；

Step2，变性95℃30s，

复性 60℃1min，

延伸 72℃1min；共30个循环。

Step3延伸 72℃10min。得到粘质沙雷氏菌XA07的16S rRNA基因的PCR产物。

(3)16S rRNA基因PCR产物的纯化

(参照Omega Bio-tek公司PCR产物纯化试剂盒说明书)

1.将上述PCR产物从琼脂糖胶上相应的位置切下回收至EP管中，向EP管中加人Binding buffer(1g/mL)，在65℃水浴7min直到琼脂糖胶完全溶解。

2.将溶液转移至吸附柱中，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。

3.向吸附柱中加入300μL的Binding buffer，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。

4.向吸附柱中加入700μL的SPW buffer，室温下放置2-3min，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。重复一次。

5.于10000r/min空柱离心2min，弃收集管中废液。

6.将吸附柱放入一个干净的EP管中，加入30-50μL的Elution buffer，12000r/min离心2min收集产物，该产物用于基因序列。

(4)16S rRNA基因的测序

16S rRNA基因序列测定由上海英骏公司完成，测序结果见序列表中的序列1。

(5)16S rRNA基因序列相似度分析

将测序后的16S rRNA基因序列通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/和http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/网页中的比对程序进行同源性分析。

(6)基于16S rRNA基因序列的系统发育分析

利用Clustalx1.8，MEGA 5.0软件，根据16S rRNA基因序列相似度分析的结果，选取相关模式菌株的16S rRNA基因序列，分别采用neigbor-joining(NJ，邻位相接法)算法得到相应的系统发育树，见图1。

通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出同源性排名前十的菌种如下表3。

表3同源性比对分析

由表3可知，本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌属于沙雷氏菌属粘质沙雷菌，将其命名为XA07。

将粘质沙雷氏菌XA07进行脂肪酸自动鉴定分析，具体方法包括：

1.获取菌体

采用4区划线将粘质沙雷氏菌XA07的菌株接种在TSB(胰酪胨大豆肉汤培养基)平板上。刮取第3区约40mg的菌量，涂抹在带有特氟龙螺旋盖的试管底部，同时做好标记。

2.皂化

(1)吸取1.0(±0.1)mL的皂化试剂，注入试管内，将含内垫的螺旋盖旋紧，Vortex振荡5～10s；

(2)将试管浸入95～100℃的水浴锅中5min；

(3)取出试管，不要拧开螺旋盖，用Vortex振荡5～10s；

(4)放回95～100℃的水浴锅中反应25min，注意螺旋盖是否旋紧；

(5)取出试管，放入冷水中冷却。

3.甲基化

(1)拧开螺旋盖，加入2.0(±0.1)mL的甲基化试剂；

(2)拧紧螺旋盖，用Vortex振荡5～10s；

(3)放入80±1℃的水浴锅中反应10(±1)min；

(4)取出试管，放入冷水中冷却。

4.萃取

(1)拧开螺旋盖，加入1.25(±0.1)mL的萃取试剂；

(2)拧紧螺旋盖，将试管轻柔颠倒混合10min；

(3)拧开螺旋盖，用玻璃吸管取出下层液体，弃去，保留上层液体。

5.洗涤

(1)加入3.0(±0.1)mL的洗涤试剂；

(2)拧紧螺旋盖，将试管轻柔颠倒混合5min；

(3)静置等待分层，若分层不够清晰，加入4～5滴的饱和NaCl溶液；

(4)用干净玻璃吸管取出约200μL的上层液体，即提取的样品，移到GC(GasChromatography)小管中，准备气相色谱分析。

6.脂肪酸气相分析

利用Agilent气相色谱仪和MIDI Sherlock程序对提取的样品进行脂肪酸组分和系统分析。色谱条件：氢离子火焰检测器(FID)，检测器温度为300℃；色谱柱为HP-ULTRA 2型毛细柱；汽化室温度为250℃；载气为H₂，30mL/min；进样量为0.2μL；炉温由170℃保持5℃/min上升到260℃。脂肪酸气相分析结果见表4。

表4：脂肪酸组分百分比含量

其中，Summed Feature为此脂肪酸组分中难区分的脂肪酸成分。Summed Feature2为C_{12:0(aldehyde)}、C_{16:1iso I}或C_{14:0 3OH}；Summed Feature 3为C_16:1w7c或C_16:1w6c；Summed Feature8为C_18:1w7c或C_18:1w6c。

对粘质沙雷氏菌XA07的耐盐、耐pH及温度实验

1)用LB培养基活化粘质沙雷氏菌XA07菌株；

2)将LB固体培养基800mL，分装于16个三角瓶中，将其中9瓶三角瓶的pH值分别调为3、4、5、6、7、8、9、10、11，再将剩余的7瓶三角瓶中的NaCl含量调为2％、4％、6％、8％、10％、11％、12％并用高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min，将上述16个三角瓶内的部分液体倒入平板内；

3)向上述16个三角瓶内各接种总体积的1％的活化的粘质沙雷氏菌XA07菌株，同时，在平板上用推棒涂布粘质沙雷氏菌XA07菌株。

4)将接种好的三角瓶放入30℃的恒温摇床内，180r培养24h。将平板分别放入4℃、15℃、28℃、36℃、42℃下静置培养；

5)培养24h后，用分光光度计测量液体培养基的OD600数值，并检查平板中涂布的菌是否生长。

实验结果表明，在pH 4-10之间粘质沙雷氏菌XA07均能生长；盐浓度10％以下粘质沙雷氏菌XA07均能生长；在15℃-36℃下粘质沙雷氏菌XA07能够在平板中生长良好，而在4℃和42℃的环境下，粘质沙雷氏菌XA07也能够在平板中生长。

对粘质沙雷氏菌XA07进行耐受重金属实验

1)用LB培养基活化粘质沙雷氏菌XA07菌株，并分别配制好100mL 100mmol/L Cr²⁺；100mL 100mmol/L Pb²⁺；100mL 100mmol/L Cd²⁺的重金属离子溶液；

2)配制LB培养基500mL，分装于48支试管中，并用高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min；

3)将先配好并灭菌的Cr²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺重金属离子溶液分别加入到LB培养基中，使各试管中的金属离子终浓度按表5所示分别加入两支试管中；

表5：粘质沙雷氏菌XA07耐受重金属试验结果

处理组	1	2	3	4	5	6	7	8
									Cr2+mmol/L	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0	12.0	14.0	16.0
Cd2+mmol/L	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0	12.0	14.0	16.0
									Pb2+mmol/L	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0	12.0	14.0	16.0

4)向每支试管内接种1％的活化的粘质沙雷氏菌XA07菌株，同一浓度的金属离子的试管只接种一支，另外一支作为空白对照；

5)将接种好的试管放入30℃的恒温摇床内，于200r/min下培养24h；

6)将培养好的菌液用分光光度计在OD600下测其吸光值，每一支都用其空白对照进行调零。

试验结果表明，粘质沙雷氏菌XA07对Cr²⁺的最大耐受能力为14mmol/L，对Cd²⁺的最大耐受能力为10mmol/L，对Pb²⁺的最大耐受能力为6mmol/L。

具体地，本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌XA07可用于修复重金属污染。

对粘质沙雷氏菌XA07进行吸附重金属实验

1)在分别为4mmol/L的Cr²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺重金属离子浓度下培养几批菌体，培养时间分别为12h、24h、36h；

2)将培养好的菌体离心、清洗、烘干后准确称取干菌体的重量；

3)用原子吸收光谱仪检测样干菌体，粘质沙雷氏菌XA07的干菌体所能吸附Cr²⁺金属离子的量可达14.5μg/g，Cd²⁺金属离子的量可达10.8μg/g，Pb²⁺金属离子的量可达5.5μg/g。

由此可见，本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌对Cr²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺具有良好的吸附性能，是良好的生物吸附材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌的16S rRNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述粘质沙雷氏菌于2015年7月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名为沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)XA07；保藏编号为CCTCC M 2015476；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。

2.一种如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的应用，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌用于修复Cd²⁺、Pb²⁺和Cr²⁺重金属污染。