CN113832081B - 一株具有六价铬还原能力的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有六价铬还原能力的菌株及其应用。该菌株为WH1，分类命名为粘质沙雷氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.M 20211077，其16S rDNA核苷酸序列已经公布于Genbank数据库中，登录号为OK147741，本发明提供的菌株WH1能有效将六价铬还原为三价铬，该菌可应用于六价铬污染土壤的生物修复工程中，菌株本身和由其制备得到的微生物制剂都可用于土壤修复。

Description

一株具有六价铬还原能力的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有六价铬还原能力的菌株及其应用。
背景技术
铬(Chromium，Cr)是一种天然存在的地球化学元素，自然环境中铬通常以Cr(III)和Cr(VI)两种稳定价态存在，由于Cr(VI)的溶解性和迁移性更高，并且氧化性和生物利用度更强，相较于Cr(III)，Cr(VI)具有更高的毒性。Cr(VI)通过口腔进入人体后，可以引起一系列的病变，如贫血、心肌病变、肝肾病变、循环衰竭，甚至死亡，给对生态环境和人体健康构成重大威胁，实现高毒性Cr(VI)到低毒性Cr(III)的转化对环境铬污染治理和人类健康具有重要意义。
铬污染治理方法包括物理法，化学法和生物法三大类。常用于环境铬污染治理的物理化学方法如物理吸附法，土壤置换法，固定稳定化技术和电动修复法，光催化法等。其中物理化学法的利用由于有一定的缺点，如产生二次污染，未能成为较为理想的土壤铬污染治理措施。微生物修复是通过微生物对铬的吸附，积累和生物固定而减少土壤和水环境中的铬，或是通过将Cr(VI)转化为Cr(III)，从而降低Cr(VI)的毒性和生物利用度。微生物治理法来修复铬污染土壤因具有安全、费用低廉等优点成为原位治理铬污染的新途径，而从环境中获得优良的六价铬还原菌则是开发这一技术的关键。
目前研究工作者已经从环境中分离出了一些六价铬还原微生物，主要分布在Pseudomonas、Bacillus sp及Acinetobacter sp等属。但是，迄今为止应用此类微生物修复六价铬污染场地的工程案例仍然较少，其根本原因是六价铬还原菌资源不够丰富，从受污染环境中分离六价铬还原菌仍是获得优势菌种资源的手段。由于六价铬对微生物有毒害作用，故开发一种简单、可靠的方法从六价铬污染源分离六价铬还原菌意义重大。
发明内容
为了弥补现有微生物资源的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一株具有六价铬还原能力的菌株及其应用。
本发明的一株具有六价铬还原能力的菌株，所述菌株为WH1，分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，已于2021年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉武汉大学保藏中心，邮政编码：430072，保藏编号CCTCC NO：M 20211077，其16S rDNA核苷酸序列已经公布于Genbank数据库中，登录号为OK147741。所述菌株分离于贵州省遵义市某铬盐化工厂污染土壤；菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，在LB平板上其菌落为红色、表面湿润。
本发明还提供了所述菌株在制备六价铬还原生物制剂中的应用。
本发明还提供了在制备土壤原位修复剂中的应用。
本发明还提供了一种用于土壤修复的微生物制剂，该微生物制剂有效成分为所述的菌株。
本发明还提供了一种污染土壤修复的方法，包括将所述菌株接种到六价铬污染土壤中，对土壤进行修复。
进一步的，接种量为0.8×108-1.2×108cfu/g。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中所提供的六价铬还原菌WH1鉴定为Serratia marcescens。该菌在好氧条件下能有效还原六价铬。该菌株作用于六价铬污染污染土壤后，能明显促进土壤中六价铬的还原，土壤六价铬浓度为45.6mg/kg时，24h内六价铬还原率达70％。该菌株在处理Cr(VI)污染土壤和水体中具有极大的应用潜力，可被应用于六价铬污染土壤的生物修复工程中，以促进六价铬的还原、提高修复效率。
附图说明
图1为本发明的菌株WH1的菌体形态。
图2为本发明的菌株WH1在LB板上的菌落形态图。
图3为本发明的菌株WH1的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：本发明菌株的分离与鉴定
(1)富集与驯化。用于分离微生物的土样取自贵州省遵义市某铬盐化工厂污染土壤。LB培养基包括胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH:7.0。在容积为250ml的三角瓶中装入100ml LB培养基，121℃灭菌20min后备用。取土壤样品10g接种至装有100mL已灭菌的含六价铬500mg/L的LB培养基中，于30℃,150r/min条件下振荡培养24h，取该培养基10mL添加到90mL新鲜的富集培养基中(含六价铬500mg/L)，在相同条件下培养，并连续传代数次。转接数代后，将培养液过滤，取1.0mL过滤得到的菌株加至装灭菌的六价铬溶液的小试管中，若溶液颜色由橙红色变为绿色或颜色变浅，则说明六价铬被还原，培养基中的六价铬还原菌丰度较高，可选择此培养基进行菌株分离。
(2)分离与纯化。用无菌生理盐水(0.9％)将含六价铬还原菌丰度较高的培养基进行梯度稀释，将稀释液涂布于LB琼脂平板，在平板表面喷洒浓度为1g/L的六价铬溶液。将平板倒置于30℃恒温培养箱培养，观察菌落生长情况，如菌落周围的橙红色变为绿色或颜色变浅，则挑选该菌落划线于含六价铬的LB琼脂平板。连续纯化多次，观察菌落形态并镜检，直至得到纯种。
(3)复筛。将纯化的菌株接种到50mL的LB培养基中培养，于30℃、150r/min摇床培养24h，转接一次，再培养24h作为种子液，备用。配制六价铬浓度分别为20mg/L、50mg/L、70mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L的LB培养基20ml，分别加入0.5ml种子液，150r/min、30℃恒温培养24h后测上清液六价铬含量。溶液中Cr(VI)的浓度采用二苯碳酰二肼分光光度法测定，取适量加有Cr(VI)的菌液以8000r/min离心5min，以上清液进行测定实验。取0.125mL上清液，置于25mL比色管中，用水稀释至标线，加入(1+1)硫酸溶液0.5mL和(1+1)磷酸溶液0.5mL，摇匀后加入1mL显色剂，静置8min后，移入1cm比色皿于540nm波长测定吸光度并作空白校正，以试剂空白作参比。另以相同操作，摇匀后加1mL丙酮，做颜色校正。计算时扣除丙酮校正的吸光度。
复筛菌株中，WH1的六价铬还原效果较好(表1)。菌株WH1在好氧条件下能耐受500mg/L的六价铬浓度，表明菌株WH1是一株较好的六价铬还原菌。
表1菌株WH1对不同浓度六价铬还原效果
Figure BDA0003348598200000051
(4)鉴定。根据16S rDNA序列(已经公布于Genbank数据库中，登录号为OK147741)结果将菌株WH1鉴定为Serratia marcescens，中文名称为粘质沙雷氏菌。16S rDNA采用细菌通用引物27f(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，如SEQ ID NO.1所示)和1492r(5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′，如SEQ ID NO.2所示)扩增，序列长度为1424bp。菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状(见图1)，在LB板上其菌落为红色、表面湿润(见图2)，菌株WH1的系统发育树见图3。
实施例2：菌株WH1对土壤中六价铬的还原
将取自贵州省遵义市某铬盐化工厂污染土壤(六价铬含量为45.6mg/kg)自然风干，研磨细碎后过20目筛，混合均匀，测试其中六价铬含量，称取2g污染土壤至20ml离心管中，然后接种菌株WH1(菌液制备方法与实施例1中描述的方法相同)使土壤中菌浓度达1.0×108cfu/g，补充适量水分使土壤含水率达40％。置于30℃培养箱培养。于试验的第12h和24h取样测试六价铬浓度，以未接种的去离子水和污染土壤为对照。土壤中六价铬的测定方法见廉晶晶(2013)[廉晶晶，Lysinibacillus sp.Cr-6还原六价络特性及其在电镀铬污染土壤修复中的应用,2013]。六价铬的还原效果见表2。当土壤中添加菌株WH1后，12h六价铬的总还原率为46％，24h还原率为70％，表明菌株WH1是一株能在六价铬污染土壤上有效发挥还原作用的菌株。
表2菌株WH1对污染土壤六价铬还原率(单位:％)
Figure BDA0003348598200000061
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
                         序列表
<110>  贵州民族大学
<120>  一株具有六价铬还原能力的菌株及其应用
<160>  2
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
agagtttgat cctggctcag                                              20
<210>  2
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
taccttgtta cgactt                                                  16

Claims (6)

1.一株具有六价铬还原能力的菌株，其特征在于，所述菌株为WH1，分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，已于2021年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20211077。
2.权利要求1所述菌株在制备六价铬还原生物制剂中的应用。
3.权利要求1所述菌株在制备土壤原位修复剂中的应用。
4.一种用于土壤修复的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂有效成分为权利要求1所述的菌株。
5.一种污染土壤修复的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述菌株接种到六价铬污染土壤中，对土壤进行修复。
6.根据权利要求5所述的一种污染土壤修复的方法，其特征在于，接种量为0.8×108-1.2×108cfu/g。
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