CN113025524B - 原油降解菌ss-21nj及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了原油降解菌SS‑21NJ及其应用，该菌株属于Tsuneonella.sp.，分类命名Tsuneonella flava SS‑21NJ，保藏编号为CGMCC：21760，于2021年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还提供了一种鉴定原油降解菌SS‑21NJ的方法，利用前引物27F和后引物1492R对细菌基因组进行PCR扩增，得到扩增产物可说明该检测细菌为原油降解菌SS‑21NJ。本发明提供的原油降解菌SS‑21NJ在高盐条件下仍能具有高效的降解效率，能够解决盐碱地石油污染的实际问题。
Description
技术领域
本发明属于生物降解处理领域，涉及一株油泥降解菌及其分离鉴定，以及该降解菌在原油上的降解应用。
背景技术
随着我国石油工业的迅速发展，2018年中国油气产量已经达到了1.89亿吨，石油加工量高达6.04亿吨原油。石油及其附加产物在人类生产生活活动中充当了重要的角色，石油也因此作为维持人类生产生活中不可或缺的资源之一。但是原油在开采、集运、炼制、储存和使用的过程中，常存在因设备老化或者处理技术不成熟等问题导致管线穿孔、井喷、原油泄漏等事故，因而产生大量的落地油，进而造成大规模的石油污染。大量研究发现，目前拥有多种技术方法可以处理原油污染土壤，其中主要包括物理化学修复方法、植物修复方法以及微生物修复方法。近些年，越来越多的研究指向微生物修复油泥，因为其相较传统修复方法，克服了修复技术复杂，能耗消耗过大，成本较高及易产生二次污染的缺点。
微生物修复油泥主要是指通过微生物在污染物环境中，通过一定的生理生化反应，以及借助代谢产物的分泌从而达到对污染物进行吸收、转化、降解清除的目的。石油降解菌的筛选、分离是生物处理石油污染的关键。迄今为止，国内外一些学者已筛选多株原油降解菌，但多为常见的芽孢杆菌属，盐单胞杆菌属(Halomonas)等。赵百锁等(赵百锁,王慧,毛心慰.嗜盐微生物在环境修复中的研究进展[J].微生物学通报,2007(06):1209-1212)曾报道，当盐度为0.5％～2％时，会严重扰乱非嗜盐微生物的正常代谢活动，当盐度大于3％时，非嗜盐微生物的代谢会受到抑制，并导致降低甚至丧失修复能力，因此非嗜盐菌在修复盐碱地石油污染土壤时有一定局限性。
基于现有技术的缺陷，耐盐石油降解菌的筛选、分离是生物处理高盐石油污染土壤的关键。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对我国沿海滩涂油田污染中，油泥体量大、难降解等实际问题，本发明提供一株能高效降解原油的降解菌，能够解决油田污染的实际问题。
此外，针对非嗜盐微生物的代谢会受到高盐的抑制，并导致降低甚至丧失修复能力，因此针对盐碱地石油污染的原油难以达到高效的降解效率，本发明提供的原油降解菌SS-21NJ在高盐条件下仍能具有高效的降解效率，能够进一步解决盐碱地石油污染的实际问题。
2.技术方案
本发明提供一株原油降解菌SS-21NJ，该油泥降解菌属于Tsuneonella.sp.，命名为Tsuneonella flava SS-21NJ，保藏编号为CGMCC：21760，于2021年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位的地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的所述原油降解菌SS-21NJ生物学特征如下：在LB固体培养基中，SS-21NJ呈圆形，中间微凸起，深黄色，表面光滑，不透明，菌落直径2～3mm。在显微镜下观察，SS-21NJ呈杆状。
本发明还提供鉴定原油降解菌SS-21NJ的方法，该方法是利用前引物27F和后引物1492R对细菌基因组进行PCR扩增，得到扩增产物说明该检测细菌为原油降解菌SS-21NJ。
其中，前引物27F的序列为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；后引物1492F的序列为：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。
1304bp的扩增产物为16S rRNA序列PCR分析结果，具体如表1所示。
进一步的，本发明还提供了一种分离所述的原油降解菌SS-21NJ的方法，包括以下步骤：
(1)取采自胜利油田盐渍地石油污染土壤样品，称量部分加入含无机盐培养基三角瓶中，30-35℃，120-150rpm在摇床上充分培养。其中土壤样品与无机盐培养基的比例为1：(15～25)g/ml.
(2)采用稀释涂布平板法将培养后的驯化液稀释至0.01～0.1ppm，用移液枪吸取稀释后的100μL驯化液均匀平铺至LB固体培养基中，在培养箱中，35℃条件下培养2～3d，待培养基中有单菌落生成，采用平板划线法分离纯化培养后得到可降解原油的菌株SS-21NJ。
进一步的，本发明还提供了所述的原油降解菌SS-21NJ在降解原油中的应用。
进一步的，所述原油降解菌SS-21NJ用于降解原油中总石油烃、直链烷烃及多环芳烃。
进一步的，在原油降解菌SS-21NJ降解原油中的应用过程中，具体的，在100ml的无机盐培养基中以m/v为(1％～3％)：1的接种量首先接种原油，m代表石油污泥的质量，v代表无机盐培养基体积；
再接种原油降解菌SS-21NJ，所述原油降解菌SS-21NJ接种体积占无机盐培养基体积的1％～2％。
进一步的，原油初始总石油烃浓度为3.0*104～4*104ppm，无机盐培养基pH为5.0～9.0，培养温度为25～40℃，NaCl的质量浓度占无机盐培养基的1％～3％。
进一步的，将原油降解菌SS-21NJ菌培养至对数生长期后再接入灭菌后的无机盐培养基。
进一步的，所述原油所述接种量为1％(v/v)，原油初始浓度为3.0*104ppm，和/或无机盐培养基pH为6.0～7.0，培养温度35℃，NaCl质量浓度占无机盐培养基的3％。
进一步的，本发明提供了一种原油降解剂，该降解剂含有所述的原油降解菌SS-21NJ。
进一步的，所述无机盐培养基pH为7.0，培养温度33℃，NaCl质量浓度占无机盐培养基的3％。
3.有益效果：
(1)本发明的原油降解菌是Tsuneonella flava SS-21NJ，是首次对该菌属的降解特性深入研究，填补了目前Tsuneonella.sp降解原油研究的空白。当盐浓度较高时，原油降解菌SS-21NJ可高效降解高浓度原油中的长链烷烃与芳香烃，相较于传统微生物降解高浓度原油有了明显进步，说明本发明提供的原油降解菌SS-21NJ是一种高效耐盐降解菌，可有效降低环境污染的风险，并为今后在石油污染场地与海洋石油污染修复工程中提供了理论依据。
(2)本发明的原油降解菌，在探究直链烷烃各组分降解实验中，结果表明菌SS-21NJ降解烷烃各组分的能力均较强，对低碳数(C10-C16)的正构烷烃可以做到几乎完全降解，对高碳数的正构烷烃也有较好的降解能力，具有较广泛的降解范围。
附图说明
图1为SS-21NJ在LB平板中的菌落形态；
图2为SS-21NJ系统发育树图片；
图3为SS-21NJ生长曲线图片；
图4为不同石油降解菌对油泥中总石油烃降解效率的影响；
图5为温度因素对SS-21NJ降解效率的影响；
图6为pH值因素对SS-21NJ降解效率的影响；
图7为盐浓度因素对SS-21NJ降解效率的影响；
图8为油泥中多环芳烃各组分降解效果；
图9为降解前油泥中直链烷烃各组分含量；
图10为降解后油泥中直链烷烃各组分含量；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照本领域的公知手段。
需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。
实验中所使用的试剂如下：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，超纯水1000ml，高温高压灭菌121摄氏度20min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，15g琼脂粉，超纯水1000ml，高温高压灭菌121摄氏度20min。
无机盐培养基：1g/L KH2PO4，10g/L NaCl，1g/LK2HPO4，0.02g/LCaCl2，1g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4，1ml/L微量元素溶液。
微量元素溶液：1.0g ZnS04·7H2O，2.5g FeS04·7H2O，0.3g MnS04·H2O，0.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O蒸馏水1000mL。
主要试验仪器及试剂：生物培养箱(Thermo)；恒温摇床(Thermo)；气相色谱仪(Thermo)；气相色谱质谱仪(Thermo)。
正己烷(色谱纯，阿拉丁)、无水硫酸钠、超纯水为Milli Q水(电导率18.22MΩ·cm)
实施例1
原油降解菌SS-21NJ的筛选与鉴定
一)原油降解菌SS-21NJ的分离筛选
取采自胜利油田(山东东营)滩涂处石油污染土壤作为土壤样品，添加到含无机盐培养基的三角瓶中，其中土壤样品与无机盐培养基的比例为1：(15～25)g/ml；30-35℃，120～150rpm在摇床上震荡，使样品充分混匀；培养一周之后，按照1％的接种量，从驯化液中吸取1ml，加入至含油泥的100ml无机盐培养基中，充分震荡，重复两次。
采用稀释涂布平板法将驯化液稀释至0.01～0.1ppm。用移液枪吸取100μL的样品涂布到LB固体培养基中，于35℃恒温培养2～3d，待培养基长出明显成熟单菌落后，挑取单菌落，依照平板划线法分离细菌。图1为SS-21NJ在LB平板中的菌落形态；将得到的纯种按照甘油保存法保存，放入-80℃冰箱内保存。
二)原油降解菌SS-21NJ的形态学和分子学鉴定
菌株SS-21NJ在LB固体培养基上呈圆形，中间微凸起，深黄色，表面光滑，不透明，菌落直径2～3mm(图1)。在显微镜下观察，SS-21NJ呈短杆状。
16S rRNA扩增的引物为27F(前引物)，序列为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492F(后引物)：序列为：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。扩增产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，利用BLAST程序与NCBI中的已知序列进行比对分析。
1304bp的扩增产物为16S rRNA序列PCR分析结果，具体如表1所示。
表1 SS-21NJ的16s rRNA
图2为SS-21NJ系统发育树图片；根据生物公司提供16S rDNA测序结果，在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/在线查询分析，与GenBank中其他菌株的16S rDNA进行同源性比较，确定菌种所属种属关系。并在http://rdp.cme.msu.edu/上查询相近的模式菌株，下载得到相近的核酸序列后，利用MEGA 5.05软件以邻接法(Neighbour-Joining法)构建不同菌株的16S rDNA系统进化树。结果表明，SS-21NJ与Tsuneonella flava SS-21NJMS1-4T聚集在一个系统发育分支，同源性最高，序列同源性大于99％，根据形态学观察并结合文献报道，初步判断SS-21NJ为Tsuneonella sp.。
实施例2
原油降解菌SS-21NJ降解特性
(1)降解菌生长曲线的测定
种子培养，从一支斜面试管挑取一环到含有100mlLB种子培养液的250ml三角瓶中，33度下130rpm培养18h。
发酵培养，从斜面试管种挑一环至含5ml灭菌后的LB种子培养液试管中，33℃培养18h。按1％的接种量从种子培养液中吸取1ml种子液至锥形瓶中，将稀释后的种子液转移至酶标板后，放入Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，33℃下培养，以20min为梯度，测定其OD600mm下的吸光度。以未接种的培养基为空白对照，以培养时间为横坐标，OD600mm值为纵坐标做出生长曲线，每个样品做8组平行，计算后取平均值。
如图3所示。
从生长曲线(图3)中可以看出，0-16h是生长适应期，16h-36h是对数期，36h后进入稳定期。
(2)总石油烃(TPH)测定
不同石油降解菌对原油中总石油烃降解效率的影响
为探究不同石油降解菌对原油中总石油烃降解效率的影响，选取经驯化分离得到的菌株SS-21NJ、地衣芽孢杆菌(Z-1)与类芽孢杆菌属(MH-21)进行原油降解试验。
原油在100ml无机盐培养基中以1％～3％的比例(m/v)接种原油，m代表石油污泥的质量，v代表无机盐培养基体积；在33℃下，以1％～2％接种量(v/v)将菌液分别接入到原油的无机盐培养基中，原油初始总石油烃浓度为3*104～4*104ppm，pH为7.0，130rpm震荡培养12d，测定总石油烃含量，计算降解率，比较降解效果。试验设置3个重复，结果取平均值。
为了测定菌株SS-21NJ(AT)、Z-1(地衣芽孢杆菌)与MH-21(类芽孢杆菌属)对原油中总石油烃的降解率，在分别利用上述菌株降解12天后，将30ml CCl4加入锥形瓶中，振荡萃取瓶中原油。再将锥形瓶放入超声清洗器中超声处理10min后，倒入分液漏斗，用20ml的CCl4润洗锥形瓶，将润洗后的溶液倒入分液漏斗中，静置2min待其分层后，取下层有机层。用无水NaSO4(马弗炉内400℃烘8h)对分离得到的有机层进行过滤，去除有机层中的水分。用CCl4将萃取液定容至50ml容量瓶刻度线，充分振摇，取5ml溶液定容于50ml容量瓶中，定容至刻度线即为稀释液。用层析柱(装有4g弗罗里硅土和1g无水硫酸钠的20cm层析柱)过滤稀释液，层析出的前5ml弃去，收集剩余层析液，将收集得到的洗脱液用F2000-IIK红外测油仪进行总石油烃的测定。弗洛里硅土使用前需在马弗炉内650℃烘4h。红外测油仪使用前需校准，具体校准方法及分析方法参考HJ 1051-2019(中国标准出版社，2019)。
不同石油降解菌对原油中总石油烃降解效率如图4所示。结果表明，经过12天降解后，菌株SS-21NJ(AT)降解率最高为53.72％，高于地衣芽孢杆菌(45.65％)与类芽孢杆菌属(44.89％)。因此，可以说明菌株SS-21NJ较地衣芽孢杆菌Z-1与类芽孢杆菌属MH-21对原油的降解效果更好。
表2总石油烃降解对比
| 处理组 | AT | Z-1 | MH-21 |
| 降解率 | 0.53721 | 0.45651 | 0.44895 |
| 误差棒 | 0.06503 | 0.1064 | 0.0765 |
实施例3
本实施例为理化因素对原油直链烷烃与芳香烃降解效率的影响，具体为：
(1)温度对降解效率的影响
为探究温度对菌株SS-21NJ降解直链烷烃与芳香烃的影响，在25℃，33℃，40℃下，以1％接种量(v/v)，将原油降解菌SS-21NJ接入原油的无机盐培养基中，所采用的原油的无机盐培养基的制备与实施例2相同。
在130rpm震荡培养9d，测定直链烷烃与芳香烃的含量，计算降解率，确定最佳的温度。试验设置3个重复，结果取平均值。图5为温度因素对SS-21NJ降解效率的影响图。
(2)pH对降解效率的影响
为探究pH值对菌株SS-21NJ降解直链烷烃与芳香烃的影响，用盐酸与NaOH调节优化培养基的pH值为5.0、7.0、9.0，以1％接种量(v/v)，将原油降解菌SS-21NJ接入含原油的无机盐培养基中，所采用的原油的无机盐培养基的制备与实施例2相同。
130rpm震荡培养20d，测定直链烷烃与芳香烃的含量，计算降解率，确定最佳的温度。试验设置3个重复，结果取平均值。图6为pH值因素对SS-21NJ降解效率的影响。
(3)NaCl对降解效率的影响
为探究盐浓度对菌株SS-21NJ降解直链烷烃与芳香烃的影响，将无机盐培养基中NaCl质量浓度分别控制在1％、2％、3％，以1％接种量(v/v)，将原油降解菌SS-21NJ接入含原油的无机盐培养基中，所采用的原油的无机盐培养基的制备与实施例2相同。
130rpm震荡培养20d，测定直链烷烃与芳香烃的含量，计算降解率，确定最佳的温度。试验设置3个重复，结果取平均值。图7为盐浓度因素对SS-21NJ降解效率的影响；
(4)直链烷烃测定：
为了测定菌株SS-21NJ对直链烷烃的降解率，在降解20天后，分别取步骤1、步骤2、步骤3样品，将30ml正己烷加入锥形瓶中，充分震荡萃取瓶中原油，转移至分液漏斗中，再用20ml正己烷洗净锥形瓶中残余油泥，将润洗后的正己烷倒入分液漏斗中，静止2min后待其分层，若分层效果不明显添加适量NaCl。取上层有机层，将适量无水硫酸钠置于定性滤纸中，对分离得到的有机层进行过滤，去除有机层中残余水分。将萃取得到的滤液于旋转蒸发仪中浓缩至1ml，过0.22μm有机滤膜后转进棕色进样品中，进行GC分析。
气相色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5s色谱柱，尺寸为30m x 0.25μm x 0.25μm。柱流量：1.5mL/min。初始温度60℃保持1min，以每分钟15℃升至250℃，以每分钟10度升至300℃保持25min。具体方法参考HJ 1021-2019(中国标准出版社，2019)。
芳香烃测定：
为了测定菌株SS-21NJ对芳香烃的降解率，在降解20天后，分别取步骤1、步骤2、步骤3样品，将30ml正己烷加入锥形瓶中，充分震荡萃取瓶中原油，转移至分液漏斗中、再用20ml正己烷洗涤锥形瓶中残余油泥，将润洗后的正己烷倒入分液漏斗中，静止2min后待其分层，若分层效果不明显添加适量NaCl。取下层有机层，将适量无水硫酸钠置于定性滤纸中，对分离得到的有机层进行过滤，去除有机层中残余水分。SPE小柱经二氯甲烷与正己烷溶液浸润后，加入5ml萃取液，并利用二氯甲烷与正己烷溶液洗脱得到混合溶剂，浓缩，过0.22μm有机滤膜后转移至棕色进样品中，进行GC-MS分析。
气相色谱条件：Agilent DB-5MS UI毛细管柱，30m x 0.25mm x 0.25μm。初始温度：80℃保持2min，以20℃/min升至180℃保持5min，再以10℃/min升至290℃保持7min。进样气为He，柱流量为1.0mL/min。
质谱条件：离子源为电子轰击源，70eV，温度为300摄氏度。溶剂延迟时间3min。检测方式为定量离子扫描模式(SIM)。
温度因素对降解原油中直链烷烃与芳香烃的实验研究表明，菌SS-21NJ对温度有较好的适应范围。当温度为33℃时，菌SS-21NJ对直链烷烃的生物降解率最大为48.72％；当温度为40℃时，菌SS-21NJ对多环芳烃的生物降解率最大为47.89％。
盐浓度对降解原油中直链烷烃与芳香烃实验研究结果表明，菌SS-21NJ对多环芳烃的降解率随盐浓度的升高而增加，当NaCl浓度增加到3％时，SS-21NJ对多环芳烃的降解率达到46.60％；而菌SS-21NJ对直链烷烃的降解率随培养基NaCl含量的增加呈先降低后升高的趋势，当NaCl浓度增加到3％时，SS-21NJ对直链烷烃的降解率最高为53.06％。
pH值对降解原油中直链烷烃与芳香烃实验研究结果表明，菌SS-21NJ对直链烷烃的降解率随pH值的升高先增加后降低，当pH值为7.0时，降解率最高。而当pH值为9.0时，菌对多环芳烃的降解率最高为35.37％。但总体来看，pH值的变化对降解率影响不大。因此，菌SS-21NJ在pH值为5.0～9.0条件下，有较好的适应性。
表3温度对直链烷烃与芳香烃降解效果的影响
| 温度 | PAHs | 误差棒 | 直链烷烃 | 误差棒 |
| 25℃ | 0.18555 | 0.01124 | 0.19332 | 0.01076 |
| 33℃ | 0.29003 | 0.0402 | 0.48722 | 0.02079 |
| 40℃ | 0.33897 | 0.0565 | 0.39857 | 0.03346 |
表4盐浓度对直链烷烃与芳香烃降解效果的影响
| 盐浓度 | PAHs | 误差棒 | 直链烷烃 | 误差棒 |
| 1％ | 0.29003 | 0.0302 | 0.48722 | 0.02079 |
| 2％ | 0.39991 | 0.01413 | 0.39982 | 0.04416 |
| 3％ | 0.46605 | 0.07795 | 0.53064 | 0.07913 |
表5 pH值对直链烷烃与芳香烃降解效果的影响
| pH值 | PAHs | 误差棒 | 直链烷烃 | 误差棒 |
| 5 | 0.31227 | 0.02401 | 0.45616 | 0.04862 |
| 7 | 0.29003 | 0.0302 | 0.48722 | 0.02079 |
| 9 | 0.35375 | 0.02149 | 0.44789 | 0.00597 |
表6 16种芳香烃降解率
| 16种PAHs | 降解率 | 误差棒 |
| 萘Nap | 0.97643 | 0.00511 |
| 苊烯Any | 0.36501 | 0.02255 |
| 苊Ane | 0.41389 | 0.00947 |
| 芴Fle | 0.35668 | 0.07892 |
| 菲(蒽)Phe(Ant) | 0.29893 | 0.06345 |
| 芘(荧蒽)Bap(Fla) | 0.31374 | 0.0947 |
| 苯并a蒽Baa | 0.24494 | 0.0386 |
| 屈Chr | 0.22122 | 0.07832 |
| 苯并b荧蒽Bbf | 0.20568 | 0.06569 |
| 苯并a芘(苯并k荧蒽)Bap(Bkf) | 0.20844 | 0.04663 |
| 苯并ghiBgp | 0.06442 | 0.0295 |
| 二苯并ah蒽Daa | 0.09396 | 0.02519 |
| 茚并123-CD芘Ⅰ1p | 0.1003 | 0.04115 |
图8为菌SS-21NJ对原油中16种PAHs降解效果。菌SS-21NJ在最适降解条件下(温度：33℃、NaCl为30g/L、pH＝7.0)，对原油中PAHs各组分均有一定程度的降解。尤其表现在降解低环PAHs的能力较强，相较于空白组，萘的降解率高达97.64％、苊烯降解率为35.5％、苊降解率为41.38％、芴降解率为35.67％、菲(蒽)降解率为29.90％。但随着苯环的增加，降解率逐渐减小。在探究直链烷烃各组分降解实验中，结果表明菌SS-21NJ降解烷烃各组分的能力均较强，对低碳数(C10-C16)的正构烷烃可以做到几乎完全降解，对高碳数的正构烷烃也有较好的降解能力，具有较广泛的降解范围，如图9-10所示，其中，图9为降解前油泥中直链烷烃各组分含量；图10为降解后油泥中直链烷烃各组分含量；因此菌株SS-21可在将来尝试用于处理、盐碱场地石油污染土壤修复实验及海洋石油污染修复中。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 生态环境部南京环境科学研究所
<120> 原油降解菌SS-21NJ及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1304
<212> DNA
<213> Tsuneonella flava
<400> 2
tgatagtggc gcacgggtgc gtaacgcgtg ggaacctgcc cttaggttcg gaataactca 60
gagaaatttg agctaatacc ggataatgtc ttcggaccaa agatttatcg cctttggatg 120
ggcccgcgtt ggattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc 180
tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 240
gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagcaatgc cgcgtgagtg 300
atgaaggcct tagggttgta aagctctttt accagggatg ataatgacag tacctggaga 360
ataagctccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggagc tagcgttgtt 420
cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg cggcttttca agtcaggggt gaaatcccgg 480
ggctcaaccc cggaactgcc cttgaaactg gatggctaga atcctggaga ggcgagtgga 540
attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggaaga acaccagtgg cgaaggcgac 600
tcgctggaca ggtattgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 660
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgataa ctagctgtcc gggttcatgg aacttgggtg 720
gcgcagctaa cgcattaagt tatccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 780
ggaattgacg ggggcctgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca 840
gaaccttacc agcctttgac atcctggtcg cggattagag agatcttttc cttcagttcg 900
gctggaccag tgacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 960
aagtcccgca acgagcgcaa ccctcatcct tagttgccat catttagttg ggcactttaa 1020
ggaaactgcc ggtgataagc cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt 1080
acaggctggg ctacacacgt gctacaatgg cgatgacagt gggcagctat cccgcaaggg 1140
tgagctaatc tccaaaagtc gtctcagttc ggattgtcct ctgcaactcg agggcatgaa 1200
ggcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc caggccttgt 1260
acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg tttcacccga agat 1304
Claims (8)
1.原油降解菌SS-21NJ，其特征在于：所述原油降解菌的命名为Tsuneonella flavar SS-21NJ，保藏编号为CGMCC：21760。
2.根据权利要求1所述的原油降解菌SS-21NJ，其特征在于：所述原油降解菌SS-21NJ的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1或2所述的原油降解菌SS-21NJ在降解原油中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述原油降解菌SS-21NJ用于降解原油中总石油烃、直链烷烃及多环芳烃。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在无机盐培养基中以m/v为（1%~3%）：1的接种比例首先接种原油，m代表石油污泥的质量，v代表无机盐培养基体积；
再接种原油降解菌SS-21NJ进行培养，所述原油降解菌SS-21NJ接种体积占无机盐培养基体积的1%~2%。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：培养温度为25~40℃，所述无机盐培养基pH为5.0~9.0，所述原油中NaCl质量浓度占无机盐培养基的1%~3%。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将原油降解菌SS-21NJ菌培养至对数生长期后再接入灭菌后的无机盐培养基；所述无机盐培养基pH为6.0~7.0，NaCl的质量浓度占无机盐培养基的3%。
8.一种原油降解剂，其特征在于：该降解剂含有权利要求1或2所述的原油降解菌 SS-21NJ。
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| Complete Genome Sequence of Tsuneonella flava SS-21NJ， a Potential Oil Sludge Bioremediation Agent;Shuo Sun et. al.;《Journal of Clinical Microbiology》;20210520;全文 * |
| Tsuneonella flava strain SS-21NJ chromosome, complete genome;GenBank: CP061510.1;《GENBANK》;20210224;16s rRNA gene * |
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