CN115125158B

CN115125158B - 一种用于降解石油烃的菌株、菌剂及其应用

Info

Publication number: CN115125158B
Application number: CN202210147778.XA
Authority: CN
Inventors: 刘丽红; 屈霜; 张雷; 崔婕; 潘朔; 王馨怡
Original assignee: Northeast Petroleum University
Current assignee: Northeast Petroleum University
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-02-17
Also published as: CN115125158A

Abstract

本发明公开了一种用于降解石油烃的菌株、菌剂及其应用，所述菌株为不动杆菌D2，所述不动杆菌D2在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO.24205。本发明菌株能够降解石油烃，降解效率高、速度快；此外，该菌株对盐碱环境具有优异的耐受性，具体地，能够在pH值为8.0以上以及盐浓度1％以上的环境下，高效的降解石油烃。

Description

一种用于降解石油烃的菌株、菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及石油污染治理技术领域，具体涉及一种用于降解石油烃的菌株、菌剂及其应用。

背景技术

随着社会的不断发展，人类对能源的需求与日俱增。现代经济对石油的依赖程度很高，石油及石油产品给人类生产生活带来诸多方便的同时，也由于天然和人为因素，在石油勘探、开采、运输和储存过程中直接或间接地向土壤排放石油污染物，对人类赖以生存的环境造成了严重的危害。石油是一组复杂的化合物，含有一定量的饱和烃、芳香烃、非烃、沥青质以及氮、硫和氧等化合物。石油具有稳定性强，生物富集率高，潜在毒性大等特点，进入土壤环境后，易与土壤颗粒粘连影响土壤通透性，使得氧气及营养物质传递困难，引起土壤有机质的碳氮比(C/N)和碳磷比(C/P)的变化，引起土壤微生物群落的变化。此外，石油中芳香烃组分多数能够通过食物链的传递在生物体内蓄积，这将危害人类健康。石油污染物还可通过地下水污染及污染转移过程对人类生存环境等多个层面造成严重威胁。石油对土壤和水环境的污染一直是一个世界性的问题。地面溢油、运输过程中的泄漏事故和污泥废弃物的堆积极大地威胁着油田的生态系统。此外，许多石油勘探区位于盐碱性环境。例如，阿拉伯海湾是一个典型的盐盆地，由于蒸发速率高于水的输入速率，世界上60％的海上石油是在这里生产和运输的。中国的大庆、胜利、大港等原油产区也有许多盐碱油田。由于环境受到石油、盐度和碱度的混合污染，因此，开发高效的原油脱除技术至关重要。

生物修复技术越来越受到人们的关注，因为与化学和物理方法相比，生物修复技术在去除原油方面更加经济有效。烷烃作为原油的主要组分，可以被许多微生物(包括细菌、丝状真菌和酵母)用作碳源。其中不动杆菌被认为是一种能够通过脂肪酸β-氧化途径有效降解烷烃的微生物。几十年来，研究人员从各种水和沉积物环境中，特别是从海洋生态系统中获得了几种不动杆菌菌株。这些菌株在pH值6-7时生长最佳，几乎不耐碱。对于盐碱油田的微生物修复，面临着很多重大挑战，包括细胞膜破坏、羟化酶活性抑制、氧的低溶解度和低生物利用度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于降解石油烃的菌株、菌剂及其应用，该菌株对盐碱环境具有优异的耐受性，并能够降解石油烃，降解效率高、速度快。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种用于降解石油烃的菌株，所述菌株为不动杆菌 D2，其拉丁文名称为Acinetobacter sp.D2，所述不动杆菌D2在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO.24205；保藏日期为2021年12 月27日，保藏地址为中国北京。

本发明第二方面提供一种用于降解石油烃的菌剂，所述菌剂包括上述菌株。

本发明第三方面提供一种上述菌株或上述菌剂在降解石油烃中的应用。

优选地，所述石油烃的降解环境为pH值为8～10；盐浓度为1％～4％。

本发明第四方面提供一种盐碱油田中石油烃的降解方法，所述降解方法包括：将上述菌株或上述菌剂接种至所述盐碱油田中。

优选地，所述盐碱油田的pH值为8～10；盐浓度为1％～4％。

本发明第五方面提供一种含油废水中石油烃的降解方法，所述降解方法包括：将上述菌株或上述菌剂接种至所述含油废水中。

优选地，所述含油废水的pH值为8～10；盐浓度为1％～4％。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明菌株能够降解石油烃，降解效率高、速度快；此外，该菌株对盐碱环境具有优异的耐受性，具体地，能够在pH值为8.0以上以及盐浓度1％以上的环境下，高效的降解石油烃。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例1中不动杆菌D2的SEM图以及16S rDNA全长序列 (1249bp)的邻居连接系统发育树；

图2为本发明实施例2中在不同pH和NaCl浓度条件下不动杆菌D2在7d 的降解速率和微生物密度；

图3为本发明实施例3中不动杆菌D2对不同浓度的原油的降解率和微生物密度；

图4为本发明实施例4中不动杆菌D2对原油的降解动力学曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

本实施例为用于降解石油烃的菌株的筛选，具体筛选过程如下：

采集大庆油田石油烃污染区域(46.55N,125.12E)地表下15～20cm深度的土壤样品，初步剔除草根、石块等杂质后，低温寄送至实验室进行一下阶段功能菌株分离筛选工作；

将2g土壤样品放入装有100mL无机盐培养基的烧瓶中，加入2％w/v NaCl 和0.5％w/v原油，调整pH至9，30℃，120rpm摇晃7天；然后将10ml液体转移到相同的培养基中，连续3周。将菌株在含一层灭菌原油的琼脂培养基中培养3d，将生长良好的单菌落划线并反复分离；将2mL菌悬液(OD600＝1.0) 接种到含0.5％w/v原油的100mL MSM中培养7d；利用剩余油重量估算法筛选出优势菌株，即筛选得到本发明不动杆菌D2，其中，采用的MSM包括1g·L^-1K₂HPO₄、1g·L^-1KH₂PO₄、1g·L^-1NH₄NO₃、0.2g·L^-1MgSO₄、0.02g·L^-1CaCl₂、 0.05g·L^- ¹FeCl₃。

根据伯杰氏手册对不动杆菌D2的生理生化特性进行鉴定：

用扫描电镜观察细胞形态，观察结果如图1(a)所示；

分类学鉴定采用16S rDNA分析，获得的不动杆菌D2的16S rDNA序列由北京美吉生物技术有限公司测定；使用EzTaxon-e服务器(EzTaxon-e database-EzBioCloud)对合成的16S rDNA基因序列进行相似性搜索。采用Mega 6.0软件，Neighbor-Joining法构建系统发育树，具体如图1(b)所示；

由图1可知：筛选菌株D2在系统发育上属于不动杆菌。系统发育分析显示，本发明不动杆菌D2的16S rDNA与耐盐不动杆菌R160T(NR149800)的序列相似性高达99.82％。

将筛选得到的不动杆菌D2单菌落划线接种至LB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱内，30℃培养72h，菌落规则，米白色半透明，表面光滑且湿润，边缘规则，无晕环，中央微凸起，直径2～4mm；其中，在LB固体培养基中加入10g·L^-1蛋白胨、5g·L^-1酵母膏、20g·L^-1琼脂，NaCl浓度为20g· L^-1，用1M NaOH和1M HCl调节pH至9。

实施例2

本实施例为实施例1中不动杆菌D2最佳pH值和盐浓度的研究；

在摇瓶中加入100mL无机盐培养基，后加入原油(0.5％w/v)并进行灭菌，再采用氢氧化钠和盐酸调节pH值，采用氯化钠调节盐浓度；随后，接种菌悬液10mL(OD600＝1.0)进行原油降解试验；

按照上述方法进行了在盐浓度为2％条件下不同pH(7,8,9,10,11)，以及在pH值为9的条件下不同NaCl(0,2％，4％，6％，8％w/v)浓度下的原油降解实验；所有实验均在35℃、120r/min摇匀条件下进行；所有的实验重复进行3次，第7天，采用重量法测定实验组的残余原油浓度。简单地说，原油在等量二氯甲烷中提取三次，分离漏斗的底部混合物转入无水硫酸钠过滤器，然后提取液收集到称量的烧杯中，在通风柜中蒸发。

使用波长为600nm的紫外-可见分光光度计(Beckman DU800，美国)分析每种介质的光密度。各实验中原油降解率通过重量法计算。

其中，不同pH值条件下原油降解率以及OD600值如图2(a)所示，不同氯化钠浓度条件下原油降解率以及OD600值如图2(b)所示；

由图2可知，本发明不动杆菌D2在pH值为9，盐浓度为2％的条件下原油降解效率最高。

实施例3

本实施例为不动杆菌D2对不同原油浓度的降解效果的研究

按照实施例2中的方法，在pH值为9、NaCl浓度2％(w/v)下确定不同原油浓度(0.5％、1.0％、1.5％和2.0％w/v)的降解率和OD600；具体如图3 所示；

由图3可知：随着原油浓度的增加，降解率从52.6％显著降低到17.1％，吸光度值也显著降低。高浓度的石油可能会限制碳源或氧向微生物的转移效率。

实施例4

本实施例为不动杆菌D2对原油的降解动力学分析

按照实施例2中的方法，在pH值为9、NaCl浓度2％(w/v)下确定原油浓度(0.5％)的降解动力学；未接种菌悬液的为空白对照组，共12d，每三天取样并进行测量原油浓度；每天测量OD600nm值，不动杆菌D2对原油降解动力学曲线如图4(a)所示，对照组如图4(b)所示；

由图4可知，原油浓度从第0天的0.5％w/v逐渐下降到第12天的小于 0.15％w/v。在第12天，降解效率达到最大值为72.8％。在第8天，吸光度从 0.15增加到1.31。从第9天开始，由于基质(即原油)的限制，微生物密度降低。相比之下，对照组的原油浓度在12天内几乎没有变化。动力学分析表明，原油降解过程可以很好由一阶动力学方程描述,R2值高于0.99,生物降解速率常数(k)为0.111d^-1,半衰期时间为6.24天。不动杆菌D2能在原油为碳源的盐碱环境中生长。

实施例5

本实施例为不动杆菌D2对原油组分的GC-FID分析

按照实施例4中的方法，在最佳降解条件：pH值为9、NaCl浓度2％(w/v)，原油浓度为0.5％下进行原油组分分离试验。实验组接种菌悬液10mL (OD600＝1.0)，未加菌悬液的为空白对照组。7天后，用二氯甲烷分别萃取两组原油，在通风橱内挥发至恒重。用烧杯分别量取两组实验剩余原油，约 0.05g，采用柱层析法对原油组分进行分离：首先，在氯仿中析出沥青质，随后，饱和烃用20mL正己烷、芳香烃用15mL正己烷和二氯甲烷(v/v＝1:2)混合物在重力下洗脱，极性化合物用10mL氯仿和10mL无水乙醇洗脱。

萃取的饱和烃和芳香烃通过配备火焰离子化检测器的气相色谱 (PerkinElmerElite-1)进行分析；色谱柱(50m×0.32mm)，载气为高纯度氮气(W＞99.999％)、氢气和空气，流速分别为45mL/min和450mL/min。饱和烃的GC条件如下：初始温度为80℃保持0.5min，在20℃/min增加到150℃，进行了0.5分钟，最后上以3℃/min上升,保持了25分钟，检测器温度310℃。测定芳香族碳氢化合物的气相色谱条件如下：柱温为100℃，柱温为310℃，3℃/min保持10min，检测器温度为310℃；进样量为1μL。将保留时间与标准物质匹配，检测了烷烃和芳香烃的各种中间代谢物。根据峰值面积计算了不同碳氢化合物的生物降解效率，计算结果如下表所示；

表1 微生物法降解正构烷烃

表2.微生物法降解多环芳烃菲

由表1、表2可知：经不动杆菌D2处理后，大部分正构烷烃组分被有效去除。总体而言，长链烷烃的去除效率较低。其中，短链烷烃C14-C25的平均降解率为78.8％，高于长链烷烃C26-C35的平均降解率54.5％。此外，不动杆菌D2能够降解含菲类化合物。对甲基菲的平均去除率为33.4％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims

1.一种用于降解石油烃的菌株，其特征在于，所述菌株为不动杆菌D2，所述不动杆菌D2在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNO.24205。

2.一种用于降解石油烃的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的菌株。

3.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在降解石油烃中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述石油烃的降解环境为pH值为8～10；盐浓度为1％～4％。

5.一种盐碱油田中石油烃的降解方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂接种至所述盐碱油田中。

6.根据权利要求5所述的降解方法，其特征在于，所述盐碱油田的pH值为8～10；盐浓度为1％～4％。

7.一种含油废水中石油烃的降解方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂接种至所述含油废水中。

8.根据权利要求7所述的降解方法，其特征在于，所述含油废水的pH值为8～10；盐浓度为1％～4％。