CN108949609B

CN108949609B - 处理重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法与应用

Info

Publication number: CN108949609B
Application number: CN201810511078.8A
Authority: CN
Inventors: 施维林; 史广宇; 葛嵩; 韩旭; 朱晓东; 侯静雯
Original assignee: Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd; Suzhou University of Science and Technology
Current assignee: Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd; Suzhou University of Science and Technology
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108949609A

Abstract

本发明公开了处理重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用；筛选的微生物菌株为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017832。将该微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；通过钝化作用将镉和铬固定在污染土壤中，降低镉和铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复受污染土壤的目的。

Description

处理重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，是一种修复重金属污染土壤用微生物菌株及其筛选方法与应用。

背景技术

重金属是指比重大于5的金属，目前大约有45种，如铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。少量的铜、锰、锌等重金属属于生命活动所必需要的元素，大部分的重金属如镉、汞、铅、铬等元素不是生物体所必须，且过量的重金属元素对人体有毒害作用。重金属广泛地分布于大气圈、岩石圈和水圈中。虽然在自然环境中一般不会对人类造成危害，但是随着工业及城镇的发展，土壤重金属污染的问题也日益严重，其中土壤镉、铬污染范围最广、污染程度最严重。

为了有效利用现有的土地资源、减少镉和铬等重金属对人体造成的危害，需要采取有效的治理措施来修复受污染的土壤。快速地修复镉和铬污染成为当前迫在眉睫需要解决的问题。当前针对镉和铬污染土壤的治理方法主要可以分为物理方法、化学方法和生物方法等。物理方法需要耗费大量人力物力，且移除的污染土壤又易引起二次污染。化学方法则易再度活化重金属，生物方法也具有局限性，如修复周期长，在实地修复中并没有很好的成功案例。目前多数受关注的修复技术均处于实验室试验阶段，实际修复效果并不理想。因此，寻找一种节能高效，经济环保的修复措施至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一微生物菌株及其筛选方法与该菌株在处理重金属污染土壤中的应用，所获得的微生物菌株对土壤中的重金属镉和铬具有较强的耐受性以及钝化作用，通过钝化作用将镉和铬固定在污染土壤中，降低镉和铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种处理重金属污染土壤用微生物菌株，为蕈状芽孢杆菌，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017832；保藏地址为中国武汉，武汉大学，命名为蕈状芽孢杆菌niuD。

本发明还公开了上述处理重金属污染土壤用微生物菌株的筛选方法，包括以下步骤：

（1）将镉和铬污染土壤与牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

（2）将步骤（1）得到的上清液接种到含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，经过复数次培养、离心、取上清液，获得菌液；然后将菌液在牛肉膏蛋白胨液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落；

（3）取步骤（3）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28~30℃培养3~4天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

上述技术方案中，步骤（1）中，所述振荡混合在玻璃珠存在下进行，振荡混合的温度为28~30℃，速度为160~170rpm；步骤（2）中，所述复数次为3~5次，所述培养为在28~30℃下振荡培养，所述含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，Cd²⁺的含量为50mg/L，Cr⁶⁺的含量为50mg/L，步骤（2）首先在28~30℃下振荡培养，培养完成后离心，然后取上清液转移接种至另一个含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28~30℃下振荡培养，重复上述转移接种的操作3~5次，通过富集培养的方式，对微生物菌株进行驯化，驯化完成后获得的菌液在牛肉膏蛋白胨液体培养基上进行平板划线，分离出单菌落。

自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。微生物及植物实现重金属土壤污染的修复，关键是微生物及植物的筛选。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm~30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量较少。由此可知，土壤来源不同，所分离出的菌株也各不相同。

上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5~2.5%琼脂，其余为去离子水。优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5%琼脂，其余为去离子水。

上述技术方案中，步骤（3）中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28~30℃培养3~4d；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离，在含有100 mg/L Cd² ⁺和50 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基为含有20 mg/L Cd²⁺以及10 mg/L Cr⁶ ⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有40 mg/L Cd²⁺以及20 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60 mg/L Cd²⁺以及30 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有80 mg/L Cd²⁺以及40 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有100 mg/L Cd²⁺以及50 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

不同类型土壤具有不同的物理、化学等条件，如孔隙度、含水率、pH等，不同条件适宜不同微生物生长，因此，不同类型土壤中，微生物种类有所不同。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA序列部分（SEQ ID NO:1所示）与Bacillus（芽孢杆菌属）的16s rDNA序列有100%的同源性，可确定菌属为Bacillus（芽孢杆菌属），与已知菌种的匹配中，与Bacillus mycoides（蕈状芽孢杆菌）的16s rDNA有100%同源性；与Bacillus mycoides（蕈状芽孢杆菌）在RDP-

数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Bacillus mycoides（蕈状芽孢杆菌），命名为蕈状芽孢杆菌niuD。

本发明还公开了一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，包括以下步骤，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。

本发明还公开了上述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用，优选的，所述重金属为镉和铬。加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在14d内由32.71mg/kg降到1.44mg/kg，土壤可交换态铬由15.88mg/kg降到0.34mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd²⁺和Cr⁶⁺，这说明本发明菌株对土壤中的镉和铬具有极强的钝化能力。此外，本发明所述菌株在水相中对镉和铬具有极强的耐受性以及较强的钝化能力；土壤中可交换态镉和铬的含量越低，则土壤中镉和铬的钝化效果越好，植物可利用度越低，而其对一定浓度的铬（50mg/L及以下）也具有一定耐受性和钝化能力。

本发明还公开了一种重金属污染土壤的处理方法，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

上述技术方案中，所述培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或者牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述重金属为镉和铬。

上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5~2.5%琼脂，其余为去离子水。

优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5%琼脂，其余为去离子水。

本发明筛选微生物菌株时的培养基与培养微生物菌株时的培养基可以一样，也可以不一样。作为优选，所述微生物菌株接种于培养基时，接种量为2%。

国内外虽然已经开展了镉和铬污染土壤的修复研究，但是物理化学方法成本高工艺复杂，已筛选的降解菌耐受性差，实际应用受限；本发明针对现有治理重金属污染土壤的方法具有一定局限性、实施成本高、对土壤破坏严重、易带来其他污染等问题，通过筛选出功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对污染土壤的原位修复。本发明从受重金属镉和铬污染的土壤中筛选出的蕈状芽孢杆菌能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，同时对镉和铬具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染土壤和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。

附图说明

图1为本发明筛选的微生物菌株的生长曲线。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用进行详细说明。

实施例1

本发明处理重金属污染土壤的微生物菌株的筛选采用液相富集法，包括以下步骤：

（1）称取5g污染土壤样品（土壤取自苏州市上方山，最终含有Cd²⁺50mg/kg，Cr⁶⁺50mg/kg），加入到装有牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，然后在30℃、160rpm下振荡，获得土壤混合液；

（2）将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为镉钝化微生物的来源；

（3）将步骤（2）获得的上清液接种到含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨液体培养基（Cd²⁺的含量为50mg/L，Cr⁶⁺的含量为50mg/L）中，在30℃、160rpm下振荡培养，培养完成后，离心，用无菌吸管吸取2mL上清液，移入另一个含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨液体培养基（Cd²⁺的含量为50mg/L，Cr⁶⁺的含量为50mg/L）中，再在30℃、160rpm下振荡培养；如此重复三次，通过上述富集培养的方式对微生物菌株进行驯化，驯化完成后获得的菌液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行平板划线，分离单菌落；

（4）取步骤（3）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，上清液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基（五种）上，在30℃培养4d，比较菌株的生长状况；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离、在100 mg/L Cd²⁺和50 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株，划线分离。

上述含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基为含有20 mg/L Cd²⁺以及10 mg/LCr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有40 mg/L Cd²⁺以及20 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60 mg/L Cd²⁺以及30 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有80 mg/L Cd² ⁺以及40 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有100 mg/L Cd²⁺以及50 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，命名为蕈状芽孢杆菌niuD，已于2017年2月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017832；保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明筛选的微生物菌株的鉴定根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA序列部分（SEQ ID NO:1所示）与Bacillus（芽孢杆菌属）的16s rDNA序列有100%的同源性，可确定菌属为Bacillus（芽孢杆菌属）；与已知菌种的匹配中，与Bacillus mycoides（蕈状芽孢杆菌）的16s rDNA有100%同源性；与Bacillus mycoides（蕈状芽孢杆菌）在RDP-

数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Bacillus mycoides（蕈状芽孢杆菌）。

本发明筛选的微生物菌株的序列（SEQ ID NO:1）如下：

CGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGCGCTGCATGGCGCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAA

将上述菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为2wt%，30℃、170rpm下振荡培养，间歇取样。如图1所示，为菌株的生长曲线，进入对数生长期，到达稳定期，后生长有下降趋势，进入衰亡期，浓度最高能达到OD600为1.738。

牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水；牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5%琼脂，其余为去离子水。

实施例2

将本发明筛选的微生物菌株（2wt%的新鲜菌液）接种于经121℃灭菌30min的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水，培养（160rpm，30℃下培养10h）至对数生长期，得到菌液；或将菌液用真空冷冻干燥机冻干，备用。

实施例3

向牛肉膏蛋白胨液体培养基（1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、其余为去离子水）中加入不同浓度的Cd²⁺和Cr⁶⁺，121℃灭菌30min；然后接种本发明筛选的微生物菌株，30℃、160rpm下培养，不同时间取样测OD值；在Cd²⁺浓度分别为5、20、50、100 mg/L，Cr⁶⁺浓度分别为5、10、20、50 mg/L时，该菌株分别在0.5、2、4、18h时进入对数生长期，能达到的最高OD值分别为5.89、5.55、5.42和3.50，从数据表明，该菌株对Cd²⁺仍具有极强的耐受能力。

上述接种本发明筛选的微生物菌株为取2%的新鲜菌液，或在牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落接入培养基中，本实施例为取含菌质量分数为2%的新鲜菌液。

实施例4

取实施例2制备的菌液接入经121℃灭菌30min的牛肉膏蛋白胨液体培养基（1%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、去离子水余量）中，然后加入浓度分别为10、20、50、100mg/L的Cd²⁺和浓度分别为5、10、20、50 mg/L的Cr⁶⁺，继续振荡培养12h后，取7ml菌液，8000rpm离心9min，用ICP-AES检测上清液中残余Cd²⁺和Cr⁶⁺的浓度。

公式如下:

本发明筛选的微生物菌株对10、20、50、100 mg/L Cd²⁺的去除率分别为82.36%、78.29%、69.66%、33.11%，对5、10、20、50 mg/L Cr⁶⁺的去除率分别为98.12%、82.55%、57.87%、21.98%。

也可以将菌液用真空冷冻干燥机冻干后接入经121℃灭菌30min的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，效果近似。

实施例5

取实施例2制备的菌液加入到含有重金属镉的污染土壤中，搅拌均匀，培养14d，保证含水量为23%，10天后，将土壤在60℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉和铬。具体做法如下：a．可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL 0 .1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心20min；取上清液，用ICPAES测定Cd²⁺和Cr⁶⁺含量；加入无菌水清洗残余物，振荡20-30min，离心，弃去清洗液；

b．可还原态：向a离心分离出的残渣中加入40mL0 .5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中24± 1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心15min；其余步骤同步骤a；c．可氧化态：向b离心分离出的残渣中加入10mL H₂O₂，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持85℃± 2℃ 1h左右，再加入10mLH₂O₂，在恒温水浴箱中加热保持85℃± 2℃ 1h左右；冷却后，加入50mL 1mol/L的NH₄Ac，放在恒温振动器中24± 1℃下连续震荡16h，然后5000r/min下离心20min；其余步骤同步骤a；

d．残渣态：向c离心分离出的残渣中加入10mL HNO₃，使酸和样品充分混合均匀；进行微波消解（参考EPA3052中的微波消解法）；

e．测总量：准确称取过100目筛的风干土壤样品0 .5g，加入10mL HNO₃，微波消解方法同上；f .水洗脱：将处理前后的土壤样品烘干或自然风干后过100目筛，准确称取5g土壤，加入20ml无菌水，置于恒温振荡器中振荡洗脱16h，然后离心测定上清液中被洗脱下来镉的量。表1为各种形态的镉检测结果，表2为各种形态的铬检测结果。由表1可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在10d内由32.71mg/kg降到1.44mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd²⁺，这说明本发明菌株对土壤中的镉具有极强的钝化能力；通过总量的检测，处理前后的镉总量基本一致，检测方法未造成镉的增加或减少，各种状态下的镉含量检测准确。由表2可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态铬在10d内由15.88mg/kg降到0.34mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cr⁶⁺，这说明本发明菌株对土壤中的铬具有较强的钝化能力；通过总量的检测，处理前后的铬总量基本一致，检测方法未造成铬的增加或减少，各种状态下的铬含量检测准确。也可以取真空干燥后冻干的菌体；效果近似。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州科技大学

苏州逸凡特环境修复有限公司

<120> 处理重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgctatac atgcaagtcg agcgaatgga ttaagagctt gctcttatga agttagcggc 60

ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccataagact gggataactc cgggaaaccg 120

gggctaatac cggataacat tttgcgctgc atggcgcgaa attgaaaggc ggcttcggct 180

gtcacttatg gatggacccg cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240

caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300

gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360

acgccgcgtg agtgatgaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag 420

tgctagttga ataagctggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag 540

cgcgcgcagg tggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca 600

ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg tagcggtgaa 660

atgcgtagag atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtaactgaca 720

ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780

acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt gctgaagtta acgcattaag 840

cactccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960

catcctctga caaccctaga gatagggctt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020

atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ttgatcttag ttgccatcat taagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140

aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200

acaatggacg gtacaaagag ctgcaagacc gcgaggtgga gctaatctca taaaaccgtt 1260

ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320

gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380

agagtttgta acacccgaag tcggtggggt aaccttttgg agccagccgc ctaaggtggg 1440

acagatgatt ggggtgaa 1458

Claims

1.一种处理重金属污染土壤用微生物菌株，其特征在于：所述处理重金属污染土壤用微生物菌株为蕈状芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017832。

2.权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用；所述重金属为铬和镉。

3.一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，将权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将权利要求1所述处理重金属污染土壤用微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液，将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂；所述重金属为铬和镉。

4.一种重金属污染土壤的处理方法，其特征在于：将权利要求1所述处理重金属污染土壤的微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；所述重金属为铬和镉。

5.根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠，其余为去离子水。