CN109759436B - 耐锰普罗威登斯属细菌菌株及修复重金属污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐锰的普罗威登斯属细菌菌株及修复重金属污染土壤的方法。所述菌株保藏编号为CCTCC M 2018876，命名为Providencia sp.LLDRA6。本发明方法可以有效吸附土壤中的重金属，从而降低了土壤中重金属的积累量。该方法成本低廉、修复效果好，不破坏土壤肥力、不存在土壤的二次污染。

Description

耐锰普罗威登斯属细菌菌株及修复重金属污染土壤的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体地说，本发明涉及一株耐锰的普罗威登斯属细菌菌株及修复重金属污染土壤的方法。

背景技术

在整个陆地生态系统中，土壤是最重要的组成部分。它不但是人类和动物居住不可替代的环境因子，也是食物安全与人体健康的基本保障。并且土壤在保护环境和维持生态平衡中具有重要的作用。而随着工业化、城镇化和现代农业的快速发展，重金属在工农业中得到越来越多的应用。并且，由于工艺的落后和资源的不合理利用，导致越来越多的重金属以各种途径和形式进入水体、土壤等介质中，使我国饮用水、耕地质量、农产品安全质量和人民身心健康受到了前所未有的威胁。土壤重金属污染与常见的工业排放的废气污染、废水污染、固体废弃物污染以及人类生活垃圾污染相比，具有累积性、滞后性、不可见性和隐蔽性。土壤重金属主要包括汞、铬、镉、铅、锰和类金属砷等。日益加重的土壤重金属污染使得土壤中营养元素迅速流失，导致土壤农作物减产和农产品质量下降，危害到人们的食品安全。这不仅破坏了陆地生态的可持续发展，而且直接制约了当前我国农业经济、公共安全等领域的可持续发展。目前重金属污染治理手段分为三种，分别是物理修复、化学修复、生物修复。其中，生物修复是利用一切生物主体治理污染土壤与水体中的污染物(例如镉、铜等重金属)，削减、净化或降低重金属毒性，它包括植物、动物和微生物修复技术。

目前，国内外对于普罗维登斯菌属的研究大多和医学相关，未有关于修复重金属锰污染土壤的报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一株耐锰的普罗威登斯属细菌菌株及修复重金属污染土壤的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述耐锰的普罗威登斯属细菌菌株与2018年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC M 2018876，命名为Providencia sp. LLDRA6。所述菌株的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述菌株最适生长时间为28h；最适生长pH为7；最适生长温度为35℃。

基于上述菌株修复重金属污染土壤的方法是将上述菌株接种于LB液体培养基内培养，得到菌液，将菌液加入到被重金属污染的土壤中，使菌液和土壤充分混合，吸收土壤中的重金属；其中，每500mg的重金属污染土壤中加入500mL的菌液。所述重金属中包括Mn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Cr⁶⁺、Zn²⁺六种重金属离子。

本发明经过富集培养和多次分离筛选所得到的普罗威登斯优势菌株的重金属锰的耐性高达500mM。其生理生化反应结果表明，吲哚实验、甲基红实验、明胶液化实验、革兰氏染色实验、硫化氢产生实验、苯丙氨酸脱氨酶实验均为阴性；VP实验、柠檬酸盐实验、淀粉水解实验、过氧化氢酶实验、葡萄糖发酵实验均为阳性。实验结果表明，本发明所述的耐锰的普罗威登斯属细菌菌株在其移动的过程中可以有效吸附土壤中的重金属，大大降低了土壤中重金属的积累量。该方法成本低廉、修复效果好，不破坏土壤肥力、不存在土壤的二次污染。

附图说明

图1为DNA提取凝胶电泳结果；

图2为PCR凝胶电泳结果；

图3为普罗威登斯细菌的系统发育树；

图4为普罗威登斯细菌的生理生化反应结果；

图5为普罗威登斯细菌的生长曲线；

图6为普罗威登斯细菌在不同pH条件下的生长情况；

图7为普罗威登斯细菌在不同温度条件下的生长情况；

图8为普罗威登斯细菌在不同重金属离子浓度下的生长情况；

图9为菌株随重金属Mn初始浓度变化的吸附曲线；

图10为土壤中重金属含量。

具体实施方式

本发明所述耐锰的普罗威登斯属细菌菌株筛选和应用过程如下：

步骤一，分离菌株

土壤采样及处理：利用多点随机采样法从株洲市清水塘某工业园区采取地下5～20cm重金属污染土壤样品，进行混合。将样品与无菌水按1：9的比例混合、静置。取上清液2mL分别添加到含有浓度为50mM的Mn²⁺、Cd²⁺、 Pb²⁺、Cu²⁺、Cr⁶⁺、Zn²⁺的100mL液体LB培养基中，再放到35℃恒温摇床培养箱中进行48h左右的培养。

步骤二，细菌纯化

取1mL步骤一的菌液，采用梯度稀释涂板法，均匀涂布于LB固体培养基上，倒置培养12～24h，发现只含有Mn²⁺的固体培养基上有菌落生长。挑取菌落外观呈扁平状，且边缘不圆整的单菌落再次接种于含有50mM Mn²⁺的液体培养基中，进行纯化培养。

步骤三，细菌种属与生理生化鉴定

用在上海生工购买的DNA抽提试剂盒进行所挑选菌株的DNA提取，所得DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳(图1)。

然后进行PCR扩增(50μL体系)，将PCR后的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。

将PCR产物送去相关机构进行测序，将检测出来的全部碱基序列利用 Genbank官方网站(https://www.ncbi.nlm.gov/genbank/)上的BLAST功能进行对比，将其中可以用来分析的比对序列通过Clustal软件或MEGA软件进行多序列比对，随后进行系统发育树的构建，结果为普罗威登斯菌属(图3)。进行生理生化反应实验(图4)。

步骤四，时间、pH、温度对菌株生长的影响

将纯化后的菌株接种于50mL的液体培养基中，培养时间为36h。每过4 h时用石英比色皿在紫外分光光度计下进行OD₆₀₀的测定(图5)。取一样的生长于液体培养基环境中的菌液进行实验，在pH 3～10的条件下(图6)。取一样的存活于液体培养基环境中的菌液进行实验，在温度为29～41℃的条件下 (图7)。

步骤五，普罗威登斯细菌的耐重金属特性分析

1)普罗威登斯细菌的耐重金属情况

配置Mn²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Cr⁶⁺、Zn²⁺浓度为不同梯度的LB液体培养基，将高活性的菌液接种于其中，期间每隔4h取出一定量菌液测量其OD 值，从而判断六种重金属的抗性(图8)。

由图8可以看出，Cd²⁺的最大抗性为2mM，Pb²⁺的最大抗性为4mM， Cu²⁺的最大抗性为4mM，Cr⁶⁺的最大抗性为10mM，Zn²⁺的最大抗性为200 mM，而Mn²⁺的最大抗性为500mM。在六种重金属中，Mn²⁺的抗性最大。

2)普罗威登斯细菌的锰吸附情况

根据上一步骤并根据公式1.1与1.2计算出该菌在25～200mM浓度下的吸附率和吸附量(图9)。

吸附率和吸附量严格按照下面公式进行计算：

式中：W-吸附率；C_t-某时间点上的上清液重金属浓度；C_i-溶液初始重金属浓度。q-吸附量；C_f-溶液最终重金属浓度；V-菌液体积；m-菌体质量。由吸附锰情况的分析结果表明，在Mn²⁺浓度为25mM的时，菌株可以达到49％的吸附率；在Mn²⁺浓度为200mM的时，菌株可以达到274.5mg/g的吸附量。

步骤六，修复重金属土壤的应用

土壤处理：对原始污染土壤进行多轮处理。取1.5Kg混合土壤，分成三等份(500g/份)，取一份土壤烘干，消解处理；另一份土壤加入500mL无菌 LB培养基；最后一份加入500mL菌液(OD₆₀₀＝2.0)，同时进行摇床培养14h，转速180r/min，温度35℃。用无菌水清洗土样三次。重复上述过程五次。烘干、消解处理。

消解处理及重金属测定：干燥的土壤样品用细布筛过，把筛过的土壤放入马弗炉中400～500℃过夜处理。取10g冷却后的土样加入80mL的王水 (HNO₃:HCl＝1:3)，在热板上进行消解，直到产生浓烟，得到透明的溶液。透明溶液使用惠特曼滤纸(No.42)进行过滤，重复进行测量，采用ZA-3000型原子吸收分光光度计测量溶液中Pb²⁺，Zn²⁺，Cr⁶⁺，Cd²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺的浓度。

检测结果及分析

检测结果(图10)可知，原始土壤中重金属Mn²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、 Cu²⁺、Cr⁶⁺的含量为815,1140,1760,69.9,437,87mg/kg，普罗威登斯细菌对土壤中重金属Mn²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Cr⁶⁺具有很好的吸附作用，其去除率分别为：89.94％，89.47％，86.08％，71.39％，65.68％，60.92％。明显减低了土壤中重金属的含量。其中，对重金属的吸附效果强弱顺序为 Mn²⁺>Pb²⁺>Zn²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺>Cr⁶⁺。无菌LB培养基与带有普罗威登斯菌的LB 培养基同时处理土壤的结果比较表明，普罗威登斯细菌对土壤中重金属Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺的吸附效果更好，其中对Mn²⁺的去除率最高。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南工业大学

<120> 一株耐锰的普罗威登斯属细菌菌株及修复重金属污染土壤的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggcaatgcgg cagctacaca tgcagtcgag cggtaacagg ggaagcttgc ttctcgctga 60

cgagcggcgg acgggtgagt aatgtatggg gatctgcccg atagaggggg ataactactg 120

gaaacggtgg ctaataccgc ataatctctt aggagcaaag caggggaact tcggtccttg 180

cgctatcgga tgaacccata tgggattagc tagtaggtgg ggtaatggct cacctaggcg 240

acgatcccta gctggtctga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat 360

gccgcgtgta tgaagaaggc cctagggttg taaagtactt tcagtcggga ggaaggcgtt 420

gatgctaata tcatcaacga ttgacgttac cgacagaaga agcaccggct aactccgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc 540

acgcaggcgg ttgattaagt tagatgtgaa atccccgggc ttaacctggg aatggcatct 600

aagactggtc agctagagtc ttgtagaggg gggtagaatt ccatgtgtag cggtgaaatg 660

cgtagagatg tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc 720

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atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggt gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga 840

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gcggtggagc atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc 960

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ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1080

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aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagt agggctacac acgtgctaca 1200

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agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat 1320

cagaatgcta cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380

gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac cttcgggagg gcgctaccac ttgatattgc 1440

Claims (4)

1.一株耐锰的普罗威登斯属细菌菌株，其特征在于，所述菌株保藏编号为CCTCCM2018876，命名为Providencia sp.LLDRA6；

所述菌株的核酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株最适生长时间为28h；最适生长pH为7；最适生长温度为35℃。

3.基于权利要求1至2任一项所述菌株修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1或2所述的菌株接种于LB液体培养基内培养，得到菌液，将菌液加入到被重金属污染的土壤中，使菌液和土壤充分混合，吸收土壤中的重金属；其中，每500mg的重金属污染土壤中加入500mL的菌液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重金属中包括Mn2+、Cd2+、Pb2+、Cu2+、Cr6+、Zn2+六种重金属离子。

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