CN111961633A - 具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于染料‑重金属污染处理技术领域，公开了一种具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用，取深海沉积物样品加入到添加有Cr(VI)和酸性黑ATT的灭菌液体2216E培养基中，振荡进行富集培养；菌液接种到同样的培养基中以同样的条件第二轮富集培养后进行梯度稀释；不同稀释度菌液分别涂布在含同样浓度Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，恒温培养箱中培养；观察记录不同单菌落特征，挑取不同形态的单菌落进行划线纯化，即可得到具Cr(Ⅵ)和偶氮染料耐受性的纯菌株。本发明对皮革厂废水处理实验表明，该不动杆菌的六价铬还原率和脱色率都在60％以上，降解产物生物毒性大大降低，取得良好效果。

Description

具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用

技术领域

本发明属于染料-重金属污染处理技术领域，尤其涉及一种具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用。

背景技术

目前，皮革产业在我国经济发展中起着重要作用，同时也产生了大量废水。皮革废水的净化是城市水环境管理的难题之一。皮革废水包含大量的铬和合成染料。大部分的皮革染料为毒性强、降解性差的偶氮染料。这类染料以致癌芳香胺作为中间体合成，被排放到自然水体后，在水体中富集，经过食物链富集进入人体后可引发人类恶性肿瘤物质，导致膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌等恶性疾病。Cr₂O₃能与一系列偶氮类化合物反应形成稳定的铬-染料化合物。铬是一种重要工业材料，六价铬的毒性是三价铬的100倍，所以通常处理六价铬的方法是将六价铬转化为三价铬。在不同的染料-重金属污染处理方法中，微生物处理法以投资小、运行费用低、无二次污染等优点引起越来越多的重视。一些从废水和土壤中分离获得的微生物已被发现能够有效去除培养基中的铬和染料。然而，这些微生物在pH、温度和盐度波动的情况下处理能力显著降低。皮革废水中由于原皮保藏、浸酸和鞣制工序往往带有较高的盐分，这些盐分会影响大部分微生物的生长，从而阻碍废水中六价铬和染料的生物修复。

针对六价铬废水通常与和盐分、染料共存的问题，对海洋菌株进行了筛选，找到一株嗜盐不动杆菌，具有同时还原六价铬为三价铬以及对多种工业偶氮染料脱色的功能。据文献查阅可知，不动杆菌属细菌有六价铬还原和偶氮染料脱色方面的报道，但尚未发现同时具有六价铬还原和偶氮染料脱色功能的不动杆菌。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)皮革废水成分复杂，含有六价铬和偶氮染料成稳定的化合物难以降解，而废水中的盐分对大部分微生物的生长产生影响，进一步阻碍废水中六价铬和染料的生物修复。

(2)偶氮染料降解后会形成致癌芳香胺作为中间产物，以往对偶氮染料的修复效果多数停留在脱色率的检测上，未对修复前后废水生物毒性进行分析比较。

解决以上问题及缺陷的难度为：

(1)目前用于生物修复的微生物耐盐性不高，难以满足高盐度皮革废水中具有毒性的六价铬和偶氮染料去除要求。

(2)生物处理以去除废水中污染物和降低毒性为目的，需要验证并确保处理后水体的生物安全性得以提高。因此分析水体毒性效应对于正确评价污水生态风险和生物修复的效果具有重要意义。

解决以上问题及缺陷的意义为：解决现有微生物在高盐环境下对皮革废水中六价铬的还原和偶氮染料降解能力降低的问题，提供盐耐受性高并可在好氧条件下去除污染水源中六价铬和多种偶氮染料的抗辐射不动杆菌 (Acinetobacter radioresistens)B30。以前的研究发现不动杆菌属细菌有六价铬还原和偶氮染料脱色的能力，但尚未发现同时具有六价铬还原和偶氮染料脱色功能的不动杆菌。本发明为污水处理系统提供了实用的微生物资源。采用对毒性物质敏感的海洋模式生物卤虫作为受试生物，对抗辐射不动杆菌B30处理前后水体急性毒性效应进行比较，发现B30处理能显著降低染料、Cr(VI)和皮革废水的毒性效应。该菌株在重金属和染料污染的高盐度废水生物修复中有良好的应用前景，为保障城镇污水处理高效安全的正常运行具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用。

本发明是这样实现的，一种具有六价铬去除和脱色的不动杆菌，所述具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的保藏编号为CGMCC No.20073。

本发明的另一目的在于提供一种所述具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法，所述具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法包括：

第一步，取深海沉积物样品加入到添加有Cr(VI)和酸性黑ATT的灭菌液体 2216E培养基中，振荡进行富集培养；

第二步，菌液接种到同样的培养基中以同样的条件培养进行第二轮富集，稀释；

第三步，各吸取涂布在含同样浓度Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，恒温培养箱中培养；

第四步，观察记录不同单菌落特征，挑取不同形态的单菌落进行划线纯化，即可得到具Cr(Ⅵ)和偶氮染料耐受性的纯菌株。

进一步，所述第一步取深海沉积物样品1g加入到100mL添加有50mg/L Cr(VI)和50mg/L酸性黑ATT的灭菌液体2216E培养基中，以170rpm、30℃振荡3天进行富集培养。

进一步，所述第二步6mL菌液接种到同样的培养基中以同样的条件培养进行第二轮富集，以10倍梯度稀释。

进一步，所述第三步不同稀释度菌液各吸取0.2mL涂布在含同样浓度 Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24h。

进一步，所述深海沉积物样品由电视抓斗采样器采集，样品采集后立刻转移到4℃保存。

本发明的另一目的在于提供一种皮革废水处理方法，所述皮革废水处理方法使用所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种重金属的高盐度废水生物修复方法，所述重金属的高盐度废水生物修复方法使用述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种染料污染的高盐度废水生物修复方法，所述染料污染的高盐度废水生物修复方法使用所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种城镇污水处理方法，所述城镇污水处理方法使用所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明对皮革厂废水处理实验表明，该不动杆菌的六价铬还原率和脱色率都在60％以上，降解产物生物毒性大大降低，取得良好效果。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法流程图。

图2是本发明实施例提供的不同菌株对胰胨大豆肉汤(TSB)液体培养基中 50mg/LCr(VI)和50mg/L酸性黑ATT的降解百分率示意图。

图3是本发明实施例提供的基于16S rDNA序列的菌株B30系统发育树示意图。

图4是本发明实施例提供的pH对B30脱色和Cr(VI)还原效率的影响(温度： 30℃；NaCl浓度：5％)示意图。

图5是本发明实施例提供的温度对B30脱色和Cr(VI)还原效率的影响(pH： 6.0，NaCl浓度：5％)示意图。

图6是本发明实施例提供的NaCl浓度对B30脱色和Cr(VI)还原效率的影响 (pH：6.0，温度：25℃)示意图。

图7是本发明实施例提供的B30对皮革废水的生物修复(温度：25℃，pH： 6.0，NaCl浓度n：4％)示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的保藏编号为CGMCC No.20073；生物材料B30于2020年6月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到，并登记入册，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，地址:北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，电话:010-64807355，传真:010-64807288，电子邮件:cgmcc@im.ac.cn，http://www.cgmcc.net；由2020 年6月12日起保存三十年，在期满前收到提供生物材料样品的请求后再延续保存五年；国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于2020年6月12日检测，检测结果是存活。生物材料B30的分类命名为抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)。

如图1所示，本发明提供的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法包括以下步骤：

S101：取深海沉积物样品1g加入到100mL添加有50mg/L Cr(VI)和50 mg/L酸性黑ATT的灭菌液体2216E培养基中，以170rpm、30℃振荡3天进行富集培养；

S102：6mL菌液接种到同样的培养基中以同样的条件培养进行第二轮富集，以10倍梯度稀释；

S103：不同稀释度的菌液分别吸取0.2mL涂布在含同样浓度Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24h；

S104：观察记录不同单菌落特征，挑取不同形态的单菌落进行划线纯化，即可得到具Cr(Ⅵ)和偶氮染料耐受性的纯菌株。

本发明提供的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用仅仅是一个具体实施例而已。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、六价铬和偶氮染料耐受菌的富集分离纯化，深海沉积物样品由“大洋一号”考察船26航次于2012年6月获得，采集自北大西洋DY26-2TVG02站位 (26.13N，44.82W)，水深3667m，由电视抓斗采样器采集。样品采集后立刻转移到4℃保存。

取深海沉积物样品1g加入到100mL添加有50mg/L Cr(VI)和50mg/L酸性黑ATT的灭菌液体2216E培养基中(海博生物，HB0132-1)，以170rpm、30℃振荡3天进行富集培养。然后6mL菌液接种到同样的培养基中以同样的条件培养进行第二轮富集。之后以10倍梯度稀释，分别吸取0.2mL不同稀释度的菌液涂布在含同样浓度Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24h，观察记录不同单菌落特征，之后挑取不同形态的单菌落进行划线纯化，即可得到具Cr(Ⅵ)和偶氮染料耐受性的纯菌株。

2、纯化菌株的六价铬还原及偶氮染料脱色性能鉴定

获得的纯化菌株以170rpm、30℃在2216E液体培养基中过夜预培养后，以1％的接种量接种到添加有50mg/L Cr(VI)和50mg/L酸性黑ATT的100mL胰胨大豆肉汤(TSB)液体培养基中(海博生物，HB4114-19)。每组三个平行样，同时设立两个对照组，一个对照组没有接种；另一个对照组接种经过高压灭菌的菌株，将预培养的菌液经5000g离心5min后，灭菌(121℃，20min)并在 TSB液体培养基重悬，然后接种到添加Cr(VI)和染料的TSB培养基中。在170 rpm、30℃培养7天后，菌液经4000g离心5min，取上清液于618nm处测定其 OD值，以不接种的培养基为对照，计算脱色率。并采用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr(Ⅵ)浓度，计算Cr(Ⅵ)还原率。

经过取样富集、分离纯化后得到三株菌株(B06、B21和B30)同时具有六价铬还原和偶氮染料脱色性能。高压灭菌组的Cr(VI)和染料降解率低于5％，说明减少的污染物是由存活细胞的生物学活性所介导的。B30的脱色率和Cr(VI) 还原率高于B06和B21(图2)。

3、菌株的16S rDNA分子鉴定，挑取平板上的菌落至无菌水中，置于95℃金属浴5～10min后，离心取含有菌株DNA的上清液作为模板。应用细菌 16SrDNA基因通用引物，正向引物为27F(5’-AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG-3’)，反向引物为1492R(5’-GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3’)，扩增海洋细菌B30的16S rDNA序列，经过扩增产物测序得到大小为1442bp的基因片段，碱基序列如SEQ ID NO:1所示。将测序结果与NCBI及EzBioCloud数据库中的 16SrDNA序列进行同源性比对，结果显示菌株B30与抗辐射不动杆菌DSM 6976亲缘关系最近，同源性达到99.72％。然后，选取菌株B30及同源性相近菌株的16S rDNA序列，试用MEGA4.0、NJ算法构建系统进化树(bootstrap重复1000次)，得到进化树结果如图3所示。

4、pH、温度和盐度对B30脱色和Cr(VI)还原的影响，用NaOH和HCl将实验培养基的初始pH值调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。培养基中添加的初始染料和Cr(VI)的浓度均为100mg/L，NaCl浓度为5％。接种B30，于170rpm、 30℃培养7天后，检测不同pH值对菌株B30脱色和Cr(VI)还原效率的影响。结果如图4所示，B30脱色和Cr(VI)还原效率随着初始pH值的增大呈现出先增后减的趋势，其中初始pH 7.0时Cr(VI)的还原效率最高，在pH6.0条件下脱色效率最高。在pH为6.0时B30具有良好的Cr(VI)还原和脱色效果。

为了探究温度对B30脱色和Cr(VI)还原的影响，将B30培养温度设为20、 25、30、35、40℃，培养基中添加的初始染料和Cr(VI)的浓度均为100mg/L，初始pH设置为6，于170rpm培养7天后，检测不同温度对菌株B30脱色和Cr(VI) 还原效率的影响。结果如图5所示，B30能够在不同温度条件下对培养基中的六价铬和染料进行生物修复，其六价铬还原和染料脱色最佳温度均为30℃。当温度在25℃和30℃之间时两种污染物的修复效率没有显著差异。由于现实污水处理过程通常在不超过30℃的温度下进行的，因此选择25℃作为最佳温度。

为探究盐度对B30脱色和Cr(VI)还原的影响，将培养基原始盐度调在0～8 范围内，如图6所示，在2％NaCl浓度下，B30脱色效果最佳，在4％的NaCl 浓度下B30的Cr(VI)还原效率最高。

5、B30对不同染料的脱色效果，皮革废水中含有不同的染料。实验测试B30 对7种包括活性、酸性、直接结构不同的偶氮染料的降解能力进行分析。结果如表1所示，所有样品都观察到不同程度的脱色现象。B30对橙黄II、酸性黑 ATT和活性艳红K-2BP等单偶氮染料脱色效率较高，达到80％以上，对直接紫、酸性大红GR，直接大红4BS和直接湖蓝5B等双偶氮染料脱色率均在20～60％之间。B30对活性、酸性、直接等多种染料进行脱色，说明B30具有脱色的广谱性。

表1.B30在添加50mg/L不同染料的TSB培养基中培养7天的脱色效果(温度：25℃，pH：6.0，NaCl浓度：4％

6、B30对皮革废水的生物修复，对B30在实际生产皮革废水中六价铬和染料的去除能力进行分析。从皮革厂获取废水样品呈深褐色，对水质进行鉴定发现，其化学需氧量(COD)为4500mg/L，总溶解固体(TDS)为68g/L，NH₄-N为100 mg/L，Cr(VI)为204mg/L，pH＝7.4。废水样品用滤纸过滤后，pH值调到6.0。然后100mL废水加入到100mL过夜培养的B30培养液中。废水中加入同样体积未接种培养液作为对照组。实验组和对照组在25℃下170rpm培养7天，每过24小时取样分析。结果如图7显示，在第四天废水脱色率达到67％，接下来三天的培养中脱色率没有进一步提高。对照组在培养7天后脱色率为3.2％。对废水中六价铬浓度分析结果显示，处理7天后实验组Cr(VI)去除率为63％，而对照组去除率为 5.3％，说明废水中已有的微生物对B30的六价铬去除和脱色没有显著影响。

7、染料、Cr(VI)和皮革废水对卤虫的急性毒性效应，微生物降解偶氮染料会生成毒性更高的芳香胺类降解产物。芳香胺类化合物在好氧环境下能进一步降解为毒性和显色性更低的产物。为分析B30生物修复的安全性，以对有毒物质高敏感型的卤虫对染料和Cr(VI)废水在处理前后的急性毒性进行比较。一期卤虫在人工海水(34g/L)中孵化后与B30处理前和处理后的染料(100mg/L)、Cr(VI) (100mg/L)和废水样品共孵育，未接种B30的培养基为阴性对照。孵育24小时候后统计卤虫的死亡率。由于Cr(VI)和废水样品毒性过高会导致卤虫100％的死亡率，因此对这两种样品的急毒性检测需要将样品分别稀释10倍和4倍进行。结果如表2所示，B30处理过的样品的毒性均显著低于未处理样品，进一步说明了该菌株在试剂废水处理中应用的可行性。

表2卤虫暴露在染料、Cr(VI)和皮革废水中24小时后的死亡率

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 闽江学院

<120> 具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> 抗辐射不动杆菌B30 (Acinetobacter radioresistens B30)

<400> 1

caaaggtggc ggcgggctac catgcagtcg agcggatgaa gtagcttgct actggattca 60

gcggcggacg ggtgagtaat gcttaggaat ctgcctatta gtgggggaca acgttccgaa 120

aggagcgcta ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc 180

taatagatga gcctaagtcg gattagctag ttggtagggt aaaggcctac caaggcgacg 240

atctgtagcg ggtctgagag gatgatccgc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggggg aaccctgatc cagccatgcc 360

gcgtgtgtga agaaggcctt ttggttgtaa agcactttaa gcgaggagga ggctacctag 420

attaatactt taggatagtg gacgttactc gcagaataag caccggctaa ctctgtgcca 480

gcagccgcgg taatacagag ggtgcgagcg ttaatcggat ttactgggcg taaagcgtgc 540

gtaggcggcc aattaagtca aatgtgaaat ccccgagctt aacttgggaa ttgcattcga 600

tactggttgg ctagagtatg ggagaggatg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatctg gaggaatacc gatggcgaag gcagccatct ggcctaatac tgacgctgag 720

gtacgaaagc atggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat 780

gtctactagc cgttggggcc cttgaggctt tagtggcgca gctaacgcga taagtagacc 840

gcctggggag tacggtcgca agactaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc 900

ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacataca 960

gagaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaactct gatacaggtg ctgcatggct 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttttcc 1080

ttatttgcca gcacttcggg tgggaacttt aaggatactg ccagtgacaa actggaggaa 1140

ggcggggacg acgtcaagtc atcatggccc ttacggccag ggctacacac gtgctacaat 1200

ggtcggtaca aagggttgct acacagcgat gtgatgctaa tctcaaaaag ccgatcgtag 1260

tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320

gaatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt 1380

ttgttgcacc agaagtaggt agtctaaccg caaggaggac gctaccacgg tgcccgaggt 1440

tc 1442

Claims (10)

1.一种具有六价铬去除和脱色的不动杆菌，其特征在于，所述具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的保藏编号为CGMCC No.20073。

2.一种如权利要求1所述具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法，其特征在于，所述具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法包括：

第一步，取深海沉积物样品加入到添加有Cr(VI)和酸性黑ATT的灭菌液体2216E培养基中，振荡进行富集培养；

第二步，菌液接种到同样的培养基中以同样的条件培养进行第二轮富集，稀释；

第三步，不同稀释度菌液分别涂布在含同样浓度Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，恒温培养箱中培养；

第四步，观察记录不同单菌落特征，挑取不同形态的单菌落进行划线纯化，即可得到具Cr(Ⅵ)和偶氮染料耐受性的纯菌株。

3.如权利要求2所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法，其特征在于，所述第一步取深海沉积物样品1g加入到100mL添加有50mg/L Cr(VI)和50mg/L酸性黑ATT的灭菌液体2216E培养基中，以170rpm、30℃振荡3天进行富集培养。

4.如权利要求2所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法，其特征在于，所述第二步6mL菌液接种到同样的培养基中以同样的条件培养进行第二轮富集，以10倍梯度稀释。

5.如权利要求2所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法，其特征在于，所述第三步不同稀释度菌液分别吸取0.2mL涂布在含同样浓度Cr(VI)和染料的固体2216E培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24h。

6.如权利要求2所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌的分离纯化方法，其特征在于，所述深海沉积物样品由电视抓斗采样器采集，样品采集后立刻转移到4℃保存。

7.一种皮革废水处理方法，其特征在于，所述皮革废水处理方法使用权利要求1所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

8.一种重金属的高盐度废水生物修复方法，其特征在于，所述重金属的高盐度废水生物修复方法使用权利要求1所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

9.一种染料污染的高盐度废水生物修复方法，其特征在于，所述染料污染的高盐度废水生物修复方法使用权利要求1所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

10.一种城镇污水处理方法，其特征在于，所述城镇污水处理方法使用权利要求1所述的具有六价铬去除和脱色的不动杆菌。

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