CN103756925A - 一株鲍曼不动杆菌及其筛选方法和在降解偶氮染料刚果红方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株鲍曼不动杆菌及其筛选方法和在降解偶氮染料刚果红方面的应用。所述菌株命名为鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）YNWH226，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7922。本发明提供了一株新的鲍曼不动杆菌并将其应用于染料降解，该菌株尤其可对偶氮染料刚果红进行有效降解，对刚果红废水具有很好的脱色、矿化效果，实现了简单的好氧条件下就可以将刚果红彻底矿化，对染料污染的治理及好氧降解偶氮染料的研究具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程、环境工程技术领域。更具体地，涉及一株鲍曼不动杆菌及其筛选方法和在降解偶氮染料刚果红方面的应用。
背景技术
偶氮染料是一类含有1个或多个-N=N-功能团的芳香类化合物，约占有机染料产品总量的80%。根据染料发色团说，其发色基是偶氮双键(-N =N-)，助色基是氨基、羟基、甲基和磺酸基等，当光线射入后发生选择性吸收而产生视觉所感受到的各种颜色。刚果红是第一个人工合成的偶氮染料，从它的结构式上可以看出，刚果红是含有两个偶氮双键的活性染料，其水溶性好，但染色的过程中有大量的染料未附着在染色物上而以废水形式排出，造成水体污染。
目前发现能降解偶氮染料的微生物主要有真菌、细菌和藻类三种。但研究与工程应用的大量实践表明，染料废水的特殊性导致一般微生物无法或很难在这类废水中生长繁殖和发挥降解作用。同时，目前发现的偶氮染料降解菌一般为厌氧降解菌，而国内外学者的实验研究结果表明：厌氧微生物通过还原作用对染料废水具有一定的脱色、降解效果，但处理出水中含有大量高毒性、强致癌性的中间产物，如芳香胺化合物等。而对于单一的好氧降解，目前报道的很少，同时从已报道的文献可知，它们所产生的偶氮还原酶在结构上差异较大。
同时目前尚无利用鲍曼不动杆菌降解染料的文献报道。
发明内容
本发明的目的是填补现有染料降解微生物技术的空白，提供一株偶氮染料好氧降解菌。
本发明的另一个目的是提供所述偶氮染料刚果红好氧降解菌的筛选方法。
本发明还有一个目的是提供所述偶氮染料刚果红好氧降解菌的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明提供一株偶氮染料好氧降解菌，命名为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）YNWH 226，于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7922。
所述鲍曼不动杆菌YNWH 226鉴定特征如下：
细菌学形态特征为球杆状，无芽孢、无鞭毛，单个细胞大小为（1~1.5μm）×（1.5~2.5μm），菌落光滑，不透明，在含刚果红的无机盐培养基上呈红色；
生理生化特性为：革兰氏阴性，西蒙氏柠檬酸盐利用阳性，明胶液化阴性，葡萄糖利用阳性。能在以刚果红为唯一碳源和能源，且好氧条件下生长。
本发明还提供了鲍曼不动杆菌YNWH 226的16S rRNA基因序列，如SEQ ID NO.1所示。该序列与鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）DSM 30007的16S rRNA基因序列高度同源，同源性为99%。
本发明同时提供该鲍曼不动杆菌YNWH 226的筛选方法，包括如下步骤：
S1.取印染废水处理厂好氧池的废水置于LB培养基中培养得到初培养液；
S2.取S1所述的初培养液置于含1g/L刚果红的无机盐培养基中培养得培养液；
S3.取S2所述的培养液置于含1g/L刚果红的新鲜无机盐培养基中培养得终培养液；
S4.取S3所述的终培养液稀释后均匀涂布于含1g/L刚果红的固体无机盐培养基平板上培养；
S5.从S4所述固体无机盐培养基平板上挑取菌落分离纯化即得单菌落。
所述的LB培养基配方为：
S2、S3所述的所述的无机盐培养基配方为：1.6g/L的K2HPO4，0.2g/L的KH2PO4 ()，1.0g/L 的(NH4)2SO4，0.01g/L 的FeSO4·7H2O ，0.1g/L的NaCl ，0.02g/L的CaCl2·6H2O ，0.1g/L的MgSO4，pH7.0。
S4所述的固体无机盐培养基平板的组成配方为S3所述的所述的无机盐培养基加入16~20g/L的琼脂。
本发明还提供了所述偶氮染料好氧降解菌在降解偶氮染料刚果红方面的应用。
优选地，所述偶氮染料好氧降解菌应用于含偶氮染料刚果红废水脱色、净化处理方面。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株新的鲍曼不动杆菌YNWH 226，所述菌株可以很好地填补现有技术偶氮染料降解生物技术的不足，是一株具有较高活力，对染料脱色能力极强的菌株。
本发明提供的鲍曼不动杆菌YNWH 226可以在23~37℃、pH5~9、好氧条件下，利用偶氮染料刚果红作为唯一的碳源和能源生长繁殖，降解偶氮染料刚果红，而且是以去除苯环脱毒的方式对其进行降解，在纯培养的条件下，2天内能将无机盐培养基中100mg/L刚果红几乎完全脱色，且在宽pH和温度范围均能较好地降解染料，并且将降解后续产生的芳香胺类化合物矿化，TOC(总有机碳)去除率为93.72%，能够进一步彻底减少污染。同时对于500mg/L的刚果红也有很好的耐受和去除效果。
本发明所述菌株的筛选培养方法简单，生长速度快，不易变异，可应用于作为研究鲍曼不动杆菌对染料脱色的模式菌株，更重要的是，它真正实现了能在单一简单的好氧条件下实现彻底矿化染料，大大简化了染料脱色工艺，并丰富了染料脱色机制。
附图说明
图1 本发明的鲍曼不动杆菌 YNWH 226对不同浓度刚果红的降解情况图。
图2 本发明的鲍曼不动杆菌 YNWH 226在不同条件下对刚果红的降解情况图。
图3 鲍曼不动杆菌系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，除非特别说明，本发明实施例采用的试剂为常规市购试剂，采用的设备和试验方法为本技术领域常规的设备和试验方法。
实施例1 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）YNWH 226的筛选
S1.取10mL东莞市某印染废水处理厂好氧池的废水于100mL的LB培养基中，在30℃，150rpm条件下培养16h，得到初培养液；
S2.取出10mL的S1所述的初培养液于100mL含1g/L刚果红的无机盐培养基中，在30℃，150rpm条件下培养两天，得培养液；
S3.再取出10mL的S2所述的培养液于含1g/L刚果红的新鲜无机盐培养基中，30℃，150rpm下培养两天，S63重复3次，得终培养液；
S4.取10mL的S3所述的终培养液进行适当稀释，然后均匀涂布于含1g/L刚果红的固体无机盐培养基平板上，30℃培养；
S5.从S4所述平板上挑取长势最好的菌落，进行分离纯化，最终得到的单菌落。后续进行经菌体形态学、生理生化及16S rRNA鉴定分析。
该菌株最适生存条件为pH值7~9，生长温度为23~37℃。
所述鲍曼不动杆菌YNWH 226鉴定特征如下：
细菌学形态特征为球杆状，无芽孢、无鞭毛，单个细胞大小为（1~1.5μm）×（1.5~2.5μm），菌落光滑，不透明，在含刚果红的无机盐培养基上呈红色；
生理生化特性为：革兰氏阴性，西蒙氏柠檬酸盐利用阳性，明胶液化阴性，葡萄糖利用阳性。能在以刚果红为唯一碳源和能源，且好氧条件下生长。
本发明所述鲍曼不动杆菌YNWH 226的16S rRNA基因序列，如SEQ ID NO.1所示。该序列与鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）DSM 30007的16S rRNA基因序列高度同源，同源性为99%。见附图3所示鲍曼不动杆菌系统发育树。
实施例2 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）YNWH 226在降解刚果红中的应用
1．将菌株YNWH 226在LB培养基中培养16小时（对数生长后期），取5mL接种至含偶氮染料刚果红浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L的200mL无机盐培养基中，30℃，150rpm，pH7.0下培养5天。期间每隔24h取5mL培养液于700g离心力作用下离心2min，取上清液。
2．将步骤1得到的上清液采用紫外可见分光光度计（普析 TU-1901）在490nm处测定吸光度，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料的降解率。
结果如附图1所示：菌株YNWH 226对100mg/L刚果红的降解率为90.37%，浓度为200~400mg/L刚果红的去除率也能到达70%~80%，对于浓度为500mg/L的刚果红去除率达到了63.16%。
同时，若在37℃，180rpm，pH7.0的条件下，2天内能完全脱色，TOC去除率为93.72%。
实施例3鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）YNWH 226在降解刚果红中的应用
将菌株YNWH 226在LB培养基中培养16小时（对数生长后期），取10mL冰浴30min，在4℃，4000rpm的条件下离心5分钟，弃去上清液，菌体用无菌水冲洗两次，再分别接种到含偶氮染料刚果红浓度为0.1g/L的200mL无机盐培养基中，分别按表1条件培养5天。期间每隔12h取5mL培养液于700g离心力作用下离心2min，取上清液。得到的上清液采用紫外可见分光光度计（普析 TU-1901）在490nm处测定吸光度，并以不加菌及染料的培养液为对照，计算染料的降解率。结果如图2所示。5天后的统计结果见表1：
表1
本发明提供的鲍曼不动杆菌YNWH 226可以在宽pH和温度范围、好氧条件下，利用偶氮染料刚果红作为唯一的碳源和能源生长繁殖，对刚果红的降解率达到99.1%，并且将降解后续产生的芳香胺类化合物矿化，TOC(总有机碳)去除率为93.72%，能够进一步彻底减少污染。具有很好的推广应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东工业大学
<120> 一株鲍曼不动杆菌及其筛选方法和在降解偶氮染料刚果红方面的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> 鲍曼不动杆菌的16S rRNA基因序列
<400> 1
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Claims (9)
1.一株偶氮染料刚果红好氧降解菌，为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）YNWH 226，于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7922。
2.根据权利要求1所述偶氮染料刚果红好氧降解菌，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种根据权利要求1所述偶氮染料刚果红好氧降解菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.取印染废水处理厂好氧池的废水置于LB培养基中培养得到初培养液；
S2.取S1所述的初培养液置于含1g/L刚果红的无机盐培养基中培养得培养液；
S3.取S2所述的培养液置于含1g/L刚果红的新鲜无机盐培养基中培养得终培养液；
S4.取S3所述的终培养液稀释后均匀涂布于含1g/L刚果红的固体无机盐培养基平板上培养；
S5.从S4所述固体无机盐培养基平板上挑取菌落分离纯化即得单菌落。
4.根据权利要求3所述筛选方法，其特征在于，所述的无机盐培养基配方为：1.6g/L的K2HPO4，0.2g/L的KH2PO4 ()，1.0g/L 的(NH4)2SO4，0.01g/L 的FeSO4·7H2O ，0.1g/L的NaCl ，0.02g/L的CaCl2·6H2O ，0.1g/L的MgSO4，pH7.0。
5.权利要求1所述偶氮染料刚果红好氧降解菌在降解偶氮染料刚果红方面的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述偶氮染料好氧降解菌应用于含偶氮染料刚果红废水脱色、净化处理方面。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，应用条件为温度23℃~37℃、pH值5~9、好氧条件。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述的温度为30℃~37℃，pH值为7~9。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述的温度为37℃，pH值为7。
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