CN106754566B - 一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株kl1及其应用 - Google Patents

一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株kl1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1及其应用，其16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。本发明涉及的菌株KL1能对多种偶氮染料进行高效的脱色，24h脱色率达到90％以上，而且其营养要求简单，培养适应条件较广，培养温度在30～40℃，pH在4.0～9.0均能高效发挥脱色作用，可应用于偶氮类印染废水及污染土壤的处理，具有成本低廉，使用方便，去除效果好等优点，市场化前景良好。

Description

一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1及其 应用
技术领域
本发明属于印染废水处理领域，特别涉及一种对偶氮染料高效脱色的肺炎克雷伯氏菌株KL1及其应用。
背景技术
染料广泛应用于纺织、皮革、塑料、化妆品和食品等行业。全世界每年有7×105t合成染料生产，并且有5％～10％随印染废水排放。而偶氮染料是在纺织工业中应用最多的，约占70％。每年有超过3000种偶氮染料用于各行业。偶氮染料中有一个或多个偶氮键(—N＝＝N—)以及磺酸基团，使得染料分子具有毒性，耐高温，在酸性和碱性条件下非常稳定，很难天然降解，从而被认为是持久性有机污染物。染料进入天然水体中，不仅破坏美观，而且减少阳光透入，从而抑制水生植物光合作用，而其降解产物通常含有芳香胺，芳香胺对生物体具有致癌、致畸、致突变的作用，可通过食物链进入人类体内。
目前，常用的处理偶氮染料的方法有絮凝法、吸附法、臭氧氧化法、光催化氧化法、膜过滤法和电化学氧化法等。然而，它们各自均有局限性，比如高昂的成本、产生具有风险的副产品和大量的能耗需要。而微生物处理技术以其低成本、环保、产生微量污泥等特点，成为越来越重要的印染废水处理技术。偶氮染料微生物处理过程，通常先厌氧还原染料分子为芳香胺，接着用好氧工艺彻底矿化芳香胺。厌氧代谢能够打开偶氮键，使染料分子还原为无色的芳香胺，降低色度。
应用于微生物法处理偶氮染料印染废水的菌株已有一些报道，比如刘秀艳等人分离得到一种对金橙Ⅱ有脱色性能的氧化微杆菌L-11；余志晟等人分离到一种对较多种偶氮染料具有脱色效果的酵母菌株YP-1；宁寻安等人筛选到的一种对刚果红染料有降解效果的鲍曼不动杆菌。但他们筛选得到的菌株有的需要复杂的培养基，有的对偶氮染料脱色需要的时间过长，还有对处理环境有较为苛刻的要求。此外，目前有关肺炎克雷伯氏菌的专利主要涉及白蚁防治、工业有机酚类污水以及石油污染的处理，未见涉及偶氮染料污水的脱色处理。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1及其应用，该菌株KL1能对多种偶氮染料进行高效的脱色，24h脱色率达到90％以上，而且其营养要求简单，培养适应条件较广，培养温度在30～40℃，pH在4.0～9.0均能高效发挥脱色作用。
本发明首先提供了一种能对偶氮染料进行广谱高效脱色的功能菌株，并具有良好的应用前景。
本发明的一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1，其16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明中的肺炎克雷伯氏菌株KL1，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.13552,保藏日期为2017年01月09日，建议分类命名为：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。
所述肺炎克雷伯氏菌株KL1的培养条件为：在温度为30～40℃(优选37℃)，pH为4.0～9.0的条件下，在培养基中恒温静置培养。
所述肺炎克雷伯氏菌株KL1主要生物学特性为：圆形菌落，边缘圆润，表面光滑且微隆起，较为粘稠，乳白色，液体培养为浅黄色，培养最适温度为35～40℃，pH5.0～6.0；为革兰氏阴性菌，形状为短粗的杆菌，大小为0.4～0.6×1.5～2.5μm。普通琼脂平板上生长的菌落呈乳白色，较粘稠，表面光滑，呈圆形，边缘圆润，中部微隆起。
所述培养基为液体培养基或固体培养基；其中，液体培养基的组成为：磷酸二氢钾2.66g，氯化铵0.2g，无水硫酸钠0.5g，酵母提取物3g，其余为蒸馏水1L；固体培养基为：磷酸二氢钾2.66g，氯化铵0.2g，无水硫酸钠0.5g，酵母提取物3g，琼脂粉10～15g，蒸馏水1L；所述培养基均需经过121℃，100kPa灭菌20分钟。
本发明还提供了一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1的应用，所述肺炎克雷伯氏菌株KL1应用于偶氮染料高效脱色；其中，具体方法如下：在液体培养基中于30～40℃，pH为4.0～9.0的条件下恒温静置培养24～48h后，接入到含有偶氮染料的相同液体培养基中，然后于上述同样条件下恒温静置培养24～48h，即可。
所述接入时的接种量为1％～10％(V/V)；优选10％或1％。
所述培养基中偶氮染料的浓度为100～1000mg/L。
所述偶氮染料为刚果红、丽春红S、橙黄Ⅱ、酸性橙7、活性黑5、酸性黑1或直接黑38等。
本发明所提供的肺炎克雷伯氏菌株KL1能适应广泛的pH，可在pH为4.0～9.0对偶氮染料进行高效脱色。本发明首次利用肺炎克雷伯氏菌对偶氮染料进行脱色处理，填补了国内这方面的技术空白，为处理印染废水脱色问题提供有力的技术基础。
有益效果
(1)本发明首次利用肺炎克雷伯氏菌对偶氮染料(广谱高效脱色)进行脱色处理，脱色率达到90％以上，填补了国内这方面的技术空白，为处理印染废水脱色问题提供有力的技术基础。
(2)本发明的菌株KL1能对多种偶氮染料进行高效的脱色，24h脱色率达到90％以上，而且其营养要求简单，培养适应条件较广，培养温度在30～40℃，pH在4.0～9.0均能高效发挥脱色作用。
(3)本发明可应用于偶氮类印染废水及污染土壤的处理，具有成本低廉，使用方便，去除效果好等优点，市场化前景良好。
附图说明
图1为实施例1中Klebsiella pneumoniae KL1的平板菌落图；
图2为实施例1中Klebsiella pneumoniae KL1的革兰氏染色显微镜下观察图；
图3为实施例2和实施例3中Klebsiella pneumoniae KL1的生长曲线及对活性黑5的脱色曲线；
图4为实施例4中Klebsiella pneumoniae KL1对活性黑5脱色前后溶液的紫外可见全波长光谱图；
图5为实施例5中Klebsiella pneumoniae KL1对七种偶氮染料脱色前后对比图；
图6为实施例1中Klebsiella pneumoniae KL1的扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
肺炎克雷伯氏菌株(Klebsiella pneumoniae)KL1的菌落观察。
取10uL生长对数期的肺炎克雷伯氏菌株KL1的菌液，用无菌水稀释106后，取100uL稀释液滴加到平板培养基表面，用灭菌的涂布器涂抹均匀，于37℃，pH为5.6的条件下，恒温静置培养1～3天后，观察菌落生长情况，结果如图1所示。
上述平板培养基成分：磷酸二氢钾2.66g/L，氯化铵0.2g/L，无水硫酸钠0.5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂粉15g/L，蒸馏水1L。
肺炎克雷伯氏菌株KL1的生物学特性为圆形菌落，边缘圆润，表面光滑且微隆起，较为粘稠，乳白色。经革兰氏染色法鉴定为革兰氏阴性菌，结果如图2所示。
肺炎克雷伯氏菌株KL1在扫描电子显微镜下观察，其形状为短粗的杆菌，大小为0.4～0.6×1.5～2.5μm，如图6所示。
实施例2
肺炎克雷伯氏菌株(Klebsiella pneumoniae)KL1的富集培养。
用接种环条取肺炎克雷伯氏菌株(Klebsiella pneumoniae)KL1接到装有100mL液体培养基的锥形瓶(250mL)中，于37℃恒温静置培养24h后，即获得大量无污染的肺炎克雷伯氏菌株KL1。
上述培养基成分为：磷酸二氢钾2.66g/L，氯化铵0.2g/L，无水硫酸钠0.5g/L，酵母提取物3g/L，蒸馏水1L。
上述培养基及锥形瓶等器皿均在121℃，100kPa下灭菌20分钟。
实施例3
肺炎克雷伯氏菌株KL1的生长曲线测定。
将恒温静置培养了24h的肺炎克雷伯氏菌株KL1(实施例2中的条件培养得到)的菌液以1％(V/V)接种于新鲜灭菌的培养基中，每隔一定时间取少量菌液在紫外可见分光光度计上测定其OD600的光密度值，作为菌含量的表征值，测定100h后，按照测定时刻与对应的OD600的值绘制生长曲线，结果如图3所示。可以从图中观察到肺炎克雷伯氏菌株KL1的生长特性，0～2h时KL1处在延滞期，2～30h时处在对数期，30h～100h时一直处于稳定期。本发明提供的肺炎克雷伯氏菌株KL1的延滞期较短，有利于缩短扩大种群的时间，而较长的稳定期可以使其更持久地发挥对偶氮染料脱色的功能。
实施例4
脱色率的计算公式为：
式中，A0为初始时刻染料溶液的特征峰值，Ai为测定时刻染料溶液的特征峰值。
将恒温静置培养了24h的肺炎克雷伯氏菌株KL1(实施例2中的条件培养得到)的菌液以1％(V/V)接种于含500mg/L活性黑5的新灭培养基中，在紫外可见分光光度计上测定初始时刻染料溶液对应的特征峰值作为A0之后，每隔一定时间取少量菌液测定溶液的特征峰值为Ai，计算每个时刻对应的脱色率，最后以测定的时间作为横坐标，对应测定的脱色率值作为纵坐标，绘制脱色曲线。结果如图3所示，脱色作用从肺炎克雷伯氏菌株KL1一加入即开始，并且在30h时刻，500mg/L的活性黑5的脱色率达到了90％以上，最终稳定在98％左右，验证了该菌株对偶氮染料的高效脱色性能。活性黑5脱色前后的紫外可见全波长光谱扫描如图4所示，可以看出偶氮染料不仅发生脱色，而且出现了新的紫外可见峰，说明染料分子同时也被菌株KL1降解。
实施例5
肺炎克雷伯氏菌株KL1对7种偶氮染料的脱色能力测试。
将恒温静置培养了24h的肺炎克雷伯氏菌株KL1(实施例2中的条件培养得到)的菌液以1％(V/V)分别接种于加了7种同浓度不同种类的偶氮染料(刚果红、丽春红S、橙黄Ⅱ、酸性橙7、活性黑5、酸性黑1、直接黑38)的新灭培养基中，用紫外可见分光光度计测定溶液初始特征峰值，间隔一段时间测定一次各溶液的特征峰值，计算各组的脱色率(如表1所示)，并以拍照的方式记录脱色现象，如图5所示。从图中可以看出，本发明提供的肺炎克雷伯氏菌株KL1具有对多种不同颜色和结构的偶氮染料进行脱色的能力，并且脱色之后溶液颜色状态改观明显。
表1克雷伯氏菌株KL1对7种偶氮染料脱色实验
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
<120> 一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggccatggc tctttgttac gacttcaccc cagtcatgaa tcacaaagtg gtaagcgccc 60
tcccgaaggt taagctacct acttcttttg caacccactc ccatggtgtg acgggcggtg 120
tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgta gcattctgat ctacgattac tagcgattcc 180
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gacttaaccc aacatttcac aacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtctcacag 480
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cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 600
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ggccgccttc gccaccggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct acacctggaa 840
ttctaccccc ctctacaaga ctctagcctg ccagtttcga atgcagttcc caggttgagc 900
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ttctgcgggt aacgtcaatc gacaaggtta ttaaccttat cgccttcctc cccgctgaaa 1080
gtgctttaca acccgaaggc cttcttcaca cacgcggcat ggctgcatca ggcttgcgcc 1140
cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tggaccgtgt ctcagttcca 1200
gtgtggctgg tcatcctctc agaccagcta gggatcgtcg cctaggtgag ccgttacccc 1260
acctactagc taatcccatc tgggcacatc tgatggcatg aggcccgaag gtcccccact 1320
ttggtcttgc gacattatgc ggtattagct accgtttcca gtagttatcc ccctccatca 1380
ggcagtttcc cagacattac tcacccgtcc gccgctcgtc acccgagagc aagctctctg 1440
tgctaccgct cgacttgcat gtttaggcct gccgcattgc cg 1482

Claims (5)

1.一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株(Klebsiella pneumoniae)KL1，其特征在于，其16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示，保藏编号CGMCC No.13552。
2.一种如权利要求1所述的广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1的应用，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌株KL1应用于偶氮染料高效脱色；其中，具体方法如下：在液体培养基中于30～40℃，pH为4.0～9.0的条件下恒温静置培养24～48h后，接入到含有偶氮染料的相同液体培养基中，然后于上述同样条件下恒温静置培养24～48h，即可。
3.根据权利要求2所述的一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1的应用，其特征在于，所述接入时的接种量为1％～10％。
4.根据权利要求2所述的一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1的应用，其特征在于，所述培养基中偶氮染料的浓度为100～1000mg/L。
5.根据权利要求2所述的一种广谱高效脱色偶氮染料的肺炎克雷伯氏菌株KL1的应用，其特征在于，所述偶氮染料为刚果红、丽春红S、橙黄Ⅱ、酸性橙7、活性黑5、酸性黑1或直接黑38。
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