CN113293123B - 5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用 - Google Patents

5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了‑氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用，具体步骤包括在凯氏拟小球藻的生长过程中，每隔5～8天向培养基中添加一次5‑氨基乙酰丙酸，且5‑氨基乙酰丙酸可以替换为5‑氨基乙酰丙酸衍生物，实现延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间、在促进凯氏拟小球藻单位生物量增长、以及促进凯氏拟小球藻光合色素的积累。

Description

5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用
技术领域
本发明属于凯氏拟小球藻培养技术领域，具体涉及到5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用。
背景技术
凯氏拟小球藻为绿藻门中的一种，生长速度快，可大量培养而不占用耕地，目前广泛应用在废水处理、生物能源和生物固碳等领域。然而凯氏拟小球藻相对于细菌等微生物而言，其培养周期较长，生长相对缓慢，成为实际生产环节中影响时间和金钱成本的重要制约因素之一，如何有效改进凯氏拟小球藻的培养方式，提高藻体光合生长的效率，缩短其培养周期，具有重要的现实意义和应用前景。
传统的凯氏拟小球藻培养往往是通过改善光照条件、培养温度、调节培养液中pH值与营养盐成分等对藻类生长条件进行优化，然而通过改进培养条件在一定程度上虽然可提高凯氏拟小球藻生长速度，但通常凯氏拟小球藻的生长速度仍然不理想。在传统优化培养条件的基础上，若能利用生物因子促进凯氏拟小球藻生长，将是一种具有重要意义的创新方法。
5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物体内合成四氢吡咯类化合物(如叶绿素、血红素和维生素B12等)的共同前体。在农业上，ALA低浓度使用可以显著提高作物产量，而高浓度可以用作安全无污染的除草剂和杀虫剂。ALA主要是应用于促进植物生长，但是目前并没有ALA在凯氏拟小球藻生长中应用的研究。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供了5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用，通过在凯氏拟小球藻的生长过程中，添加5-氨基乙酰丙酸，实现延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间、促进单位生物量增长和促进光合色素的积累。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用，具体步骤包括在凯氏拟小球藻的生长过程中，每隔5～8天向培养基中添加一次5-氨基乙酰丙酸。
进一步地，所述5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用，包括在延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间的应用、在促进凯氏拟小球藻单位生物量增长的应用、以及促进凯氏拟小球藻光合色素的积累的应用。
进一步地，所述延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间为提前凯氏拟小球藻进入对数期的时间，且延后凯氏拟小球藻进入稳定期的时间。
进一步地，所述5-氨基乙酰丙酸的浓度为10mg/L～30mg/L。
进一步地，所述凯氏拟小球藻的生长过程，包括以下步骤：将凯氏拟小球藻细胞按照10％的体积分数接种到装有1000ml f/2培养基的玻璃柱中，充气培养，培养温度为20～30℃，培养光照强度为1000～5000lux。
进一步地，所述5-氨基乙酰丙酸替换为5-氨基乙酰丙酸衍生物。
进一步地，所述5-氨基乙酰丙酸衍生物包括5-氨基乙酰丙酸盐酸盐。
采用上述技术方案，本发明实现的有益效果如下：
(1)在凯氏拟小球藻的生长过程中添加5-氨基乙酰丙酸及其衍生物，明显延长了凯氏拟小球藻的对数期生长时间、促进凯氏拟小球藻单位生物量增长、以及促进凯氏拟小球藻中光合色素如叶绿素和类胡萝卜素的积累，凯氏拟小球藻藻类生物量积累可以提高100％以上，光合色素积累可以提高30％以上。
(2)操作简单，省时省力，原料易得。
附图说明
图1为本发明的凯氏拟小球藻藻液的图片。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。
1.f/2培养基的配置
f/2培养基(每升)的组分和用量如表1所示。
表1f/2培养基(每升)配方
Figure BDA0003163733510000021
将表1中各成分分别溶解好之后再混合，定容至1L，高温高压灭菌得到f/2培养基。
2.凯氏拟小球藻单位生物量的测量
采用干重法测量凯氏拟小球藻的单位生物量，具体步骤如下：吸取凯氏拟小球藻的藻液10mL置于离心管中，3000r/min离心10min得到藻泥，所得藻泥用超纯水进行清洗后继续进行离心，3000r/min离心10min，重复两次，得到的藻泥转移到滤膜上，将滤膜和藻泥置于烘箱中，108℃干燥6h得到藻粉，然后通过分析天平称量干燥后藻粉的质量，计算干燥后藻粉的质量与干燥前藻泥的质量比，重复三次，取平均值即为凯氏拟小球藻的单位生物量。
采用细胞计数法测量凯氏拟小球藻的单位生物量，具体步骤如下：采用血球计数板对凯氏拟小球藻的藻液进行细胞计数，重复三次，取平均值即得到凯氏拟小球藻的单位生物量。
3.凯氏拟小球藻光合色素含量的测量
采用甲醇法测量凯氏拟小球藻光合色素含量，具体步骤如下：
(1)实验用具的处理：镊子和研钵用酒精清洗，再用蒸馏水冲洗干净，晾干；
(2)称量：将凯氏拟小球藻的藻泥样品置于-78度冰箱中进行低温冷冻，用镊子夹取藻泥放于称量纸上称量，得到藻泥的重量；
(3)研磨：将称量后的藻泥迅速移到研钵中，用移液器取4ml甲醇加入研钵中，进行充分研磨，然后将清液移至离心管中；再向研钵中加2ml甲醇，进行研磨，使用2ml甲醇冲洗研钵并回收清液，最后使用2ml甲醇冲洗研钵四周和研锤并回收清液，将清液置于离心管中；研钵和离心管均置于冰上，研钵进行冰浴研磨。
(4)黑暗处理：将离心管用锡箔纸全部包裹起来，放到试管架上，置于4度冰箱中，黑暗处理1h；在黑暗处理30min后，打开离心机预冷，打开紫外分光光度计预热；
(5)离心：将黑暗处理1h后的离心管置于离心机进行离心，转速为5000rpm，温度为4度，时间为10min，然后将离心管置于4度冰箱中；
(6)润洗：用自来水冲洗定容管，然后加2ml蒸馏水旋转冲洗2次，再加3ml甲醇润洗定容管2次；加入1ml蒸馏水清洗比色皿2次，然后加入1ml甲醇润洗比色皿2次；
(7)定容：将步骤(5)离心后的离心管从冰箱中取出，放到冰盘试管架上，将清液缓慢倒于定容管中，加甲醇至定容线10ml，180度旋转颠倒混匀后，静置于试管架上，得到检测样品；
(8)测量：取步骤(7)的检测样品加入步骤(6)润洗后的比色皿中，参比液采用甲醇；分别测量检测样品在560nm处的吸光值。
实施例1
将凯氏拟小球藻细胞按照10％的体积分数接种到装有1000ml f/2培养基的玻璃柱中，向f/2培养基中加入10mg的5-氨基乙酰丙酸，然后进行充气培养，在25℃，3000lux的恒温光照培养箱中进行培养，培养至16天后；培养过程中，每5d向f/2培养基中添加10mg的5-氨基乙酰丙酸，每48h采收凯氏拟小球藻的藻液，分别利用干重法测量凯氏拟小球藻的单位生物量，利用细胞计数法测量凯氏拟小球藻的单位生物量，利用甲醇法测量凯氏拟小球藻的藻液在560nm处的吸光值。
实施例2
与实施例1的区别在于向f/2培养基中加入30mg的5-氨基乙酰丙酸，其余步骤相同。
实施例3
与实施例的区别在于向f/2培养基中加入30mg的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐；在20℃，5000lux的恒温光照培养箱中进行培养，其余步骤相同。
对照组I
与实施例1的区别在于f/2培养基中不添加5-氨基乙酰丙酸。
对照组II
与实施例3的区别在于f/2培养基中不添加5-氨基乙酰丙酸盐酸盐。
实施例1、实施例2和对照组I中利用甲醇法测量凯氏拟小球藻的藻液在560nm处的吸光值的结果如表2所示。
表2 560nm波长下5-氨基乙酰丙酸各实验组吸光值数据
Figure BDA0003163733510000051
从表2数据可以看出，同一天测量的吸光度数值，实施例1(5-氨基乙酰丙酸的浓度为10mg/L)和实施例2(5-氨基乙酰丙酸的浓度为30mg/L)显著高于对照组I，且实施例2的吸光值显著高于实施例1。在培养至第16天时，对照组I的吸光值为1.18ml/(g·cm)，实施例1的吸光值为1.59ml/(g·cm)，实施例2的吸光值为1.83ml/(g·cm)，可知实施例2比对照组I的吸光值提高了55％，实施例1比对照组I的吸光值提高了34％。吸光值越高，说明藻液中光合色素的含量越高，说明凯氏拟小球藻中光合色素的积累越多，从而说明5-氨基乙酰丙酸可以促进凯氏拟小球藻中光合色素的积累。
图1中显示凯氏拟小球藻培养至第16天时藻液的图片，其中中间试管为对照组I，左侧试管为实施例1，右侧试管为实施例2。从图1可以看出，实施例1和实施例2中绿色比对照组I显著加深，说明实施例1和实施例2中光合色素含量显著增多，从而说明实施例1和实施例2显著促进凯氏拟小球藻中光合色素的积累。
实施例1-2和对照组I中在凯氏拟小球藻培养至第6天时，利用干重法测量的凯氏拟小球藻的单位生物量结果如表3所示。
表3干重法测量的实施例1-2和对照组I凯氏拟小球藻的单位生物量数据
组别 对照组I 实施例1 实施例2
单位生物量 0.04mg/g 0.05mg/g 0.08mg/g
从表3结果可以在凯氏拟小球藻培养至第6天时，实施例2中凯氏拟小球藻的单位生物量比对照组I提高了100％，实施例1中凯氏拟小球藻的单位生物量比对照组I提高了25％，说明添加5-氨基乙酰丙酸可以促进凯氏拟小球藻单位生物量增长。
实施例3和对照组II中在凯氏拟小球藻培养至第6天和第12天时，利用干重法测量的凯氏拟小球藻的单位生物量结果如表4所示。
表4干重法测量的实施例3和对照组II凯氏拟小球藻的单位生物量数据
培养天数 对照组II 实施例3
6 0.18mg/g 0.18mg/g
12 0.06mg/g 0.27mg/g
从表4结果可以看出，在培养第6天时，添加30mg/L的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐对于凯氏拟小球藻的单位生物量的作用效果不显著。在培养第12天时，实施例3中凯氏拟小球藻的单位生物量显著高于对照组II，说明5-氨基乙酰丙酸盐酸盐显著促进凯氏拟小球藻单位生物量增长。此外，对照组II中培养第12天的凯氏拟小球藻单位生物量比第6天时下降，而实施例3中培养第12天的凯氏拟小球藻单位生物量比第6天时上升，说明添加5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，可以延长凯氏拟小球藻的对数期，从而使得其单位生物量维持上升趋势。
实施例1、实施例2和对照组I中利用细胞计数法测量凯氏拟小球藻的单位生物量，结果如表5所示。
表5细胞计数法测量的凯氏拟小球藻的单位生物量数据
Figure BDA0003163733510000061
从表5数据中可以看出，对照组I的凯氏拟小球藻在培养第6天时，单位生物量为5658×104个/ml；实施例1的凯氏拟小球藻在培养4天时，单位生物量为4142×104个/ml，培养第6天时，单位生物量为9189×104个/ml；实施例2的凯氏拟小球藻在培养第4天时，单位生物量为5895×104个/ml，说明当凯氏拟小球藻的单位生物量达到5658×104个/ml左右时，对照组I需要培养6天，实施例1需要培养5天左右，实施例2需要培养4天左右，即实施例1和实施例2比对照组I提前两天达到单位生物量为5658×104个/ml左右，说明与对照组I相比，实施例1和实施例2将凯氏拟小球藻的对数期时间提前了1～2天。
从对照组I的凯氏拟小球藻的单位生物量数据可以看出，在培养第10天，凯氏拟小球藻的单位生物量到达最大生物量7965×104个/ml，即对照组I的凯氏拟小球藻在培养第10天进入生长稳定期。实施例1中在培养第12天，凯氏拟小球藻的单位生物量到达最大生物量11418×104个/ml；实施例2在培养第14天，凯氏拟小球藻的单位生物量到达最大生物量13825×104个/ml；说明实施例1和实施例2进入生长稳定期的时间分别为第12天和第14天，从而说明，与对照组I相比，实施例1和实施例2将凯氏拟小球藻进入稳定期的时间延后2～4天。
综上所述，与对照组I相比，实施例1和实施例2将凯氏拟小球藻的对数期时间提前1～2天，进入稳定期的时间延后2～4天，从而实现延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间。
此外，从表中数据可以看出，与对照组I相比，实施例1和实施例2中凯氏拟小球藻的单位生物量显著增加，且衰退速度显著减缓，说明实施例1和实施例2可以促进凯氏拟小球藻单位生物量增长。

Claims (2)

1.5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用，其特征在于：在延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间的应用；所述延长凯氏拟小球藻的对数期生长时间为提前凯氏拟小球藻进入对数期的时间，且延后凯氏拟小球藻进入稳定期的时间；具体步骤包括在凯氏拟小球藻的生长过程中，每隔5～8天向培养基中添加一次5-氨基乙酰丙酸，所述5-氨基乙酰丙酸的浓度为10mg/L～30mg/L；
所述凯氏拟小球藻的生长过程，包括以下步骤：将凯氏拟小球藻细胞按照10％的体积分数接种到装有1000ml f/2培养基的玻璃柱中，充气培养，培养温度为20～30℃，培养光照强度为1000～5000lux。
2.根据权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸在促进凯氏拟小球藻生长中的应用，其特征在于：所述5-氨基乙酰丙酸替换为5-氨基乙酰丙酸衍生物，所述5-氨基乙酰丙酸衍生物是5-氨基乙酰丙酸盐酸盐。
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