CN112056198A - 一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、cod去除效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，包括如下步骤：将紫萍叶状体接种到添加有机碳源的1/2 MS液体培养基中，保证液体培养基表面100%被紫萍覆盖，并置于25±3℃、光周期为12L：12D‑16L：8D和光强为5000‑50000 lux的环境中培养14‑20天。本发明采用混合营养模式培养紫萍，不仅可以显著提高紫萍的淀粉和蛋白质产量，而且还能显著提高紫萍对氮、磷和COD的去除效率；将紫萍大规模混合营养培养与污水处理相结合，能够解决环境污染问题的同时，收获高附加值的紫萍生物量，实现污水处理的资源化利用，不占用耕地，不需要额外的营养元素投入，可以取得良好的经济效益和环境效益。

Description

一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法。
背景技术
浮萍亚科植物(Lemnaceae)是一类以漂浮为主的水生被子植物，其主要有浮萍属(Lemna)、芜萍属(Wolffia)和紫萍属(Spirodela)。浮萍科不同属植物的形状特征、生长繁殖能力以及氮、磷吸收能力等都有所差异。紫萍(Spirodela polyrrhiza)是浮萍亚科(Lemnaceae)紫萍属(Spirodela)的水生漂浮植物，遍布世界各地。紫萍具有非常独特的生命周期，会随季节更替有形态的变化，在春夏两季，叶状体吸收二氧化碳和光能进行光合作用，进行快速的营养繁殖；当天气变冷或缺乏营养时，叶状体生成休眠体，休眠体富含淀粉，液泡变小同时细胞间空气成分减少，导致密度变大，沉到水底，使休眠体能够安全的度过严寒的冬天，等到条件适宜的时候再进行营养繁殖，进入下一个生命周期。紫萍不仅繁殖速度快、可四季生产，而且是非常优质的生物质能源基质-繁殖速率快、淀粉含量高、木质纤维素含量低，但是现有的培养方法主要关注浮萍的自养，该营养模式下，紫萍生长速率较慢，紫萍淀粉和蛋白质产量较低，且对氮、磷、COD去除效率也较低。
因此，基于目前养殖废水、工业废水和农业废水等废水中大多富含高浓度的氮磷和有机质，有必要设计一种能够显著提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，以解决上述问题。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，不仅可以显著提高紫萍的淀粉和蛋白质生物量，而且还可以显著提高紫萍对氮、磷和COD的去除效率。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，该方法的步骤如下：将紫萍叶状体接种到添加有有机碳源的1/2 MS液体培养基中，保证液体培养基表面100%被紫萍覆盖，并置于25±3℃、光周期为12L：12D -16L：8D和光强为5000-50000 lux的环境中培养14-20天。
进一步地，所述有机碳源为葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖中的任意一种。
进一步地，1/2 MS液体培养基中，有机碳源的浓度为0.5-2%。
优化地，将接种有紫萍的1/2 MS液体培养基置于25±1℃、光周期为16L：8D 和光强为50000 lux的环境中培养14天。
进一步地，1/2 MS液体培养基的pH值为5-7。
进一步地，所述1/2 MS液体培养基包括如下组分：166.10mg/L CaCl2、90.35mg/LMgSO4、6.20mg/L H3BO3、0.025mg/L CoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、36.70mg/LFeNaEDTA、16.90mg/L MnSO4·H2O 、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O 、0.83mg/L KI 、8.60mg/LZnSO4·7H2O。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明采用混合营养模式培养紫萍，不仅可以显著提高紫萍的淀粉和蛋白质生物量，而且还可以显著提高紫萍对氮、磷和COD的去除效率；
（2）将紫萍大规模混合营养培养与污水处理相结合，不仅可以解决环境污染问题，还可以收获高附加值的紫萍生物量，实现污水处理的资源化利用，不占用耕地，不需要额外的营养元素投入，产生良好的经济效益和环境效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为不同营养条件下紫萍对不同有机碳源的利用效率：a 异养条件下，b混合营养条件下；
图2为不同营养条件下紫萍的生长曲线；
图3为不同营养条件下紫萍淀粉和蛋白质含量变化：a 淀粉含量，b 蛋白质含量；
图4为不同营养条件下紫萍对氮和磷的去除效果：a 总磷（TP），b 总氮（TN），c 氨氮（NH3-N）；
图5为不同营养条件下紫萍对有机物的去除效率：a 葡萄糖，b COD。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，该方法的步骤如下：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加10 g/L葡萄糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5.8；接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；并将玻璃烧杯置于25±1℃、光周期为16L：8D 和光强为50000 lux的温室里培养14-20天。
实施例2
本实施例提供一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，该方法的步骤如下：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加5 g/L果糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5；接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；并将玻璃烧杯置于22-25℃、光周期为14L：10D 和光强为10000lux的温室里培养14-20天。
实施例3
本实施例提供一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，该方法的步骤如下：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加20 g/L蔗糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为7；接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；并将玻璃烧杯置于25-28℃、光周期为12L：12D 和光强为5000lux的温室里培养14-20天。
实验
以下实验中选用的紫萍为本地紫萍（Spirodela polyrhiza（L.）Schleid（5543）），采自湖北省武汉市东湖（N 30°32'，E 114°21'）；将无菌紫萍培养在装有600 mL 10 g/L葡萄糖的1/2 MS培养基的2L玻璃烧杯中，pH 5.8，并将玻璃烧杯置于25±1 ℃，光周期为16L：8D和光强为5000 lux的温室里，培养两周作为以下自养、异养和混合营养条件下的接种种质资源。初始总氮（TN）和初始总磷（TP）浓度分别为440.04mg/L和20.82 mg/L；初始COD浓度为10680.20 mg/L。
1/2 MS液体培养基包括如下组分：166.10mg/L CaCl2、90.35mg/L MgSO4、6.20mg/LH3BO3、0.025mg/L CoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、36.70mg/L FeNaEDTA、16.90mg/LMnSO4·H2O、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、0.83mg/L KI、8.60mg/L ZnSO4·7H2O。
1、有机碳源的筛选
1.1 实验方法
本实验选取葡萄糖（Glucose）、果糖（Fructose）、阿拉伯糖（Arabinose）、半乳糖（Galactose）、麦芽糖（Maltose）、蔗糖（Sucrose）、乳糖（Lactose）、甘油（Glycerol）和乙酸盐（Acetate）这九种普遍的有机碳源，用于筛选鉴定紫萍是否可以代谢上述九种有机碳源进行异养和混合营养生长，异养和混合营养生长的具体方法如下：
混合营养：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加10 g/L葡萄糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5.8；每个烧杯接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；并将玻璃烧杯置于25±1℃、光周期为16L：8D 和光强为5000 lux的温室里培养14天，并设置不加有机碳源的空白对照；
异养：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加10 g/L葡萄糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5.8；每个烧杯接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；将玻璃烧杯用铝箔包裹，并置于25±1 ℃的完全黑暗条件下培养14天，并设置不加有机碳源的空白对照；
每个实验重复三次。培养结束后，测定紫萍叶状体鲜重。
1.2 实验结果
实验结果如图1所示，葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖和蔗糖可以分别在黑暗条件和光下不同程度地促进紫萍的异养生长和混合营养生长；而且，葡萄糖是紫萍异养生长和混合营养生长最合适的有机碳源。同时，结果显示紫萍对麦芽糖利用效率最低。此外，从图1中还可以看出，紫萍不能代谢乳糖、阿拉伯糖、乙酸盐和甘油作为有机碳源来维持其异养生长和混合营养生长。
2、不同营养条件对紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的影响
2.1 实验方法
本实验分别测定自养、异养和混合营养条件下，紫萍的生物量积累及其对氮、磷、COD去除效率，自养、异养和混合营养生长的具体方法如下：
混合营养（Mixotrophy）：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加10 g/L葡萄糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5.8；每个烧杯接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；并将玻璃烧杯置于25±1℃、光周期为16L：8D 和光强为5000 lux的温室里培养；
异养（Heterotrophy）：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，添加10 g/L葡萄糖作为有机碳底物，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5.8；每个烧杯接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；将玻璃烧杯用铝箔包裹，并置于25±1 ℃的完全黑暗的温室里培养；
自养（Photoautotrophy）：在2 L玻璃烧杯中，加入已灭菌600 mL 1/2 MS液体培养基，控制1/2 MS液体培养基的pH值为5.8；每个烧杯接种5 g新鲜紫萍叶状体，保证液体培养基表面100%被紫萍叶状体覆盖；并将玻璃烧杯置于25±1℃、光周期为16L：8D 和光强为5000lux的温室里培养；
整个试验周期为25天，每个实验进行3次生物学重复。以整个烧杯作为样品，每3-6天取样一次，分析紫萍的鲜重和干重，淀粉和蛋白质含量以及对应的培养液中总氮、总磷、葡萄糖浓度、化学需氧量（COD）的浓度水平。
2.1.1 生长速率测定
测定紫萍的鲜重（FW）的方法如下：将收获的紫萍叶状体放在吸水纸静止5分钟，把水分吸干，然后用电子天平称量鲜重；
测定紫萍的干重（DW）的方法如下：将上述紫萍叶状体放在在60 ℃烘箱中干燥直至重量恒定，测得干重；
生长速率计算如下：生长速率＝增加的叶状体重量/（面积·时间）（g/m2·d）。
2.1.2 淀粉含量测定
准确称取0.03 g 烘干并且用研钵研磨均匀的紫萍叶状体粉末置于离心管中，加入2.6mL的1.2 M HCl溶液混合，在沸水浴中煮沸2个小时；然后，用NaOH或HCl溶液将pH调节至7.0，然后加入醋酸铅溶液沉淀提取液中的蛋白质，最后用去离子水将溶液稀释至最终体积10 mL；随后，将提取液用C18过滤柱，最后，利用HPLC分析滤液，以标准葡萄糖溶液做标准曲线，计算淀粉含量（淀粉含量＝葡萄糖含量×0.999）。
2.1.3 蛋白质含量测定
取4 ℃保存的研钵置于冰上，称取新鲜紫萍叶状体0.3 g放入研钵，用移液枪准确量取2.7 mL PBS溶液加入研钵，迅速均匀研磨紫萍叶状体。之后，将研磨液转移到离心管中，在4000 rpm，4 ℃下离心10分钟，收集上清液为蛋白提取液。然后使用总蛋白定量分析试剂盒（考马斯亮蓝法）分析上清液，以测定紫萍的蛋白质含量。
2.1.4 水质分析
每次取水样之后，用0.45 µm纤维素膜过滤样品，分析TP、TN、COD和葡萄糖浓度。 TP（GB/ T 11893-1989），TN（GB / T 11894-1989），COD（GB / T 11914-1989） 分析采用《水和废水监测和分析的标准方法》（SEPAC，2002）。使用Bioprofile 300全自动生化分析仪（NovaBiomedical）测定样品中的葡萄糖浓度。
2.1.4.1 总氮（TN）测定方法：
材料与仪器：①紫外分光光度计。②压力蒸汽消毒器或民用压力锅，压力1.1-1.3 kg/cm2，相应温度为120-124 ℃。③25 mL具塞玻璃磨口比色管。④25 mL 铁制试管架。
化学试剂：（1）超纯水（UP水）。（2）碱性过硫酸钾溶液：称取40 g过硫酸钾（K2S2O8）（注：用优耐德公司生产的分析纯过硫酸钾，不要选用其它厂家），15 g氢氧化钠，溶于超纯水中，稀释至1000 mL（注：配制体积根据实际所需按比例减少或增加）。溶液存放在聚乙烯瓶内，可贮存1~2周。（3）（1+9）盐酸：按照浓盐酸和超纯水体积比1：9进行配制，将浓盐酸倒入超纯水中（酸入水）。（4）硝酸钾标准溶液：① 标准贮备液(100 mg/L)：称取0.7218 g（使用万分之一天平）经105-110 ℃烘干4 h的优级纯硝酸钾（KNO3）溶于超纯水中，移至1000mL容量瓶中，定容。此溶液每毫升含100 μg硝酸盐氮。加入2 mL三氯甲烷为保护剂，至少可稳定6个月。② 硝酸钾标准使用液：将贮备液用超纯水稀释10倍而得。此溶液每毫升含10 μg硝酸盐氮。
标线绘制：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
编号比色管并置于25 mL铁制试管架。分别吸取0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、8.00 mL硝酸钾标准使用液于25 mL比色管中，用超纯水稀释至10 mL标线；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
加入5 mL碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞，用纱布及纱绳裹紧管塞，以防迸溅出；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将比色管置于压力锅中，升温至120-124 ℃开始计时，使比色管在过热水蒸气中加热30~40 min；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
自然冷却，开阀放气，移去外盖，取出比色管并冷却至室温；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
加入（1+9）盐酸1 mL，用超纯水稀释至25 mL标线；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
在紫外分光光度计上，以超纯水作参比，用10 mm石英比色皿分别在220 nm及275nm波长处测定吸光度。用校正的吸光度制作标准曲线。
分析步骤：
一般取10 mL水样，水质较差的样品可进行适当稀释，如富营养化水体可取5 mL，生活污水1~2 mL。按校准曲线绘制步骤
Figure 499050DEST_PATH_IMAGE002
至
Figure 416191DEST_PATH_IMAGE006
操作。然后校正吸光度，在校准曲线上查出相应的总氮量，再用下列公示计算总氮含量：总氮（mg/L）=
Figure DEST_PATH_IMAGE007
式中，m-从标准曲线上查得的总氮量(μg)；v-所取水样体积（mL）。
2.1.4.2 氨氮（NH3-N）测定方法
材料与仪器：①分光光度计；②50 mL具塞玻璃磨口比色管；③50 mL 试管架；④抽滤装置一套。
样本预处理：水样带色或浑浊以及含其他一些干扰物质，影响氨氮的测定。故要采用0.45 μm滤膜过滤水样，取滤液进行后续测定。
化学试剂：（1）超纯水。（2）纳氏试剂（碘化汞-碘化钾-氢氧化钠(HgI2-KI-NaOH)溶液）。称取16.0 g氢氧化钠（NaOH），溶于50 mL 水中，充分冷却至室温（自然冷却）；称取7.0g碘化钾（KI）和10.0 g碘化汞（HgI2），溶于水中，然后将此溶液在搅拌下，缓慢加入到上述50mL氢氧化钠溶液中（注：是将KI+HgI2混合溶液倒入NaOH溶液），用水稀释至100 mL，贮于聚乙烯瓶密塞保存。（3）酒石酸钾钠溶液，ρ=500 g/L。称取50.0 g酒石酸钾钠（KNaC4H6O6·4H2O）溶于100 mL水中，加热煮沸以驱除氨，充分冷却后稀释至100mL，建议保存于棕色瓶中。（4）铵标准贮备溶液，ρN =1000 μg/mL。 称取3.8190 g 氯化铵（注：NH4Cl，优级纯，在100-105 ℃干燥2 h；使用万分之一天平），溶于水中，移入1000 mL容量瓶中，稀释至标线，可在2-5 ℃保存1个月。（5）铵标准使用溶液，ρN =10 μg/mL吸取5.00 mL氨氮标准贮备溶液于 500 mL容量瓶中，稀释至刻度。临用前配制。
标线绘制：
Figure 71294DEST_PATH_IMAGE001
在7个50 mL比色管中，分别加入 0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00和 10.00 mL铵标准使用溶液，加水至标线；
Figure 341870DEST_PATH_IMAGE002
加入 1.0 mL酒石酸钾钠溶液，摇匀，再加入纳氏试剂 1.5 mL，摇匀；
Figure 156242DEST_PATH_IMAGE003
放置 10 min 后，在波长420 nm下，用10 mm比色皿（玻璃比色皿或石英比色皿），以超纯水作参比，测量吸光度；
Figure 854071DEST_PATH_IMAGE004
以空白校正后的吸光度为纵坐标，以其对应的氨氮含量（µg）为横坐标，绘制校准曲线。
注：根据待测样品的质量浓度也可选用10 mm比色皿。
分析步骤：
过滤后样品，取50 mL（注：如浓度过高应适当减少取样体积，添加超纯水稀释至50mL），按与校准曲线相同的步骤测量吸光度。有悬浮物或色度干扰的水样：取经0.45 μm过滤后的水样50 mL（若水质较差，可适当稀释），按与校准曲线相同的步骤测量吸光度。
注：经蒸馏或在酸性条件下煮沸方法预处理的水样，须加一定量氢氧化钠溶液，调节水样至中性，用水代替水样，稀释至50 mL标线，再按标线绘制步骤②~④进行处理和测定。用下列公示计算水中氨氮的质量浓度：氨氮（N，mg/L）=
Figure DEST_PATH_IMAGE008
·1000 式中，m-从校准曲线查得的氨氮量（mg）；v-水样体积(mL)。
2.1.4.3 总磷（TP）测定方法：
材料与仪器：
Figure 121104DEST_PATH_IMAGE001
紫外分光光度计。
Figure 195370DEST_PATH_IMAGE002
压力蒸汽消毒器或民用压力锅，压力为1.1-1.3kg/cm2，相应温度为120-124 ℃。
Figure 864249DEST_PATH_IMAGE003
50 mL具塞玻璃磨口比色管。④50 mL 铁制试管架。
化学试剂：（1）超纯水（UP水）。（2）（1+1）硫酸：按照硫酸和超纯水体积比1：1配制，将浓硫酸倒入超纯水中（酸入水）。（3）10%抗坏血酸溶液：溶解10 g抗坏血酸于水中，并稀释至100 mL（注：依据实际所需体积配制）。该溶液贮存在棕色玻璃瓶中，在约4 ℃可稳定几周。如颜色变黄，则弃去重配。（4）钼酸盐溶液：溶解13 g钼酸铵（NH4)6Mo7O24·4H2O）于100mL水中。溶解0.35 g酒石酸锑氧钾（K(SbO)C4H4O6·1/2H2O）于100 mL水中。在不断搅拌下，将钼酸铵溶液徐徐加到300 mL （1+1）硫酸中，加酒石酸锑氧钾溶液并且混合均匀。贮存在棕色的玻璃瓶中于约4 ℃保存。至少可保存两个月。（5）浊度-色度补偿液：混合两份体积的（1+1）硫酸和一份体积的10%抗坏血酸溶液。此溶液当天配制。（6）磷酸盐贮备液：将优级纯磷酸二氢钾（KH2PO4）于110 ℃干燥2 h，在干燥器中放冷。称取0.2197 g溶于水，移入1000mL容量瓶中。加（1+1）硫酸5 mL，用水稀释至标线。（7）磷酸盐标准溶液：吸取10.00 mL磷酸盐贮备液与250 mL容量瓶中，用水稀释至标线。此溶液每毫升含2.00 μg磷。临用时现配。此溶液每毫升含50.0 μg磷。
标线绘制：
Figure 732979DEST_PATH_IMAGE001
取数支50 mL比色管，编号置于50 mL 铁制试管架上。分别加入磷酸盐标准使用液0、0.50、1.00、3.00、5.00、10.00、15.00 ml，加水至50 mL。②显色：向比色管中加入1 mL10%抗坏血酸溶液，混匀。30 s后加2 mL钼酸盐溶液充分混匀，放置15 min后显色。
Figure 487308DEST_PATH_IMAGE003
测量：用10 mm比色皿（玻璃比色皿或石英比色皿），于700 nm波长处，以超纯水为参比，测量吸光度。
Figure 99686DEST_PATH_IMAGE004
以空白校正后的吸光度为纵坐标，以其对应的总磷含量（µg）为横坐标，绘制校准曲线。
分析步骤：
先将50 mL比色管按顺序放置在特制铁架上，吸取25 mL混合水样（注：如浓度过高应适当减少取样体积，添加超纯水稀释至25 mL，使含磷量不超过30 μg）于50 mL比色管中，加过硫酸钾溶液4 mL，加塞混匀后，用纱布及纱绳裹紧管塞，以防迸溅出。将比色管置于压力锅中，升温至120-124 ℃开始计时，使比色管在过热水蒸气中加热30~40 min。自然冷却，开阀放气，移去外盖，取出比色管并冷却至室温。以下按绘制校准曲线的步骤②-③进行显色和测量。减去空白试验的吸光度，并从校准曲线上查出含磷量。用下列公示计算总磷含量：磷酸盐（P，mg/L） =
Figure DEST_PATH_IMAGE009
式中，m-从校准曲线查得的总磷量（μg）；V-水样体积（mL）。
2.1.4.4 COD测定方法：
材料与仪器：
Figure 623072DEST_PATH_IMAGE001
250 mL锥形瓶。
Figure 928282DEST_PATH_IMAGE002
水浴锅。③ 酸式滴定管，50 mL。④ 滴定用的固定架。
注：新的玻璃器皿必须用酸性高锰酸钾溶液清洗干净。
化学试剂：（1）超纯水（UP水）。（2）硫酸：密度为1.84 g/mL。（3）硫酸（1+3）溶液：体积比，在不断搅拌下，将100 mL硫酸慢慢加入到300 mL水中。趁热加入数滴高锰酸钾溶液直至溶液出现粉红色。（4）氢氧化钠，500 g/L溶液：称取50 g氢氧化钠溶于水并稀释至100 mL（注：配制体积根据实际所需按比例减少或增加）。（5）草酸钠标准贮备液，浓度C为0.1000mol/L：称取0.6705 g经120 ℃烘干2 h并放冷的草酸钠溶解水中，移入100 mL容量瓶中，用水稀释至标线，混匀，置4 ℃保存。（6）草酸钠标准溶液，浓度C1为0.0100 mol/L：吸取10.00mL草酸钠贮备液于100 mL容量瓶中，用水稀释至标线，混匀。（7）高锰酸钾标准贮备液，浓度C2约为0.1 mol/L：称取3.2 g高锰酸钾溶解于水并稀释至1000 mL。于90~95 ℃水浴中加热此溶液两小时，冷却。存放两天后，倾出清液，贮于棕色瓶中。（8）高锰酸钾标准溶液，浓度C3约为0.01 mol/L：吸取100 mL高锰酸钾标准贮备液于1000 mL容量瓶中，用水稀释至标线，混匀。此溶液在暗处可保存几个月，使用当天标定其浓度。
分析步骤：
（1）吸取100.0 mL经充分摇动、混合均匀的样品（或取适量，用水稀释至100 mL），置于250 mL锥形瓶中，加入5±0.5 mL硫酸（1+3溶液），用滴定管加入10.00 mL高锰酸钾溶液，摇匀。将锥形瓶置于沸水浴锅内加热30±2 min（水浴沸腾，开始计时）。
（2）取出后用滴定管加入10.00 mL草酸钠溶液至溶液变为无色。趁热（80 ℃以上）用高锰酸钾溶液滴定至刚出现粉红色，并保持30 s不退。记录消耗的高锰酸钾溶液体积。
（3）空白试验：用100 mL去离子水代替样品，按步骤（1）、（2）测定，记录下回滴的高锰酸钾溶液体积。
（4）向空白试验滴定后的溶液中加入10.00 mL草酸钠溶液。如果需要，将溶液加热至80 ℃。用高锰酸钾溶液继续滴定至刚出现粉红色，并保持30 s不退。记录下消耗的高锰酸钾溶液体积。
注：
Figure 169908DEST_PATH_IMAGE001
沸水浴的水面要高于，形瓶内的液面。
Figure 320397DEST_PATH_IMAGE002
样品量以加热氧化后残留的高锰酸钾为其加入量的1/2~1/3为宜。加热时，如溶液红色退去，说明高锰酸钾量不够，须重新取样，经稀释后测定。
Figure 963868DEST_PATH_IMAGE003
滴定时温度如低于60 ℃，反应速度缓慢，因此应加热至80 ℃左右。
Figure 299035DEST_PATH_IMAGE004
沸水浴温度为98 ℃。如在高原地区，报出数据时，需注明水的沸点。
2.2 实验结果
2.2.1 不同营养条件对紫萍生长速率与生物量积累的影响
如图2所示，紫萍生长曲线随代谢模式的不同而变化。在三种营养条件下，紫萍都能够快速适应培养环境，没有表现出明显的延滞生长。培养25天后，混合营养条件下紫萍鲜重达到55.49 g，异养条件下为15.13 g，光合自养条件下为13.12 g。就鲜重而言，紫萍在混合营养条件下的生长速率为152.28 g/m2·day，在异养条件下的生长速率为30.56 g/m2·day，在光合自养条件下的生长速率为24.49 g/m2·day，即混合营养条件下紫萍的生长速率分别是异养和光养自养条件下的4.98和6.22倍。
从图2中可以看出，在实验的末期，混合营养条件下紫萍的生长速度下降到了一个相对较低的水平，这有是由于有机碳源的耗尽与生物质的积累导致紫萍密度升高，从而阻止光穿过限制了紫萍的生长，尤其是下层的叶状体。此外，过度拥挤本身会抑制紫萍的生长。在第10天到第14天之间，异养生长速率超过光合自养生长速率，这种现象是由于在光合自养条件下，紫萍的生长受到光的限制引起的。
不同营养模式下，紫萍叶状体内淀粉含量和蛋白质含量随培养时间的变化如图3所示，紫萍的最大生物量、淀粉和蛋白质产量如表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
从表1和图3a可以看出，混合营养条件下紫萍的淀粉产量最高，但淀粉含量低于异养条件下紫萍淀粉含量。
从表1和图3b可以看出，紫萍在三种培养条件下表现出相似的蛋白质含量变化趋势，在最初4天的培养中，蛋白质含量逐渐升高，达到最高值，在随后的21天中，逐渐下降；本实验中，紫萍叶状体中蛋白质的初始含量的15.64 mg/g FW。培养25天后，在混合营养、异养和光养营养条件下，蛋白质含量分别降低了44.15%，49.60%和32.01%。
综合以上数据可得，在混合营养条件下，紫萍的淀粉和蛋白质生物量最大，因此，混合营养模式是生产淀粉和蛋白质的理想模式。
2.2.3 不同营养条件下紫萍对总氮、氨氮与总磷的去除效率
如图4和表2所示，混养条件下，紫萍对总氮（TN）的去除率分别是异养条件和光合自养条件下的1.91倍和5.15倍，相应的去除效率为86.39%，45.20%和16.78%。混合营养紫萍对总氮（TN）和总磷（TP）的去除率分别为86.39%和98.94%，这也是三种不同营养条件下，最优的去除率。同时从图4可以看出，当混合培养基中的TP几乎被耗尽时（第10天），紫萍对TN的去除率降低到相对较低的水平（第10天），但生长速率仍然保持不变（第10天，图2）。这主要是由于新生的子代紫萍叶状体从母代叶状体中转移了氮磷用来维持自身的生长，因为氮磷在植物中是一种可循环利用的元素。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
2.2.4 不同营养条件下紫萍对有机物的去除效率
图5和表2反映了不同营养模式下，葡萄糖和COD浓度随时间的变化和去除速率。混合营养和异养条件下，在最初的4天培养中，葡萄糖浓度均缓慢下降，从第4天开始下降速度加快；培养20天后，混合培养基中葡萄糖浓度降至0.20 g/L，而在异养条件下为5.53 g/L；培养25天后，混合营养条件下的紫萍完全耗尽了培养基中的葡萄糖。混合营养条件下紫萍对葡萄糖的去除率是异养条件下葡萄糖去除率的1.75倍（表2），去除效率分别100%和57.29%。
本实验中，混合营养和异养培养基中的初始COD浓度为10680.20 mg/L。与异养生长条件下相比，在混合营养模式下紫萍对COD的吸收速率更快（图5b，表2）。如图5b所示，在混合营养生长的最初4天中，COD缓慢下降，然后在随后的10天的培养中迅速下降；但是，在剩余的11天中，COD趋于稳定并达到相对较低的水平。而在异养模式下，除在最初的4天培养中，COD浓度缓慢下降外，整个实验过程中的COD吸收率保持相对恒定（图5b）。混合营养模式下的COD吸收速率是异养模式下的1.54倍，相应的COD去除效率分别为84.88%和55.03%。由于光合自养生长条件下的紫萍不利用有机碳，因此COD没有显着变化。
混合营养条件下，大部分COD在最初的14天培养中被去除，这与对葡萄糖的消耗速率相符（图5）。从图5可以看出，在混合营养条件下，紫萍可以充分利用葡萄糖而不是COD，这是由于紫萍在生长过程中分泌了额外的有机物到培养基中且很难被紫萍降解，另外紫萍叶状体的死亡和分解也导致COD的去除不完全。
综合以上数据可得，与异养和光合自养培养模式相比，在混合营养条件下，显著提高了紫萍对氮、磷和COD的去除效率，因此，混合营养模式可以作为废水处理的理想营养模式。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，其特征在于：将紫萍叶状体接种到添加有机碳源的1/2 MS液体培养基中，保证液体培养基表面100%被紫萍覆盖，并置于25±3℃、光周期为12L：12D -16L：8D和光强为5000-50000 lux的环境中培养14-20天。
2.如权利要求1所述的一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，其特征在于：所述有机碳源为葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖中的任意一种。
3.如权利要求1所述的一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，其特征在于：1/2 MS液体培养基中，有机碳源的浓度为0.5-2%。
4.如权利要求1所述的一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，其特征在于：将接种有紫萍的1/2 MS液体培养基置于25±1℃、光周期为16L：8D 和光强为50000lux的环境中培养14天。
5.如权利要求1所述的一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，其特征在于：1/2 MS液体培养基的pH值为5-7。
6.如权利要求1所述的一种提高紫萍生物量积累和对氮、磷、COD去除效率的方法，其特征在于，所述1/2 MS液体培养基包括如下组分：166.10mg/L CaCl2、90.35mg/L MgSO4、6.20mg/L H3BO3、0.025mg/L CoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、36.70mg/L FeNaEDTA、16.90mg/L MnSO4·H2O 、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O 、0.83mg/L KI 、8.60mg/L ZnSO4·7H2O。
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