CN102250773B - 一株栅藻及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株栅藻藻株，命名为MRA-2，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4653。MRA-2藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前的大多数藻株，本发明也公开了MRA-2的培养方法及其应用领域，其应用领域包括CO₂的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产。

Description

一株栅藻及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及利用生物的方法，处理人类活动产生的生产、生活废水，或含高浓度二氧化碳的废气，并且将由此生产的生物质用于进一步的资源开发，包括能源、食品、保健品、肥料、饲料等产品。本发明属于环境处理和生物或能源产品开发领域。

背景技术

当前人类社会面临两大难题：气候变暖和环境恶化。气候变暖的一大诱因是工业革命以来由于化石能源的消耗造成的大气中CO₂含量的上升。工业生产部门的CO₂集中排放是大气中新增CO₂的主要来源，热电厂、工业与建筑业、交通行业排放成为主要的CO₂来源。工厂高COD污水的排放，农业肥料的使用和畜牧业粪便处理的不当，使我国工农业发达地区水体的污染和富营养化日益严重。

微藻也称单细胞藻类，种类约占全球已知藻类的70％。微藻具有资源丰富、光合效率高、生长速度快、适应性强的特点，20世纪50年代，Oswald和Gotaas最早提出利用微藻处理污水的想法。自20世纪80年代以来，生物技术的飞速发展，使藻类大规模培养技术逐步完善。国内外对进一步发挥藻类净化污水的潜力进行了大量研究，使藻类净化污水的机理研究取得了很大进展。

微藻光合作用过程中，它们以光能为能源，利用简单的无机物合成有机物，同时消耗、同化污水中大量的氮、磷等营养物质，使水源得到净化。微藻对氮磷等营养物质的主要去除途径一般包括吸收和吸附。微藻利用水中溶解的CO₂、HCO₃ ^-和CO₃ ^2-作为碳源进行光合作用的同时，使废水的pH升高，从而导致氨态氮的挥发和正磷酸盐的沉淀，这也是氮磷等营养物质去除的一条途径。微藻消化吸收无机氮磷转化成生物量的能力可以有效的进行氮磷化合物解毒。同时，由于微藻能有效地进行光合作用，将光能、H₂O、CO₂和无机盐(如NH₄ ⁺)转化为体内有机化合物，产生大量氧气，提高溶氧水平，使水体pH值升高；在细菌的作用下使H₂S变成无毒的硫酸盐，从而达到净化污水和保持良好水坏境的目的。

微藻生物质有许多潜在的应用价值，因为藻类富含油脂、蛋白质、色素、维生素和矿物质。其主要的潜能有：用于食料和医药业(人和动物的营养补充物：维生素、蛋白质、脂肪酸、多糖等)；提取化工产品如化妆品、精细化工产品等；作为能源产生沼气、燃料；用于饵料和饲料业(鱼虾、甲壳动物等水产动物的饵料，家禽饲料)；农业上作为土壤调节剂、肥料等。

近年来随着能源问题的日益突出，寻找合适的可再生能源成为研究领域的热点。微藻能源具备多个优势，成为备受关注的一个焦点。首先，微藻的生长迅速，且不占用耕地，可以在滩涂、盐碱地等边际土地上养殖；其次，微藻生长可吸收CO₂作为碳源，可缓解全球温室效应；再次，若以污水中的有机物和离子作为微藻生长的营养，收获微藻的同时可以净化污水。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是提供一株栅藻藻株，并利用工农业废弃物或人工培养基培养该栅藻获得生物质，从中可开发多种产品，或应用于废水净化。

技术方案

为实现上述技术问题的解决，本发明采用如下技术方案：

在一个方面中，本发明提供一株栅藻(Scenedesmus sp.)，命名为MRA-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其特征在于其基因组包含核酸序列18S rDNA(SEQ ID NO：1，图3)和ITS(SEQID NO：2，图4)或者它们的互补序列；根据序列比对，本发明的MRA-2藻株与已公布的藻株的18S rDNA数据存在差异。

本发明的栅藻藻株Scenedesmus sp.MRA-2已经于2011年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.4653。

在一个方面中，本发明提供一种培养物，包含所述的MRA-2藻株及其培养基；所述的培养基，其特征在于采用各类无机盐，或者采用工业、养殖业等产生的含有机质的废水，或者利用工业加工的各种糖类配置。

在另一个方面中，本发明提供一种培养第一方面的藻株的培养方法，所述培养方法采用各类无机盐，或者采用工业、养殖业等产生的含有机质的废水，或者利用工业加工的各种糖类配置。在一个实施方案中，栅藻的培养方式，其特征在于培养温度为15-37℃，可接受50-2000μmol photonsm^-2s^-1以上的灯光或太阳光光照(优选200-600μmol photons m^-2s^-1)，向培养物中通入含0.03-30％(v/v)CO₂的气体或空气；其中所述的CO₂的来源包含工厂产生的废气或者空气，在通入气体中CO₂的含量不超过30％(v/v)；

本发明还提供MRA-2藻株用于废水的净化的应用；在一个实施方案中，所述废水为含硝酸盐的废水。在另一个实施方案中，所述废水为含氨氮的废水。在一个实施方案中，所述废水中硝酸盐的浓度为：1.76mM、4.41mM、17.6mM。在一个实施方案中，高氨氮废水中氮浓度为39.4mg/L

本发明还提供MRA-2藻株用于生产油脂、脂肪酸、蛋白质、淀粉、色素、多糖和/或核酸的应用；MRA-2的生产应用，其领域包含能源、食品、饲料、保健品和医药。在一个实施方案中，所述藻株可以在硝酸盐存在的情况下，进行油脂、脂肪酸、蛋白质、淀粉、色素、多糖和/或核酸的生产。在一个实施方案中，所述硝酸盐浓度调整为0.375g/L。在一个实施方案中，所述色素为叶绿素a，叶绿素b，叶绿素总量和类胡萝卜素。

有益效果

工业社会以来，人类的生产生活活动，对自然环境产生了多方面的不良影响。首先是化石燃料的使用造成了CO₂排放增多，引起了全球的气候变暖问题，成为了当前人类社会面临的重要挑战。其次，工农业生产和人类的生活，带来了废水的大量排放，废水中往往含有高浓度的氮磷等营养物，这些营养物进入江河湖海，引起了水体的富营养化问题，已经深刻影响到了人们的生活和养殖业。

MRA-2藻株可以利用废水中的氮磷营养生长，同时作为自养生物，可固定转化CO₂为生物质。若以废水和废气培养MRA-2，一方面可以减轻高浓度的氮磷等营养物流入自然水体，一方面有减少CO₂排放的效果。生产的生物质，有开发成多种工业产品的潜力。以生产生物柴油的原料--油脂为例，在低氮条件下培养，总脂的含量可达到干重的37.6％；平均油脂产率为1.9g/L，高于绝大多数的文献报道；作为生物柴油的原料部分，中性脂在总油脂中的含量高达90％，其脂肪酸组成以油酸和棕榈酸为主，适合生物柴油的生产。若通过废水提供营养物质，利用微藻MRA-2的光合作用特性，固定工厂废气中碳，合成油脂或其他生物质，进一步加工为生物柴油等高附加值产品，是一条可持续的绿色生产路线。

附图说明

图1为MRA-2在不同硝酸盐浓度下的生长和氮源消耗

图2为MRA-2对含氨氮废水的处理效果。A.除菌污水且不添加接种物；B.除菌污水添加MRA-2；C.未除菌污水不添加接种物；D.未除菌污水添加MRA-2

图3a MRA-2中性脂经甲酯化后的脂肪酸甲酯质谱图

图3b为MRA-2中性脂的脂肪酸组分

图4.MRA-2藻株的色素含量变化

图5为MRA-2 18S rDNA核酸序列(SEQ ID NO：1)

图6为MRA-2 ITS核酸序列(SEQ ID NO：2)

具体实施方式

MAR-2分离自山东省潍坊市昌乐县某村庄饮用水水池，具体过程为：用无菌瓶取适量水样，在实验室无菌条件下，涂布BG-11培养基平板，置光照培养箱，25℃条件下培养至出现藻落，挑取多个藻落再进行多次划线分离的步骤，直至得到完全纯化的藻落。其中的一株命名为MRA-2，经18SrDNA和ITS序列的测序分析，鉴定为Scenedesmus sp.。

实施例1.MRA-2藻株的培养和油脂生产方法

采用改良的BG-11培养基，其硝酸盐浓度调整为0.375g/L，采用柱式培养器(直径为42mm)(直径为42mm，长度为600mm，壁厚2mm，材质为普通玻璃，下同)，从底部通入含5％CO₂的空气，光照强度为200μmol photons m^-2s^-1，在25℃恒温室采用上述培养基培养MRA-2藻株，接种浓度为OD750为0.2。培养基的配方如表1：

表1改良的BG-11培养基的配置

蒸馏水984ml，将母液1加入2.5ml，母液3、4、5、7、8、A5各1ml，高压灭菌后，加入单独灭菌的母液2和6各1ml。

生物质的产量通过测定收获得到的藻细胞的干重获得，方法为：收获藻液，5000rpm离心10分钟获得藻泥，使用冷冻干燥机(Alpha1-2LD plus，德国Martin Christ，温度-55℃)将藻泥冻干24小时得到干燥粉。在微量天平上称重，并根据收获藻液的体积计算生物质产量

油脂含量的测定通过重量分析法获得，具体操作为：配置氯仿-甲醇(2∶1，v∶v)混合液，每50mg藻粉添加6ml的氯仿-甲醇混合液与玻璃管中(配四氟乙烯塞子)，在30℃下180rpm振荡过夜，2500rpm离心10分钟后取上清液于新的玻璃管中，并添加适量的甲醇和水，使氯仿、甲醇、水的体积比为10∶10∶9，振荡混匀后，经2500rpm离心10分钟后取下层氯仿层于新的玻璃管中，并采用通氮气的方法使氯仿挥发干，残留的油脂经冷冻干燥24小时后称重分析。(Bligh EG，Dyer WJ.A rapid method of totallipid extraction and purification.Can J Biochem Physiol 1959；377：911-7.)

培养12天，采用离心法收集微藻生物质，测得MRA-2藻株的生物质产量达到5.11g/L。上述培养的MRA-2藻株油脂含量和产量分别为37.5％和1.91g/L。

实施例2.MRA-2藻株在不同硝酸盐浓度下的生长和硝酸盐的去除

采用柱式培养器，在BG-11培养基中，25℃，在200μmol photons m^-2s^{- 1}光照条件，5％(v/v)CO₂浓度的空气培养条件下，设置1.76mM、4.41mM、17.6mM的硝酸钠浓度，4.41、17.6mM的硝酸钠浓度下，MRA-2均有较好的生长，分别达到了3.4和3.8g L^-1的生物质产量(测定方法同实施例1)(图1)。对应较高的生物质产率的是较高的硝酸盐消耗速率；但是，17.6mM的硝酸钠初始浓度致使在16天的培养周期内，培养基中一直存在硝酸钠残留。第4天时，1.76mM、4.41mM硝酸钠初始浓度的培养液中的氮的去除率均达到了98％以上，17.6mM的硝酸钠初始浓度培养液的氮的去除率均达到了74％；12天以后，17.6mM的硝酸钠初始浓度培养液的氮的去除率均达到了93％以上。

硝酸盐氮测定方法为(紫外分光光度法)：

试剂：

(1)1mol/L盐酸(优级纯)：(3.1ml→100ml)或(15.5ml→500ml)

(2)酸盐标准贮备液(0.100mgN/ml)：0.7218克KNO₃(105℃-110℃干燥2h)→1000ml容量瓶，定容后加2ml三氯甲烷，稳定6个月

(3)0.8％氨基磺酸溶液，避光保存于冰箱中

步骤：

(1)10ml水样于10ml比色管→加入0.2ml盐酸溶液→加入0.02ml氨基磺酸溶液

10mm石英比色皿，220、275nm波长处，以新鲜去离子水10ml加0.2ml盐酸溶液为参比，测吸光度(使用紫外可见分光光度Cary 50，瓦里安，美国)

(2)标准曲线：

6个200ml容量瓶中分别加入0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ml硝酸盐氮标准贮备液，用新鲜去离子水稀释至标线，浓度分别为0，0.5，1，2，3，4.00mg/L硝酸盐氮。同上操作，测量吸光度

计算：

A校＝A220-2A275(即用220nm处的吸光度减去两倍275nm处的吸光度)

A----吸光度

从校准曲线中查得相应的硝酸盐氮量，即为水样，测定结果(mg/L)

实施例3.MRA-2藻株净化高氨氮废水

取某污水处理厂待处理污水，经过滤除去固体颗粒，测定氨氮的含量(采用兰州连华科技5B-6D型氨氮测定仪测定，操作按照说明书方法)为39.4mg/L。设4个实验处理：A.除菌污水且不添加接种物；B.除菌污水添加MRA-2；C.未除菌污水不添加接种物；D.未除菌污水添加MRA-2。其中，除菌污水由上述污水经0.22μm滤膜过滤获得，分装于250ml三角瓶，装液量为90ml，接种MRA-2培养液(OD750为2)10ml，将其在25℃，80μmol photons m^-2s^-1光照，100rpm转速下振荡培养。经培养一段时间后，测定培养液中残留氨氮的含量，计算氨氮的降解率(图2)，其中10天降解率最高的是处理D，为88.5％，其次为处理B，为68.4％，再次为处理C，为53.5％，处理D最低为23.3％。此结果表明，MRA-2藻株的生长可消耗废水中的氨氮，比废水中的自然降解率(处理C)高65.4％，对于含氮废水的处理有较明显的效果。

实施例4.MRA-2藻株油脂中脂肪酸的分析

将从MRA-2藻株(从实施例1中培养获得)中提取到的油脂(采用实施例1中的提取方法)，经硅胶柱层析(使用100目左右的硅胶作为填料)分离其中的中性脂(主要为甘油三酯)成份，其中中性脂占到总脂的90％；将中性脂成份进行硫酸催化的甲酯化反应，采用安捷伦GC-MS分析脂肪酸的组分，油酸(C18:1)占到了48％，棕榈酸(C16:0)占到了21％(图3a，3b)。

中性脂的分离方法为：在22mm直径层析柱中依次添加氯仿、无水硫酸钠、100目左右的硅胶(含水量6％)和无水硫酸钠，添加时需保持氯仿液面在一直在无水硫酸钠、硅胶的上方，无水硫酸钠的厚度需达到20-30mm，硅胶添加前要使10g的硅胶与50ml的氯仿混匀，然后轻轻倒入层析柱，避免气泡的产生。硅胶柱制作好后，将溶解在2ml氯仿中的油脂样品滴加到上层硫酸钠，用100ml的氯仿洗脱得到含中性脂的洗脱液。将洗脱液旋蒸至体积为2-6ml，将其移入玻璃管，通氮气使残留的氯仿挥发掉。冷冻干燥中性脂样品24小时，微量天平称重分析获得中性脂的含量。

气相色谱-质谱联用分析条件：采用HP-Innowax Polyethylene Glycolcolumn(30m×250μm×0.25μm)柱，载气为氦气，进样口温度为250℃，初始温度为25℃，以25℃/分钟的速率升高到200℃，再以3℃/分钟的速率增高到230℃，保持230℃恒定11分钟，脂肪酸的组成以各自占脂肪酸总脂的百分比的形式表示。

实施例5.MRA-2藻株中色素的提取测定

将MRA-2藻株接种到BG-11培养基中，其中NaNO₃的浓度为0.375gL^-1，接种密度调至OD750为0.2，在220μmol m^-2s^-1光照，25℃条件下，通含3％的CO₂的空气培养，培养容器为直径为42mm的柱式培养器。色素在接种后4天达到较高的含量，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别为15.6mg L^-1、5.5mg L^-1、5.4mg L^-1。随后色素总量有一定的下降，叶绿素a的下降幅度较大(图4)。

叶绿素的提取及测定方法为：收集2ml的藻液(OD750为1左右))，3000rmp，离心10分钟；添加5ml的95％乙醇，黑暗中静置提取12小时；3000rmp，离心10分钟后取上清；测定上清在665，649，470nm处的吸光值。根据如下公式计算各个色素的含量(mg L^-1)(参考文献：Lichtenthaler，H.K.，Wellburn，A.R.，1983.Determination of total carotenoids andchlorophylls a and b of leaf extract in different solvents.Biochem.Soc.Trans.603，591-592)：

Ca＝13.95 A665-6.88 A649

Cb＝24.96 A649-7.32 A665

Cchl＝Ca+Cb

Ccar＝(1000 A470-2.05Ca-114.8Cb)/245Ca，Cb，Cchl和Ccar分别为叶绿素a，叶绿素b，叶绿素总量和类胡萝卜素的含量(mg L^-1)。

实施例6.MRA-2藻株中蛋白质的提取测定

将MRA-2藻株接种到BG-11培养基中，其中NaNO₃的浓度为0.375gL^-1，接种密度调至OD750为0.2，在220μmol m^-2s^-1光照，25℃条件下，通含3％的CO₂的空气培养，培养容器为直径为42mm的柱式培养器。6天和12天时的蛋白含量分别为7.7％和6.6％。

微藻蛋白提取及测定步骤：

1.取1ml藻液，离心，10000rpm，2min

2.弃上清，枪尖吸掉离心管内壁残留水珠

3.加0.5N的NaOH溶液1ml

4.煮沸10min

5.冰浴冷却，离心，10000rpm，2min

6.按照贝博生物生物试剂公司BCA蛋白定量试剂盒操作说明，在96孔板中添加待测样品和反应试剂，30℃温浴30分钟。

7.多功能酶标仪(Synergy HT，美国BioTek)测定562nm吸光值

8.制作标准曲线，并计算样品的蛋白含量(根据藻液中细胞干重，可以计算蛋白的百分含量)

Claims (10)

1.一株栅藻藻株Scenedesmus sp.MRA-2，保藏编号为CGMCC No.4653，其特征在于其基因组包含如SEQ ID NO：1所示的核酸序列18S rDNA和如SEQ ID NO：2所示的ITS或者它们的互补序列。

2.一种培养物，包含权利要求1所述的MRA-2藻株及其培养基，其特征在于所述培养基采用各类无机盐，或者采用工业、养殖业等产生的含有机质的废水，或者利用工业加工的各种糖类配置。

3.一种培养权利要求1的MRA-2藻株的培养方法，其特征在于采用各类无机盐，或者采用工业、养殖业等产生的含有机质的废水，或者利用工业加工的各种糖类配置进行培养。

4.权利要求3的方法，其特征在于培养温度为15-37℃，可接受50-2000μmol photons m^-2s^-1的灯光或太阳光光照，向培养物中通入含0.03-30％(v/v)CO₂的气体或空气

5.根据权利要求4所述的培养方法，其中所述CO₂的来源包含工厂产生的废气或者空气，在通入气体中CO₂的含量不超过30％(v/v)。

6.权利要求1所述的MRA-2藻株进行含硝氮或含氨氮废水的净化的应用。

7.权利要求1所述的MRA-2藻株进行含CO₂废气净化的应用。

8.权利要求1的藻株用于生产油脂、脂肪酸、蛋白质、淀粉、色素、多糖和/或核酸的应用。

9.权利要求8的应用，其中所述脂肪酸的组分为油酸C18:1占到了48％，棕榈酸C16:0占到了21％。

10.权利要求8的应用，其中所述色素包括叶绿素a，叶绿素b，叶绿素总量和类胡萝卜素。

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