CN103555584A - 产油单针藻lb50的获得及应用 - Google Patents

产油单针藻lb50的获得及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产油单针藻LB50的获得及应用，涉及产油微藻的筛选和培养利用技术。自野外环境分离获得的藻种经18S rDNA序列分析和形态鉴定，确定该藻为单针藻属（Monoraphidium）成员，其序列为SEQ NO.1。本产油单针藻LB50能够耐受高浓度碳酸氢钠，易于进行开放式培养，富含油脂，在维持22.2g/m2·d的生长和收集速率的情况下，油脂含量可达到细胞干重的30.4%，脂肪酸中有15%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸。

Description

产油单针藻LB50的获得及应用
技术领域
本发明涉及产油微藻的筛选和培养技术，尤其涉及一种产油单针藻LB50的获得及应用。具体地说，本发明是从野外采集水样，通过分离纯化得到一种可作为生产油脂原料的产油藻株。 
背景技术
     地球上被鉴定的藻类大约超过40000种，其中一些种类富含油脂。从油藻提取的油脂可以经过与甲醇反应转化为生物柴油，被认为最有可能替代日渐枯竭的石油来源的柴油。其含有的16碳和18碳的脂肪酸对于生物柴油的生产最为有利。藻类的油脂也含有不饱和脂肪酸，可以添加到动物饲料中促进生长。筛选获得容易培养、生长快、产油高的藻种是生产出具有市场竞争力的油藻生物质的关键。早在上世纪70年代，美国国家可再生能源实验室的水生物种计划，就开始利用藻类提取油脂、制备生物柴油的研发工作，从海洋和湖泊中分离了3000 多种藻类，从中筛选出300 多种生长快、含油高的硅藻、绿藻和蓝藻等藻种，但当时未解决成本问题。世界上其它各国的研究者也都利用各种手段积极地筛选寻找能适应商业化生产的优良藻种。 
当前需要亟待解决以下问题：对生长速率快、油脂含量高的微藻藻株的筛选和遗传改良；低成本、高密度培养体系的建立；高效、低成本光生物反应器的开发；高效率、低成本的采收技术；微藻的高效能源转化技术等。从以上可以看出，对于生长快、容易大量培养、油脂含量高的微藻的选育是当前需要解决的首要问题。近几年，国内多家实验室已经开始分别在科技部、自然科学基金委以及大型企业的资助下，开展大规模采集和筛选高产油藻株的工作，并且取得了一些进展。选自自然生境的微藻往往在温度、光照和盐度适应方面具有一定的抗逆性，适于在开放的跑道池中大量培养生产。 
本发明就是基于以上背景从内蒙野外盐碱地水域采集、分离和纯化而得到的一个优良的产油藻株。 
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术中用于生产微藻油脂的优良藻株不足的问题，提供一种产油单针藻LB50的获得及应用，即在内蒙野外水域采集水样，分离纯化获得的了一种具有抗逆性、易开放培养的产油微藻，并建立培养和收集等方法。 
一、单针藻LB50的获得 
①样品采集 
水样采自中国内蒙古乌兰察布市察右前旗黄旗海霸王溪，精确位置为北纬40o50’1.60”，东经113o22’41.57”；采样时间是2011年7月26日，当天的水温为23.8℃，水样的电导率为1.380ms/cm，pH为7.82； 
②藻种的分离、18S rDNA序列分析和形态鉴定 
水样通过稀释涂平板法在含有8.4g/L碳酸氢钠的BG11中培养、分离出单藻落，各藻落经液体培养提取总脂在薄层层析板上比较；选含油量较高的藻株，提取总DNA，以通用引物扩增18S rDNA，经克隆后送测序，其序列为SEQ NO.1(见序列表)； 
通过系统关系树构建确定该藻为单针藻属（Monoraphidium）成员，如图1； 
在显微镜下观察其形态符合单针藻属特征，具有片状叶绿体，称为单针藻LB50（Monoraphidium sp LB50），如图2； 
2013年7月17日将该藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013348。 
二、单针藻LB50的培养收集方法 
①单针藻LB50的培养：采用降低硝酸钠含量的BG11，补加高浓度碳酸氢钠进行培养，培养基全部成分见表1； 
通过试验比较，建立了单针藻LB50培养条件：光照强度150μE/m2·s，温度条件25～30℃，培养基为具有0.6g/L硝酸钠的BG11，补加8.4g/L碳酸氢钠（培养基全部成分见表1）；以圆形开放式光反应器进行培养（见图3），每天通入二氧化碳1小时，每5天收集1/2的培养细胞，并补充等体积的新鲜培养基，其生长速率能够达到22.2g/m2·d（每天每平米获得的干物质），这样可以长时间 持续培养和收集；由于其光合放氧活性在1500μE/m2·s达到饱和，还可以进一步提高光照强度促进其生长和产油。 
表1 培养基成分
         化学成分       用量（mg/L)
K2HPO4·3H2O        40
MgSO4·7H2O        75
CaCl2·2H2O        36
C6H8O7（柠檬酸）        6
FeC6H5O7·NH4OH（柠檬酸铁铵）        6
EDTA·Na2        1
Na2CO3        20
NaNO3        600
NaHCO3        8400
H3BO3        2.8
MnCl2·4H2O        1.86
ZnSO4·7H2O        0.22
Na2MoO4·2H2O        0.39
CuSO4·5H2O        0.08
CoCl2·6H2O        0.01
②单针藻LB50的絮凝采收
在大量培养后用稀盐酸调节培养液pH，加壳聚糖絮凝沉淀细胞。
将单针藻LB50在大量培养后转移至收集容器内，用稀盐酸将pH调为6，加壳聚糖至7.5 mg/L；去除上层培养液，收集沉降的藻细胞。 
三、单针藻LB50的培养收集方法的应用 
①其大量培养获得的含油藻细胞用于油脂提取；
②其藻细胞直接添加到动物饲料中增加不饱和脂肪酸营养；
③其藻细胞的大量培养可吸收工业排放的二氧化碳。
收集的藻细胞用冷冻干燥机进行干燥；将干藻以1:1的氯仿/甲醇提取总脂，计算得到总脂占细胞干重的百分比为30.4%。从该藻提取的油脂中富含不饱和脂肪酸，譬如，18碳3烯酸和18碳4烯酸总和占脂肪酸的15%以上。 
    其大量培养获得的含油藻细胞用于油脂提取，也可直接添加到动物饲料中增加不饱和脂肪酸营养，在大量培养的同时还可吸收工业排放的二氧化碳。 
    本发明具有下列优点和积极效果： 
①单针藻LB50的生长不需要有机质营养，可以在廉价的无机营养中通过开放式培养源源不断地获得含油脂的生物质；其培养基中含有较高浓度碳酸氢钠，可以防止原生动物和致病菌的侵害以及其他杂藻的污染，在商业化生产过程中可以降低成本。
②该藻株收集容易，加絮凝剂可快速沉淀。 
③该藻株富含油脂，在维持22.2 g/m2·d的生长和收集速率的情况下，油脂含量可达到细胞干重的30.4%，脂肪酸中有15%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸。 
附图说明
图1是单针藻LB50在系统关系树中的位置； 
图2是单针藻LB50的显微照片；
图3是使用圆形光反应器培养单针藻LB50；
图4是使用跑道池培养。
2013年7月17日将单针藻LB50的藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013348。 
具体实施方式
下面结合附图和实例详细说明： 
实例一、在圆形光反应器中半连续培养
按照以上描述的培养基配方配制培养液，在0.1 m2圆形光反应器中接种培养，培养液体积为20 L。初始OD680值为0.05，温度控制为25-30℃，光强为150 μE/m2·s持续光照，每天往培养液中通1个小时的CO2，取样测OD680值。OD680值达到6.0时，收集1/2的藻液，并补充1/2的新鲜培养基进行半连续培养，以后每隔5天收集一次藻液并补料一次。单针藻LB50在收集容器内用稀盐酸将pH调为6，加壳聚糖至7.5 mg/L，10分钟絮凝沉降效率达到90%以上。将絮凝的藻液去除上清液，获得浓缩的藻细胞。将藻细胞冷冻干燥后称重，计算生长速率，结果其生长速率能够达到22.2 g/m2d。按每100g干藻粉加入4 L 氯仿/甲醇(1:1)的比例提取总脂，再按1L的比例加入H2O，振荡混匀后, 3000 rpm离心5-10min使溶液分层,将下层氯仿相转移到另一容器中通氮气挥发氯仿，得到总油脂，称重计算得到总脂占细胞干重的百分比为30.4%。经气相色谱测定，总脂的脂肪酸中18碳酸和16碳酸占99.25%，其中18碳3稀酸和18碳4稀酸占15.96%（见表2）。
表2单针藻LB50细胞中的脂肪酸组成（摩尔百分比)
    
脂肪酸种类 脂肪酸组成
14:0 0.58±0.19
14:1 0.08±0.05
16:0 26.05±4.34
16:1 3.54±1.12
18:0 1.99±0.72
18:1 43.57±10.25
18:2 8.14±2.09
γ-18:3 0.87±0.12
α-18:3 10.1±2.61
18:4 4.99±0.77
20:0 0.09±0.09
实例二、室外跑道池培养
按照该藻株培养基配方，利用内蒙当地的地下水配制培养液，在内蒙古鄂尔多斯室外5 m2跑道池进行开放式培养（见图4），培养液体积为750 L。跑道池流速通过轮状搅拌器控制为0.04 m/s；水温白天为30℃左右，晚上为24℃左右；光照强度随天气阴晴而不同，平均光照强度为600μE/m2·s，夜晚处于黑暗状态；每天取样测OD680值，培养至OD680值达到1.5，开始收集1/5体积的藻液，然后加入1/5的新鲜培养液进行半连续培养，以后每隔3天收集一次补料一次。收集的藻液经显微镜下观察，保持99%以上的纯种状态，很少杂菌和其他藻种污染。如同实例一，将所收集的藻在容器内用稀盐酸将pH调为6，加壳聚糖至7.5 mg/L，絮凝沉降10分钟，去除上层培养液即得到浓缩的藻细胞用于提取油脂，总脂达到细胞干重的30.7%。
序列表
<110>中国科学院水生生物研究所；中国石油化工股份有限公司
<120>产油单针藻LB50的获得及应用
<140>
<141>
<160> 1
<210> 1
<211> 1786
<212> DNA
<400> 
TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAGGTGGGAGGGTTTAATGAACTTCTCGGCAAAAGCAAGTGTTGCCACCCGCTTCGCCAATCCGAACACTTCACCAGCACACCCAATCGGTAGGAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCGCAAGCTGATGACTTGCGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGACTAATAATTGCAATAATCTATCCCCATCACGACACGGTTTCAAAGATTACCCAGACCTCTCGGTCAAGGATAGGCTTGTTGAACGTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCATACTTCCGATGCTTTTGTAGCATCTGTCCCTCTAAGAAGTCGGCCAACCGTAAGAAGCGGCAGTGACTATTTAGCAGGCTGAGGTCTCGTTCGTTACCGGAATCAACCTGACAAGGCAACCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCACTATGTCTGGACCTGGTAAGTTTTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGgCTcCACGCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCATAAGGTGCTGGAGAAGTCATCAAAAGAACATCCTCCAATCCCTAGTCGGCATCGTTTATGGTTGAGACTACGACGGTATCTAATCGTCTTCGAGCCCCCAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTTCATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAaTGAAATACGAATGCCCCCGACTGTCCCTCTTAATCATTACTCCGGTCCTACAGACCAACGAGATAGGCCAGAGTCCTATCGCGATATTCCATGCTAAAGTATTCAGAGCGTAGGCTTGCTTTGAACACTCTAATTTACTCAAAGTATCATCGTCGAATCCGAGTCCCGGACAGTGAAGCCCAGGAGCCCGTCCCCGACAGAAAGGAGGGCCACAGCAGTACTCACCATAGGCGGACCGCTGGAACCCACCCGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTAAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATGGATCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACCAGACATTGAATGCCCGGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTATCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATCCTCCGTCACCCGTTACCACCATGGTAGGCCTCTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAAACATCGCCAGCACGAGGCTATGCGATTCGTGAAGTTATCATGATTCACCGCGGGTCGGACAAAGTCCGGTCGGCCTTTTATCTAATAAATACGTCCCTTCCAGAAGTCGGGATTTACGCACGTATTAGCTCTAGGTTTACTACGGTTATCCGTGTAAAAGTACCATCAAATAAACTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAGCAGTTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGGATCAACCA。

Claims (3)

1.一种产油单针藻LB50，其特征在于： 
用含有碳酸氢钠的BG11中培养、分离获得的一种绿藻，在显微镜下观察其形态符合单针藻属Monoraphidium，特征；其18S rDNA序列SEQ NO.1经系统关系分析证明属于一种单针藻，命名为单针藻LB50，即Monoraphidium sp.LB50；该藻种能够耐受高浓度碳酸氢钠，易于进行开放式培养，在维持22.2g/m2·d的生长和收集速率的情况下，油脂含量可达到细胞干重的30.4%，脂肪酸中有15%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸；2013年7月17日将该藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013348。 
2.按权利要求1所述的一种产油单针藻LB50的培养收集方法，其特征在于：
①单针藻LB50的培养：采用降低硝酸钠含量的BG11，补加高浓度碳酸氢
钠进行培养，培养基全部成分见表1；
②单针藻LB50的絮凝采收：在大量培养后用稀盐酸调节培养液pH，加壳
聚糖絮凝沉淀细胞。
3.按权利要求2所述的培养收集方法的应用，其特征在于：
①其大量培养获得的含油藻细胞用于油脂提取；
②其藻细胞直接添加到动物饲料中增加不饱和脂肪酸营养；
③其藻细胞的大量培养可吸收工业排放的二氧化碳。
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