CN104073437A - 一种单针藻、其培养方法、采收方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种单针藻，其保藏编号为CGMCC No.8776，命名为单针藻C29，其生长速度快，油脂产率高，是生产生物柴油的优良菌株；本发明还提供了一种单针藻的开放式培养方法，此方法采用特定培养基培养，更利于单针藻C29的生长及油脂的积累；本发明还提供了单针藻C29的采收方法，该方法无毒性，絮凝效率高、采收成本低；本发明还提供了单针藻C29在生产油脂，特别是在生产生物柴油中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉一种单针藻、其培养方法、采收方法及其应用。
背景技术
目前，世界能源消费的90％为石油、天然气和煤炭，这些化石能源的消费产生了大量的二氧化碳、二氧化硫、氮化硫和氮氧化物等气体，严重破坏了地球的环境。此外，化石能源不可再生，长期过度的开采导致了化石能源的日渐枯竭，这些都严重制约了工业社会的发展。
因此，世界各国都在寻找新的可再生能源，其中，生物柴油是一种清洁的可再生能源，是化石能源的优质代用品。生物柴油的油脂原料来自植物油脂(食用油和非食用油)、动物油脂(各种动物脂肪)、微藻脂肪酸以及废弃食用油(地沟油)。但在生物柴油的生产中还存在以下问题：目前，我国食用油供给尚且不能自足，没有足量剩余食用油来发展生物柴油；非食用油料作物的种植也存在与粮油棉等作物的种植争地、争水、争肥的问题；利用动物油脂生产生物柴油存在成本太高的问题，不利于大规模推广；利用废弃食用油生产生物柴油产量有限，无法满足工业的需求。
利用微藻生产生物柴油可以克服以上问题，微藻大多分布在江河湖泊中，具有生长周期短、产量高、不占用耕地和不与人争粮的突出优点，同时微藻易养易收，群体众多，所含脂肪酸等生物能巨大，因此，微藻是未来生物柴油的发展趋势之一。
微藻也称单细胞藻类，种类约占全球已知藻类的70％。微藻富含油脂、蛋白质、色素、微生物和矿物质。微藻的油脂含有不饱和脂肪酸，可以添加到动物饲料中促进生长；微藻的油脂中还含有大量的16碳脂肪酸和18碳的脂肪酸，利于生物柴油的生产。美国能源部1978年就立项利用微藻制备生物柴油的研发工作，他们从海洋和湖泊中分离了3000多种藻类，从中筛选出300多种藻株用以制备生物柴油，但当时主要存在所选藻株生长速度慢或油脂产率较低的问题，使微藻产油的成本居高不下，这成为影响以微藻为原料的生物柴油的发展和普及的主要因素。因此，对生长速度快、容易大量培养、油脂产率高的微藻的选育是当前需要解决的首要问题。
单针藻属于微藻的一种，单针藻细胞为不规则的宽纺锤形，细胞宽约4～8μm，长12～26μm，呈直或略弯状。单针藻是一种常见的淡水浮游藻类，极易在营养丰富的水中繁殖。目前国内外对具有生物能源方面应用的单针藻菌株报道较少，单针藻中可能存在未被开发的优良新菌株，因此，生长速度快、油脂产率高的单针藻新菌株的开发具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明了提供一种单针藻，其保藏编号为CGMCC No.8776，命名为单针藻C29，本发明提供的单针藻C29生长速度快，油脂产率高，是生产生物柴油的优良菌株；此外，本发明还提供了该单针藻菌种的培养方法、采收方法及应用。
本发明提供了一种单针藻，菌株名称为单针藻C29(Monoraphidium sp.C29)，保藏编号为CGMCC No.8776。
本发明提供的单针藻C29(Monoraphidium sp.C29)菌株已于2014年01月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8776。
本发明通过筛选得到单针藻C29菌株，具体的筛选方法如下：
取2010年9月从海南省儋州市宝岛新村河流采集的水样0.5mL在无菌条件下涂布于BG-11固体培养基上，培养20天，在人工气候箱培养，培养温度为28℃，全天光照，光照强度为10000lux，挑选单菌落接种到BG-11液体培养基，置于转速为120r/min摇床上培养，培养温度为28℃，在光照强度为10000lux下培养5天，经检测，得到纯藻株，鉴定为单针藻属，命名为单针藻C29，从实施例1中可知，本发明提供的单针藻C29菌株的生长速度和油脂产率显著(P<0.05)高于现有报道中生长速度和油脂产量最高的单针藻(Monoraphidium contortum)菌株，单针藻C29菌株未见报道，将单针藻C29菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8776。
本发明还提供了一种保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻的培养方法，步骤为：取保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻在培养基中开放式培养，得到培养物；
其中，每100L培养基成分如下：
作为优选，水为自来水。
根据实施例2中的试验结果可知，与市售BG11培养基和Provasoli basedminimal media相比，本发明提供的培养基更利于保藏编号为CGMCCNo.8776的单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。在本发明提供的培养基中，甘氨酸既是单针藻C29生长的氮源也是单针藻C29生长的碳源，在培养过程中单针藻C29利用甘氨酸中的碳源使油脂产率得到增加。
本发明所用到的培养基还可以用于其他生物，尤其是藻类的培养中。
开放式培养是将单针藻置于敞开的容器中培养。
作为优选，开放式培养的温度为16～40℃，开放式培养的时间为5～10d。
作为优选，开放式培养的温度为28℃。
作为优选，开放式培养的时间为7d。
作为优选，开放式培养还包括通入气体的步骤。
作为优选，气体为空气或含体积百分含量为0.03％～35％CO2的气体。
在本发明的一些实施例中，保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29培养过程中需要通入含有体积百分含量为0.03％～35％CO2的气体，这些气体可以来自于工厂的废气，单针藻C29将CO2固定为有机物，一方面降低了环境的污染，另一方面为人们提供了大量的有价值的有机物。
作为优选，通入气体的速率为5～15L/min。
在本发明的实施例中，开放式培养为在太阳光照下开放式培养。
作为优选，光照强度为6000lux～10000lux。
本发明还提供了一种保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻的采收方法，包括以下步骤：
步骤1：取絮凝剂与含有保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻的藻液混合，得到混合液；
步骤2：取pH调节剂调节混合液的pH值至5.0～6.0，搅拌，静置，收集沉淀，离心，干燥，即得。
作为优选，步骤1中絮凝剂为壳聚糖。
实施例10的采收过程表明，采用壳聚糖絮凝采收单针藻C29，壳聚糖用量少，无毒性，絮凝效率高，可以极大的降低采收成本。
更优选的，以mg/L计，壳聚糖与藻液的质量体积比为10～20：1。
更优选的，以mg/L计，壳聚糖与藻液的质量体积比为10～15：1。
实施例10中的试验结果表明，当壳聚糖的浓度为10、15mg/L，20min可达到100％的絮凝效率，浓度为2.5、5.0和7.5时，絮凝效率低，由此可知，壳聚糖的浓度为10～15mg/L为絮凝的最佳用量。
步骤2中调节pH步骤和搅拌步骤可以同时进行，也可以分别进行。
作为优选，步骤2中pH调节剂为醋酸或盐酸。
作为优选，步骤2中搅拌的速度为50～120r/min，搅拌的时间为3min～5min。
更优选的，搅拌的时间为3min。
作为优选，步骤2中静置的时间为15～30min。
更优选的，静置的时间为20min。
步骤2中干燥可以为任何形式的干燥。
作为优选，干燥为烘干或冷冻干燥。
本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻在生产油脂中的应用；油脂可以应用于食品、医药、饲料及能源领域。
实施例21中数据显示，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29中，16碳脂肪酸占到28.5％，其中棕榈酸(C16:0)占23％；18碳脂肪酸占65.5％，其中油酸(C18:1)占30％；对比例1中单针藻(Monoraphidiumcontortum)菌株油脂成分分析数据显示，单针藻(Monoraphidium contortum)菌株中16碳脂肪酸为30.9％，18碳脂肪酸为59.0％；由此可见，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29中的16碳脂肪酸含量和18碳脂肪酸含量显著(P<0.05)高于对比例1提供的单针藻(Monoraphidiumcontortum)菌株。
作为优选，油脂为生物柴油。
根据本发明实施例22～25中数据可知，保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株的生物柴油的产率为75～80％，对比例1显示，现有技术中单针藻(Monoraphidium contortum)菌株的生物柴油的产率为60～65％，由此可见，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株的生物柴油产率显著(P<0.05)高于现有技术中单针藻(Monoraphidium contortum)菌株的生物柴油产率，因此，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株更利于生物柴油的生产。
在本发明的实施例中，油脂产率和生物柴油产率的计算公式如下：
本发明了提供一种单针藻，其保藏编号为CGMCC No.8776，命名为单针藻C29，由实施例1可知，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株在Provasoli based minimal media中封闭式无菌培养，平均生长速率为1.2g/L/d，油脂产率为468mg/L/d；现有报道中，生产速度和油脂产率最高的单针藻(Monoraphidium contortum)菌株在完全相同条件下封闭式培养，平均生长速率为0.307g/L/d，油脂产率为68.2mg/L/d；由此可知，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株的生长速率和油脂产率显著(P<0.05)高于单针藻(Monoraphidium contortum)菌株。由实施例2可知，试验组4的管6和试验组3相比可知，本发明提供的开放式培养的条件比现有培养条件更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累；试验组1、试验组2和试验组4管8相比可知，本发明提供的培养基与现有的BG-11培养基、Provasoli based minimal media相比，更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。试验组4和对照组相比，试验组4的平均生长速率和油脂产率均高于对照组，差异极显著(P<0.01)，由于试验组4采用了本发明提供的培养基和开放式培养条件，对照组采用的是现有的培养基和现有的开放式培养条件，由此可知，本发明提供的培养基和开放式培养条件更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。此外，试验组4的平均生长速率、最高生长速率和油脂产率均显著(P<0.05)高于试验组1～试验组3，由于试验组4采用了本发明提供的培养基和开放式培养条件，试验组1和试验组2只采用了本发明的开放式培养条件，试验组3只采用了本发明的培养基，由此可知，本发明提供的培养基和开放式培养方法综合使用更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。
本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29的采收方法，该方法采用少量的壳聚糖作为絮凝剂，无毒性，絮凝效率高、极大的降低了采收成本；本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29在生产油脂中的应用，油脂成分进行分析显示，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.8776的单针藻C29的油脂中脂肪酸种类丰富，其中16碳脂肪酸占到28.5％，18碳脂肪酸占65.5％，生物柴油产率为75～81.3％；对比例1提供的单针藻(Monoraphidium contortum)中，16碳脂肪酸为30.9％，18碳脂肪酸为59.0％，生物柴油产率为60～65％，二者相比较，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株中，生物柴油产率显著(P<0.05)高于单针藻(Monoraphidium contortum)菌株，因此，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29更利于生物柴油的生产。
生物保藏说明
菌株单针藻C29，分类命名：单针藻(Monoraphidium sp.)，于2014年01月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.8776。
附图说明
图1为实施例3中保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29的开放式培养生长曲线；
图2示实施例10中，絮凝采收壳聚糖用量与絮凝效率图；其中图2(a)示壳聚糖用量分别为2.5mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L、10.0mg/L时的絮凝效率图，曲线1示壳聚糖浓度为2.5mg/L；曲线2示壳聚糖浓度为5.0mg/L；曲线3示壳聚糖浓度为7.5mg/L；曲线4示壳聚糖浓度为10.0mg/L；图2(b)示壳聚糖用量分别为2.5mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L、15.0mg/L时的絮凝效率图，其中，曲线1示壳聚糖浓度为2.5mg/L；曲线2示壳聚糖浓度为5.0mg/L；曲线3示壳聚糖浓度为7.5mg/L；曲线4’示壳聚糖浓度为15.0mg/L；
图3示实施例10中，保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株采用壳聚糖采收前后细胞形态图；其中图3(a)示采收前的原藻液的细胞形态图；图3(b)示采用浓度为10mg/L的壳聚糖采收后，絮凝层藻液的细胞形态图；
图4为保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29油脂的气相色谱图；
图5为图4中保留时间为5.80的物质的质谱图；
图6为图4中保留时间为6.51的物质的质谱图；
图7为图4中保留时间为7.69的物质的质谱图；
图8为图4中保留时间为8.77的物质的质谱图；
图9为图4中保留时间为9.41的物质的质谱图；
图10为图4中保留时间为10.37的物质的质谱图；
图11为图4中保留时间为10.81的物质的质谱图；
图12为图4中保留时间为11.59的物质的质谱图；
图13为图4中保留时间为18.63的物质的质谱图；
图14为图4中保留时间为21.61的物质的质谱图；
图15为图4中保留时间为25.88的物质的质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种单针藻，其保藏编号为CGMCC No.8776，本发明还提供了此单针藻菌株的培养方法、采收方法及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的实施例中所用到的试剂及原料均可由市场购得。在本发明的实施例中，原料具体来源如下：
Provasoli based minimal media配方：
BG-11配方(1L)：
其中，微量元素A5(1L)的配方如下：
H3BO4 2.86g Na2MoO4 0.39g
MnCl2·4H2O 1.81g CuSO4·5H2O 0.079g
ZnSO4 0.22g Co(NO3)2·6H2O 49.4mg
以上试剂均由市场购得；其他试剂及原料均由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1单针藻C29菌株的筛选
取2010年9月从海南儋州某水池采集的水样0.5mL在无菌条件下涂布于BG-11固体培养基上，培养20天，在人工气候箱培养，培养温度为28℃，全天光照，光照强度为10000lux，挑选单菌落接种到BG-11液体培养基，置于转速为120r/min摇床上培养，培养温度为28℃，在光照强度为10000lux下培养5天，经检测，得到纯藻株，鉴定为单针藻属，命名为单针藻C29。
取上述单针藻C29在灭菌Provasoli based minimal media中采用摇床转速为120r/min进行封闭式无菌培养，培养温度为25-28℃，培养5天。计算平均生长速率、最高生长速率、生物量、油脂产率。
试验结果如下：保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29的平均生长速率为1.2g/L/d，最高生长速率为2.08g/L/d，培养5天之后的生物量6.0g/L,油脂总量为2.34g/L，油脂产率为468mg/L/d。
据ChristianBogen等报道，单针藻(Monoraphidium contortum)在与上述单针藻C29完全相同的试验条件下，平均生长速率为0.307g/L/d，最高生长速率为0.898g/L/d，培养5天之后的生物量为1.54g，油脂总量为0.342g/L，油脂产率为68.2mg/L/d。由以上数据可知，本发明提供的单针藻C29菌株的生长速率和油脂产率显著(P<0.05)高于单针藻(Monoraphidium contortum)菌株。
单针藻C29菌株在现有技术中未见报道，将单针藻C29菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8776。
实施例2单针藻C29培养基及开放式培养条件的优化
在室外向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，管1～管10均为无色透明，管内径300mm，长2000mm，同时均配备空气泵及通气管路。
将管1～管10分为以下五组：
试验组1：管1，加入100L的BG-11培养基，采用本发明的培养方法(详见表2)。
试验组2：管2，加入100L的Provasoli based minimal media，采用本发明的培养方法(详见表2)。
试验组3：管3，加入100L表1中所示培养基，采用现有技术培养方法(详见表2)。
试验组4：管4～9，分别加入100L表1中所示培养基，采用本发明的培养方法(详见表2)。
对照组：管10，加入100L的BG-11培养基，采用现有技术培养方法(详见表2)。
表1管3～管9中每100L培养基的配方
分别向试验组1、试验组2、试验组3、试验组4和对照组的每支管中加入12.5L实施例1筛得的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29的种子液，浓度均为3g/L。
具体培养条件如表2所示：
表2试验组1～4和对照组的具体培养条件
培养过程中每天取样离心干燥后测定干重，分别计算试验组1～试验组4和对照组中的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29菌株的平均生长速率、最高生长速率、培养结束之后的生物量、油脂产率，设置三次平行试验，三次重复试验。
油脂产率测定方法如下：
取保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29藻液离心干燥，得到干燥藻粉1.0g，加入氯仿-甲醇-水(体积比为1:2:1)混合液20mL，50℃超声提取15min，然后加入氯仿-水(体积比为1:1)混合液10mL，50℃超声提取15min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得到油状物在50℃下干燥至恒重，得到油脂Bg。再根据培养时的平均生长速率，计算油脂产率。
所得数据如表3所示：
表3各组中生长速率、生物量、油脂产率的测试结果
由表3中的测试结果可知，试验组4的管6和试验组3相比，试验组4的管6的平均生长速率、最高生长速率和油脂产率均显著(P<0.05)高于试验组3。由于试验组4的管6和试验组3相比，培养基完全相同，而开放式培养的温度、时间和通气情况不同，，由此可知，本发明提供的开放式培养的条件比现有开放式培养的条件更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。
由表3中的测试结果还可看出，试验组1、试验组2和试验组4管8相比，试验组4中管8的平均生长速率、最高生长速率和油脂产率均显著(P<0.05)高于试验组1，且显著(P<0.05)高于试验组2；由于试验组4中的管8采用本发明的培养基，试验组1采用市售的BG-11培养基，试验组2采用Provasoli based minimal media，可见，试验组1、试验组2、试验组4的管8中的培养基不同，而开放式培养条件均完全相同，由此可知，本发明提供的培养基与现有的BG-11培养基、Provasoli based minimal media相比，更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。
表3中还显示，试验组4和对照组相比，试验组4的平均生长速率、最高生长速率和油脂产率均高于对照组，差异极显著(P<0.01)，由于试验组4采用了本发明提供的培养基和开放式培养条件，对照组采用的是现有的培养基和现有的开放式培养条件，由此可知，本发明提供的培养基和开放式培养条件更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。
由表3中的测试结果还可看出，试验组4的管4～9中平均生长速率为0.35～0.50g/L/d，最高生长速率为0.74～0.92g/L/d，油脂产率为108.5～190mg/L/d，试验组1～试验组3中平均生长速率为0.18～0.33g/L/d，最高生长速率为0.44～0.72g/L/d，油脂产率为38～99mg/L/d；由此可知，试验组4的平均生长速率、最高生长速率和油脂产率均显著(P<0.05)高于试验组1～试验组3，由于试验组4采用了本发明提供的培养基和开放式培养条件，试验组1和试验组2只采用了本发明的开放式培养条件，试验组3只采用了本发明的培养基，由此可知，本发明提供的培养基和开放式培养方法综合使用更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。
综合上述试验结果，本发明提供的培养基和开放式培养条件比现有的培养基和培养条件更利于单针藻C29菌株的生长和油脂的积累。
实施例3单针藻C29的开放式培养
在室外通风向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径200mm，长1500mm)、空气泵及通气管路，向玻璃管中加入40L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
向管中加入5L浓度为2g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，通入空气培养，通气速率为5L/min，在16℃下培养，培养时间为6天，得到藻液40L，培养过程中每天取样离心干燥后测定干重，依据干重和培养时间做生长曲线。生长曲线如图1所示。由图1可知，微藻在培养第2天即进入对数生长期，培养6天后进入稳定期，其生物量为2.7～3.5g/L，平均生长速率为0.45～0.58g/L/day。
实施例4单针藻C29的开放式培养
在室外向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径300mm，长2000mm)、空气泵及通气管路，向玻璃管中加入100L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
向管中加入12.5L浓度为3g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，以15L/min的速度通入空气，在28℃下培养7天，得到藻液107L，经测定，7天后，单针藻C29生物量为2.7～3.5。平均生长速率为0.39～0.50g/L/day。
实施例5单针藻C29的开放式培养
在室外向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径300mm，长2000mm)、空气泵及通气管路，向玻璃管中加入100L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
向管中加入12.5L浓度为2.5g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，通入体积百分含量为0.03％CO2的气体培养，通气速率为15L/min，在40℃下培养，培养时间为5天，得到藻液105L，经测定，5天后，单针藻C29生物量为2.4～3.3。平均生长速率为0.48～0.66g/L/day。
实施例6单针藻C29的开放式培养
在室外通风向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径60mm，长600mm)，向玻璃管中加入1L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
向管中加入0.125L浓度为2g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，在28℃下培养，培养过程中，每天手动搅拌3-5次，培养时间为10天，得到藻液0.8-0.9L，经测定，10天后，单针藻C29生物量为3.6～4.0g/L。平均生长速率为0.36～0.40g/L/day。
实施例7单针藻C29的开放式培养
在室外通风向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径60mm，长600mm)、空气泵及通气管路，向玻璃管中加入1L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
向管中加入0.125L浓度为2.5g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，通入体积百分含量为35％CO2的气体培养，通气速率为5L/min，在28℃下培养，培养时间为10天，得到藻液0.8-0.9L，经测定，10天后，单针藻C29生物量为3.7～4.2g/L。平均生长速率为0.37～0.42g/L/day。
实施例8单针藻C29的开放式培养
在室外通风向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径300mm，长2000mm)、空气泵及通气管路，向玻璃管中加入100L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
搅拌均匀。向管中加入10L浓度为2g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，通入体积百分含量为30％CO2的气体，通气速率为10L/min，在30℃下培养，培养时间为8天，得到藻液106L，经测定，8天后，单针藻C29生物量为2.7～3.4g/L。平均生长速率为0.34～0.43g/L/day。
实施例9单针藻C29的开放式培养
在室外通风向阳处(光照强度为6000～10000lux)固定好有机玻璃管(无色透明，管内径300mm，长2000mm)、空气泵及通气管路，向玻璃管中加入100L搅拌均匀的培养基，培养基成分如下：
向管中加入11.5L浓度为2g/L的实施例1筛得的单针藻C29的种子液，通入体积百分含量为15％CO2的气体，通气速率为9L/min，在30℃下培养，培养时间为7天，得到藻液108L，经测定，7天后，单针藻C29生物量为2.5～3.4g/L。平均生长速率为0.36～0.49g/L/day。
实施例10单针藻C29采收方法的优化
分别取实施例9制备的藻液108L置于5个塑料桶中，分别加入壳聚糖，壳聚糖用量为2.5、5.0、7.5、10、15mg/L。调节藻液pH至5.5，并使用搅拌器搅拌3min(搅拌转速为100r/min)，静置，每隔一段时间测定上清液OD值，计算絮凝效率，设置三个平行试验和三次重复试验，所得试验结果如图2(具体为图2(a)和图2(b))所示。从图2(a)和图2(b)中可以看出，当壳聚糖用量为10、15mg/L时，在20min可达到100％絮凝效率，由此可见，用壳聚糖做絮凝剂，壳聚糖用量少，絮凝效率高，极大的降低了采收成本。
取絮凝层藻液，置于24细胞培养板中，采用倒置显微镜观察藻细胞絮凝情况，结果如图3【具体为图3(a)和图3(b)】所示。从图3(a)和图3(b)可以看出，加入壳聚糖之前的原藻液与加入10mg/L的絮凝层藻液的照片相比，保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29只是浓度增大，形状未发生变化，说明壳聚糖作为絮凝剂对保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29细胞无破坏作用，也就是说，壳聚糖对保藏编号为CGMCC No.8776菌株无毒性。
实施例11单针藻C29的采收
取实施例3制备的藻液40L置于塑料桶中，加入720mg壳聚糖，加入醋酸调节藻液pH至5.0～6.0，使用搅拌器搅拌3min，搅拌转速为50r/min，静置30min，收集下层絮凝浓缩后藻液，以4000r/min的速度离心，烘干，即得干燥藻粉128.7g。
实施例12单针藻C29的采收
取实施例4制备的藻液107L置于塑料桶中，加入21400mg壳聚糖，加入盐酸调节藻液pH至5.0～6.0，并使用搅拌器搅拌3min，搅拌转速为120r/min，静置15min，絮凝效率为100％，收集下层絮凝浓缩后藻液，4000r/min的转速离心，烘干，即得干燥藻粉331.8g。
实施例13单针藻C29的采收
取实施例5制备的藻液105L置于塑料桶中，加入1785mg壳聚糖，加入醋酸调节藻液pH至5.0～6.0，并使用搅拌器在120r/min的转速下搅拌3.5min，静置30min，收集下层絮凝浓缩后藻液，以4000r/min的速度离心，冷冻干燥，即得干燥藻粉310.2g。
实施例14单针藻C29的采收
取实施例7制备的藻液0.8L置于塑料桶中，加入12mg壳聚糖，加入盐酸调节藻液pH至5.0～6.0，并使用搅拌器在70r/min的转速下搅拌4.5min，静置20min，收集下层絮凝浓缩后藻液，在4000r/min速度下离心，烘干，即得干燥藻粉2.8g。
实施例15单针藻C29的采收
取实施例8制备的藻液106L置于塑料桶中，加入1060mg壳聚糖，使用搅拌器在100r/min的转速下搅拌4min，并加入盐酸调节藻液pH至5.0～6.0，静置15min，收集下层絮凝浓缩后藻液，在4000r/min速度下离心，烘干，即得干燥藻粉339.1g。
实施例16单针藻C29的采收
取实施例9制备的藻液108L置于塑料桶中，加入1296mg壳聚糖，加入盐酸调节藻液pH至5.0～6.0，并使用搅拌器搅拌5min，搅拌转速120r/min，静置30min，收集下层絮凝浓缩后藻液，在4000r/min速度下离心，冷冻干燥，即得干燥藻粉319.7g。
实施例17单针藻C29用于油脂的生产
取实施例11制备的干燥藻粉50g，加入氯仿-甲醇-水(体积比为1:2:1)混合液500mL，50℃超声提取15min，然后加入氯仿-水(体积比为1:1)混合液250mL，50℃超声提取15min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得到油状物在50℃下干燥至恒重，得到油脂17.7g，单针藻C29油脂产率为159.3mg/L/d～205.3mg/L/d。
实施例18单针藻C29用于油脂的生产
取实施例12制备的干燥藻粉100g，加入氯仿-甲醇-水(体积比为1:2:1)混合液1000mL，50℃超声提取15min，然后加入氯仿-水(体积比为1:1)混合液500mL，50℃超声提取15min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得到油状物在50℃下干燥至恒重，得到油脂34.2g，单针藻C29油脂产率为133.38mg/L/d～171mg/L/d。
实施例19单针藻C29用于油脂的生产
取实施例13制备的干燥藻粉100g，加入氯仿-甲醇-水(体积比为1:2:1)混合液1000mL，50℃超声提取15min，然后加入氯仿-水(体积比为1:1)混合液500mL，50℃超声提取15min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得到油状物在50℃下干燥至恒重，得到油脂33.1g，单针藻C29油脂产率为158.9mg/L/d～218.5mg/L/d。
实施例20单针藻C29用于油脂的生产
取实施例14制备的干燥藻粉2g，加入氯仿-甲醇-水(体积比为1:2:1)混合液30mL，50℃超声提取15min，然后加入氯仿-水(体积比为1:1)混合液15mL，50℃超声提取15min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得到油状物在50℃下干燥至恒重，得到油脂0.761g，单针藻C29油脂产率为106.4mg/L/d～136.8mg/L/d。
实施例21单针藻C29油脂成分的分析
取实施例11制备的藻粉0.5g，加入0.5mol/L的NaOH-甲醇溶液5mL，震荡混合10min，60℃水浴10min，待溶液冷却后加入1％硫酸-甲醇溶液8mL，震荡混合10min，50℃水浴10min，依次加入2mL水和3mL正己烷，分层后收集上层溶液(正己烷相)，重复萃取1次，合并正己烷溶液，氮吹仪浓缩至1mL，密封保存待检测。
气象色谱柱条件：石英毛细管柱HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)，程序升温：从160℃开始，以6℃/min升到250℃，保持5min；载气为He，柱流量1.0mL/min，进样口温度250℃，分流比50:1。
质谱条件：EI源；电离电压70eV，离子源温度230℃，扫描范围10-500aum，进样量1.0μL。
单针藻C29油脂的气相色谱图如图4所示，质谱图见图5～图15所示，经分析，单针藻C29油脂的具体成分如表4所示：
表4单针藻C29油脂具体成分
| 脂肪酸类型 | 占总脂肪酸的含量(％) |
| C16:0 | 23 |
| C16:1n-7 | 1.5 |
| C16:2n-7 | 4 |
| C18:1n-9 | 30 |
| C18:2n-9 | 26 |
| C18:3n-9 | 9.5 |
| C26:0 | 4.5 |
| 其它 | 1.5 |
| Total | 100 |
取实施例12～实施例16制备的藻粉进行油脂成分分析，所用试验方法和实施例21相同，所得测试结果与实施例21相似。
取实施例17～实施例20制备的油脂进行成分分析，首先甲酯化，之后进行气象色谱-质谱检测，检测条件和实施例21相同，所得测试结果与实施例21相似。
从以上分析结果可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.8776的单针藻C29的油脂中脂肪酸种类丰富，其中16碳脂肪酸占到28.5％，18碳脂肪酸占65.5％。
实施例22单针藻C29用于生物柴油的生产
取实施例17制备的油脂15g，运用酸碱催化生产方法，制备得到生物柴油11.3g，经计算可知，生物柴油产率为75％。
实施例23单针藻C29用于生物柴油的生产
取实施例18制备的油脂15g，运用酸碱催化生产方法，制备得到生物柴油12.2g，计算得出，生物柴油产率为81.3％。
实施例24单针藻C29用于生物柴油的生产
取实施例19制备的油脂15g，运用酸碱催化生产方法，制备得到生物柴油11.87g，计算得出，生物柴油产率为79.1％。
实施例25单针藻C29用于生物柴油的生产
取实施例20制备的油脂0.7g，运用酸碱催化生产方法，制备得到生物柴油0.53g，计算得出，生物柴油产率为75.7％。
对比例1单针藻(Monoraphidium contortum)菌株油脂成分分析及生物柴油的生产
取单针藻(Monoraphidium contortum)在Provasoli based minimal media中培养，培养温度为25-28℃，培养5天，得到藻液。经处理，得到单针藻(Monoraphidium contortum)藻粉，取藻粉进行油脂成分分析，分析方法如下：
取上述藻粉0.5g，加入0.5mol/L的NaOH-甲醇溶液5mL，震荡混合10min，60℃水浴10min，待溶液冷却后加入1％硫酸-甲醇溶液8mL，震荡混合10min，50℃水浴10min，依次加入2mL水和3mL正己烷，分层后收集上层溶液(正己烷相)，重复萃取1次，合并正己烷溶液，氮吹仪浓缩至1mL，密封保存待检测。
气象色谱柱条件：石英毛细管柱HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)，程序升温：从160℃开始，以6℃/min升到250℃，保持5min；载气为He，柱流量1.0mL/min，进样口温度250℃，分流比50:1。
质谱条件：EI源；电离电压70eV，离子源温度230℃，扫描范围10-500aum，进样量1.0μL。
分析结果表明，单针藻(Monoraphidium contortum)菌株的油脂成分如下：
其中16碳脂肪酸为30.9％，18碳脂肪酸为59.0％。取油脂运用酸碱催化方法生产生物柴油，经计算，生物柴油产率为60-65％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明。
Claims (10)
1.一种单针藻，其保藏编号为CGMCC No.8776。
2.一种如权利要求1所述的单针藻的培养方法，其特征在于，取所述单针藻在培养基中开放式培养，得到培养物；
其中，每100L所述培养基成分如下：
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述开放式培养的温度为16～40℃，所述开放式培养的时间为5～10d。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述开放式培养还包括通入气体的步骤。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述气体为空气或含体积百分含量为0.03％～35％CO2的气体。
6.一种如权利要求1所述的单针藻的采收方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取絮凝剂与含有所述单针藻的藻液混合，得到混合液；
步骤2：取pH调节剂调节所述混合液的pH值至5.0～6.0，搅拌，静置，收集沉淀，离心，干燥，即得。
7.根据权利要求6所述的采收方法，其特征在于，步骤2中所述搅拌的速度为50～120r/min，所述搅拌的时间为3min～5min。
8.根据权利要求6所述的采收方法，其特征在于，步骤2中所述静置的时间为15～30min。
9.一种如权利要求1所述的单针藻在生产油脂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述油脂为生物柴油。
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