CN103160440B - 一株栅藻藻株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株栅藻藻株(Desmodesmus？sp.)及其应用，其为ENN2203A，于2010年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC？NO.4323。本发明的栅藻藻株具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，可用于含氮磷污水的污处理，可用于二氧化碳减排，用于生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料等，产业化应用潜力较大。

Description

一株栅藻藻株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及一株栅藻藻株(Desmodesmussp.)及其应用。
背景技术
日益严重的能源短缺与环境恶化问题已成为全世界关注的热点。石油、天然气、煤等化石燃料是当今的主要能量来源，这类能源不可再生，随着这类能源的不断消耗，其天然储备急剧减少，按照全世界对化石燃料的消耗速度计算，这些能源可供人类使用的时间大约还有：石油45-50年，天然气50-60年，煤炭200-220年。化石燃料燃烧产生大量的水和二氧化碳，二氧化碳又是全球气候变暖的主要原因。许多科学家都认为，煤、油、天然气和树木的燃烧产生大量二氧化碳，二氧化碳进入大气层后使地球升温，全球性的温度的升高将产生一系列的台风、干旱、洪水和冰川加速融化的问题，对于人类的长期发展形成巨大的威胁。目前的二氧化碳治理所采用的捕捉掩埋技术成本较高，不适用于大面积推广。除废气外，化石燃料的燃烧、各种产业生产过程中产生的废弃物导致的水污染也越来越引起全世界人们的关注。
能源微藻技术的发展将为上述问题的解决提供了新的方向。微藻是体积小、结构简单、生长迅速的单细胞藻类，其分布极其广泛，从热带、温带到寒带直至南北两极，从淡水湖泊、盐碱沼泽到海水，从水表到大洋深处几乎都有微藻存在和繁衍。微藻还具有光能转换率高、对环境适应性强、易于遗传改良等特点，可以对其进行大规模培养。目前，微藻在大气污染和水污染治理、生物质能源等领域的开发应用价值得到日益关注。
栅藻是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰富的静水中繁殖。许多种类的栅藻对有机污染物具有较强的耐性。栅藻在水体自净和污水净化中有一定作用，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上，形成胶质层，吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，大量繁殖的藻体也可作为家禽的饲料。栅藻繁殖快，营养价值高，可作为人工大量培养的材料。
季祥、王金荣等发表的一株斜生栅藻的筛选及生长条件的优化(水产科技情报201037(6))文献中公开了栅藻的藻株，在分类学上与本专利的栅藻藻株各属于不同属，含油率为31.5％，此文并未研究藻株的特殊环境条件下生长和收集特性。
发明内容
本发明目的在于提供一株栅藻藻株，可用于上述领域，且具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，产业化应用潜力较大，可用于环境或工业生产中废弃二氧化碳的处理、生物能源的生产和废水处理。本专利中的藻株具有耐高温、易收集等特点。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的栅藻藻株(Desmodesmussp.)为ENN2203A，于2010年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNO.4323。
该ENN2203A栅藻藻株属淡水藻，栅藻属，椭圆形，大小10μm左右，两端及侧面带刺，常以四联体、二联体形式存在，也有单体存在，细胞内单个蛋白核(见图2)；生长迅速，沉降性好，易收集，含油率高、提取总脂时较为容易，具有较大的大生产应用潜力，最高总脂含量达到52.168％。
所述ENN2203A栅藻藻株的ITS部分序列为：
TTTTTCCTCCCCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCTTGCCTGAGCTCAGGTCGAATACAGAGATACGCGTCAGAGACACGTTTCCTGCTTGGCTCCTAACCAGGTCCTCAGACACAACTTCGTGTAGGCACCCGAGGGTGTTGCTACCTATGCAGTTGAGGGCGAATGGGGTGGCAGTTTAAGCCTCTGTGCTTCAGCCAACCCAATCGGAGGTGAGTCCGATTGGGAGGGCCAGATCCACCCCTGATGCCGGCTTGAGCAAGCACGACAAGCTTCCTGTTGAGGAAGAGGGGTGAGGGTGTAAACCGACGCTGAGGCAGACATGCTCTTCTCCGAGGAGTCGAGCGCAATATGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACGGAATTCTGCAATTCACACTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGTTGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTGTTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCTGAAACTTCAGAGTTTGGTTTAATCAAATGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTAGGTTAGTAGGCAAAACCAGGGTTAGTGGTTCGACCTAACGTCGGTACACAAATAAAAGAGTGCGTGTTGTGGTTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTAGCATCCAAAAA，其如SEQIDNo.1所示。将获得的ENN2203A的ITS部分序列及5.8S序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与ACCESSION号为DQ417525.1的Desmodesmusmutilvariousi的internaltranscribedspacer1，5.8SribosomalRNAgeneandinternaltranscribedspacer2sequence具有较高的相似性达95％，覆盖率只有92％(图1)；表明ENN2203A与Desmodesmusmutilvariousi的亲缘关系最近，说明两者为同属藻株。
本发明通过自然界藻种分离纯化及筛选，获得一株性能良好的栅藻藻株(Desmodesmussp.)ENN2203A。
由于本发明提供的栅藻藻株ENN2203A在常温与高温下养殖干重全程差异都不大，最终15天时干重达7.2g/L左右，在40℃高温下养殖8-12h对ENN2203A的生长几乎没有影响，因此具有生物量高、生长速度快、培养密度高、环境适应性强的优势，适合产业化应用。
而且本发明提供的藻株的总油脂含量可达50％以上，具有油脂含量高的特性，特别适合生物柴油的生产。
本发明提供的栅藻藻株ENN2203A作为生长迅速，富含蛋白质和各种不饱和脂肪酸，可被广泛用作为许多水产品幼体的开口饵料或轮虫的饵料，也可用于开发生产动物饲料。
本发明还提供了栅藻藻株ENN2203A的以下用途：其可用于含氮磷污水的污处理；其可用于二氧化碳减排。
具体地，本发明包括以下方面：
1、一株栅藻藻株(Desmodesmussp.)ENN2203A，其保藏号为CGMCCNO.4323。
2、按以上1所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株如SEQIDNo.1所示的ITS部分序列。
3、按以上1所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株具有高温耐受性；优选耐受15-40℃的温度。
4、按以上1所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株的12小时沉降率为95％以上。
5、按以上1所述的栅藻藻株ENN2203A的养殖方法，其特征在于，所述栅藻藻株在15-40℃的温度下养殖。
6、按以上1所述的栅藻藻株ENN2203A的收集方法，其特征在于，所述栅藻藻株使用自然沉降法收集。
7、一种以上1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于含氮磷污水的污处理。
8、一种以上1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于二氧化碳减排。
9、一种以上1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于生物柴油生产。
10、一种以上1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于水产品饵料或动物饲料。
本发明的技术效果如下：
1、本发明的栅藻藻株沉降性能良好，有效降低藻体收集的成本；
2、本发明的栅藻藻株耐高温性能良好，适于夏季室外养殖；
3、本发明的栅藻藻株生长速度快，易于实现高密度养殖，适合于产业化推广；
4、本发明的栅藻藻株可用于含氮磷污水的污处理、可用于二氧化碳减排、用于生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料。
附图说明
图1为ENN2203A部分ITS序列进行Blast的比对结果；
图2为本发明栅藻藻株的形态；
图3为ENN2203A室内养殖生长曲线；
图4为ENN2203A高温耐受性生长曲线；和
图5为ENN2203A废水废气养殖生长曲线。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1筛选产油栅藻藻株
取无菌水稀释后的从廊坊地区取回的河水水样，在400倍显微镜观察后，大约细胞浓度为800-1200个/ml，用毛细管取大约1ul的藻液，接种于48孔装有BG11培养基(见表1)的培养板中，在25℃、光照强度为50umol/m2.s情况下进行培养，当达到107/ml细胞浓度时，显微镜观察，选择只有单藻株的孔，稀释至细胞浓度为1000-3000个/ml后铺平板，得到单藻株并保存于BG11固体平板上，命名为ENN2203A。
表1BG11培养基配方
NaNO3 1.5g/L
K2HPO4·3H2O 0.04g/L
MgSO4·7H2O 0.075g/L
CaCl2·2H2O 0.036g/L
citric acid 0.006g/L
FeCl3·6H2O 0.00315g/L
Na2EDTA·2H2O 0.00436g/L
Na2CO3 0.02g/L
A5 Trace element* 1ml/L
其中，*A5Traceelement的组成成分如下所示：
H3BO3 2.86g/L
MnCl2·H2O 1.81g/L
ZnSO4·7H2O 0.222g/L
CuSO4·5H2O 0.079g/L
Na2MoO4·2H2O 0.390g/L
Co(NO3)2·6H2O 0.0494g/L
实施例2确定藻种在进化树上的分类
藻株鉴定采取形态鉴定和分子鉴定相结合。
(1)形态鉴定：
对上述分离出来的藻株ENN2203A在1000倍显微镜进行观察(见图2)，藻体为单细胞或由2或4个单细胞组成的定型群体，单细胞呈球形或卵形，由2或4个单细胞组成的定型群体中的2或4个单细胞并列直线成一列，各个细胞上下两端广圆，细胞壁平滑，每个细胞的上下两端各具有1条向外弯曲的长刺，其外侧壁中部具有2条短刺；由4个单细胞组成的定型群体的群体宽15-20μm，每个单细胞长5-8μm，宽3-4μm；色素体周生，片状，具蛋白核一枚；无性繁殖产生似亲孢子，由4个单细胞组成的定型群体中的任一单细胞均可形成似亲孢子，在离开母细胞前连接成子群体；检索《中国淡水藻类--系统、分类及生态》，发现此藻在形态上分类相同的为绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、栅藻科(Scenedesmaceae)、链带藻属(Desmodesmus)。初步鉴定为Desmodesmussp.。
(2)分子鉴定：
A，从分离的藻株扩增其ITS及5.8S部分核苷酸序列；
用CTAB法(张桂和等，几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测.热带海洋学报，2007，26(1)：68-72；陈昆松等，改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取.遗传，2004，26(4)：529-531；陈颖等，3种小球藻DNA提取方法的比较.植物生理学通讯，2001，37(3)：242-244)提取培养4天的ENN2203A藻基因组DNA；取一定量的细胞，研磨处理后按200mg细胞加入600ulCTAB缓冲液的比例加入CTAB缓冲液，匀浆，向反应体系中加入与细胞匀浆液等体积的酚：氯仿抽提，离心取上清，加入上清0.6倍体积异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中，紫外分光光度计检测其浓度和纯度；
ITS序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)；
引物15’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’
引物25’GCATATCAATAAGCGGAGGA3’
取1μl总DNA为模板；扩增条件如下：94℃变性5min，然后94℃40s，56℃40s，72℃2min30个循环，最后72℃10min。1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，PCR扩增获得约750bp片断。序列如SEQIDNO.1所显示。
B，所克隆的核苷酸序列同源性搜索：
将获得的ENN2203A的ITS部分序列及5.8S序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与ACCESSION号为DQ417525.1的Desmodesmusmutilvariousi的internaltranscribedspacer1，5.8SribosomalRNAgeneandinternaltranscribedspacer2sequence具有较高的相似性达95％，覆盖率只有92％(图1)；
C，根据上述序列作出进化树：
利用NCBI数据库中的BLAST工具对藻株ENN2203A的ITS部分序列进行序列相似性分析。选取部分同源序列和该藻株的ITS部分序列利用clustalw2软件包(欧洲分子生物学实验室和欧洲生物信息学研究所，http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行序列同源进化比对，形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后，运用Mega4.0软件(TamuraK等，MEGA4：MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(MEGA)softwareversion4.0.MolecularBiologyandEvolution，2007，24：1596-1599)，采用邻位相连(Neighbor-joining)算法，自展数据集bootstraps值为1000构建系统发育进化树。
根据形态和ITSblast的结果，限定ENN2203A为链带藻属(Desmodesmus)。
本申请人已将所述藻株于2010年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，简称CGMCC)，其保藏号为CGMCCNo.4323。
实施例3ENN2203A藻的室内养殖及油脂积累
将处在对数生长期的栅藻藻株ENN2203A绿色游动细胞接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD750为0.2-0.8之间；培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间，温度调控在15-35℃范围内；培养所使用的反应器为40mm内径长度600mm的柱式反应器；培养过程中，定时取样测定干重，结果见图3培养进行到第16天，最终干重达到10.93g/L，此时藻液颜色变黄，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥。干燥完成后，测定其油脂组分含量如表2，其提取、分析方法如下：
1)脂肪酸提取：
取50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4ml10％DMSO-Methanol溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心，转移上清液到另一小瓶中；剩下藻渣再加入1∶1的乙醚、正己烷4-8ml4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中；可重复上述过程直到藻渣变白；在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)体积比例为1∶1∶1∶1，震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。
2)脂肪酸成份分析：
将采用上述方法提取的脂肪酸样品，用正己烷溶解，使用Agilent6820气相色谱仪进行气相色谱分析(色谱条件为载气：氮气流量1ml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID(Agilent)，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱(Agilent)(30m×0.25mm，0.25μm)，分流比：4∶1；分析方法：内标法(GB/T17377-1998)(气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相)进行脂肪酸组分分析。样品中脂肪酸组成及含量结果见表2。
脂肪酸组分分析结果显示，其油脂含量高达50％以上，具有油脂含量高的特性，可以作为生物柴油的生产原料。其脂肪酸中，约90％为C16-C18脂肪酸，65％左右为C18脂肪酸，25％左右为C16脂肪酸，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的60％左右。由此可见，本发明的栅藻藻株ENN2203A可用于生物柴油生产原料。
表2气相色谱测定的样品总脂组分
实施例4ENN2203A高温耐受性
将处在对数生长期的栅藻藻株ENN2203A绿色游动细胞接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD750为0.2-0.8之间；培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间；培养所使用的反应器为50*50*5cm(长*高*宽)玻璃板式反应器。在室内设置两个实验组：第一组在常温(30℃左右，24h)进行养殖，第二组在高温(40℃左右维持8-10h，其余时间常温培养)进行养殖。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图4。
ENN2203A常温组与高温组干重全程差异都不大，最终15天时干重达7.2g/L左右，40℃，8-12h高温对ENN2203A的生长几乎没有影响；但40℃高温对于其他藻株来说，是可能导致死亡的温度。表明ENN2203A具有较好的高温耐受性、存活性能。
实施例5：ENN2203A的沉降性。
将实施例4中培养15天的ENN2203A静置过夜，静置前测定常温组OD750＝7.55，高温组OD750＝6.55，过夜(12小时)沉降后，测定常温组OD750＝0.24，高温组OD750＝0.31，沉降率均达到95％以上，说明ENN2203A经过夜沉降，收集效果良好。
实施例6ENN2203A蛋白质含量测定
将实施例5中培养15天的ENN2203A通过自然沉降后再离心获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥；干燥完成后，采用GB5009.52010《食品中蛋白质的测定方法》来测定藻粉中蛋白质含量。经检测，ENN2203A的藻粉中蛋白质的含量达到51.02％，蛋白质含量丰富，可以用于水产品饵料或动物饲料。
实施例7ENN2203A废水废气养殖及二氧化碳减排
养殖过程所用的废水是来自化工厂的废水(来自内蒙古新能化工有限公司)，含有丰富的Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4 2+等离子；所用的废气同样来自化工厂的废气(来自内蒙古新能化工有限公司)，废气经液态甲醇洗过，CO2含量在95％左右，含有一些H2S、CO等杂质。
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*5cm(长*高*宽)玻璃板式反应器中，设置两个实验组：第一组使用自来水按照表1配制BG11培养基进行养殖，第二组使用化工厂废水添加1.5g/LNaNO3、0.04g/LK2HPO4·3H2O，0.00315g/lFeCl3·6H2O，0.00436g/lNa2EDTA·2H2O，1ml/LA5Traceelement(见表1)配制培养基进行养殖，两组培养基的离子浓度见表3。
表3两种培养基的离子浓度测定结果
利用自然条件进行生长培养，培养期间自然条件如下：培养周期为12天，9:00-17:00的温度变化范围主要在20-45℃之间，白天持续高温时间为4-6h。9:00-17:00的光照变化范围阳面主要在200-1200umol/m2/s之间，光照强度600-1000umol/m2/s的持续时间约为4-6h；白天通入CO2含量在1.5-2％的CO2(CO2来源于化工厂，纯度95％以上)与空气的混合气，控制PH值在7-9之间；培养过程中间断取样测定干重(结果见图5)；培养结束后将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥，取适量藻粉进行气相色谱分析，脂肪酸成份测量分析方法同实施例3，脂肪酸在藻粉中含量见表4。
本实施例中没有实施措施诱导脂肪酸的积累，自来水中养殖12天脂肪酸含量达到24.054％，化工厂废水中养殖12天脂肪酸含量也达到19.165％。如采取相应措施，脂肪酸含量会达到更高的水平。
表4ENN2203A自来水和废水养殖脂肪酸组成结果比较
本实施例中微藻培养时培养基中没有添加C源，藻体生长固定的CO2来自培养过程中通入的CO2含量在1.5-2％的CO2(CO2来源于化工厂，纯度95％以上)与空气的混合气。本培养过程中固定的CO2见表5，以每吨藻约可固定2吨CO2来计算(黄英明等，微藻能源技术开发和产业化的发展思路与策略，生物工程学报，2010，26(7)：907-913)。由此可见，大规模养殖本发明的栅藻藻株ENN2203A可用于CO2减排。
表5ENN2203A自来水和废水养殖固定CO2量结果比较
实施例8ENN2203A用于含氮磷的污水处理
利用工厂废水(来自内蒙古新威远生物化工有限公司)养殖微藻藻株ENN2203A，养殖进行5天后，废水中N的浓度由0.21g/L变为0.009g/L，去除率为95.7％；P的浓度由0.015g/L变为0g/L，去除率为100％。证明藻株ENN2203A可以用于含氮磷的废水处理。

Claims (12)

1.一株栅藻藻株(Desmodesmussp.)ENN2203A，其保藏号为CGMCCNO.4323。
2.根据权利要求1所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株的ITS部分序列如SEQIDNo.1所示。
3.根据权利要求1所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株具有高温耐受性。
4.根据权利要求3所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株的耐受温度为15-40℃。
5.根据权利要求1所述的栅藻藻株ENN2203A，其特征在于，所述栅藻藻株的12小时沉降率为95％以上。
6.一种根据权利要求1所述的栅藻藻株ENN2203A的养殖方法，其特征在于，所述栅藻藻株在15-40℃的温度下养殖。
7.一种根据权利要求1所述的栅藻藻株ENN2203A的收集方法，其特征在于，所述栅藻藻株使用自然沉降法收集。
8.一种权利要求1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于含氮磷污水的污处理。
9.一种权利要求1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于二氧化碳减排。
10.一种权利要求1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于生物柴油生产。
11.一种权利要求1所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于动物饲料。
12.一种根据权利要求11所述栅藻藻株ENN2203A的用途，其为用于水产品饲料。
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