CN106148194B - 微藻和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微藻和其用途。具体地讲，本发明系关于一种新颖的经分离微藻和其在制备1,3‑二酰基甘油(1,3‑DAG)和生物燃料的用途。

Description

微藻和其用途

技术领域

本发明关于新颖的微藻(Raphidocelis sp.)分离株，所述分离株可产生高量的1,3-二酰基甘油(1,3-DAG)和C16-C18脂肪酸，故其培养产物可做为生产健康油脂和生物燃料的原料。

背景技术

微藻体型微小需藉由显微镜才得以看到，几乎任何环境都可以有其存在。目前推测微藻种类有20～80万间，但仅有约3万5千种被发现。利用微藻产生能源的想法起源于公元1970年美国的藻类生物柴油计划，近几年来在能源短缺与温室效应下又重新受到关注。目前将利用微藻所产生的生物燃料称为第三代能源以区分第一代能源(材料为粮食作物)与第二代能源(材料为非粮食作物)。微藻具备生长速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培养、所需土地面积较小且可海水养殖、利用烟道气与废水等污染源、受病菌污染机率较小等大量培养的优点，加上其细胞结构简单与缺乏细胞分化，在遗传工程操作上比植物细胞更简易，与植物具相似的醣化后转译修饰机制以利真核基因的表现等的人工操纵优势(Yen,H.W.,et al.,2013.Microalgae-based biorefinery–From biofuels to naturalproducts.Bioresource Technology 135:166-174)，目前微藻主要被锁定作为藻多醣、类胡萝卜素(carotenoids)、藻胆色素(phycobilins)与多元不饱和脂肪酸(DHA与EPA)等产品的天然来源的(Spolaore et al.,2006.Commercial applications ofmicroalgae.J.Biosci.Bioeng..101:87-96)，而成功的微藻产业需要具备有最适切的藻种、最优化的培养条件与最优化的活性高价物质。在生物遗传改造、藻种快速筛选平台与人工培养技术的加持下，让具多面向发展潜力的微藻素材成为医疗保健、食品加工、水产养殖、动物饲料与美容等行业的应用已成为未来开发的新蓝海范畴，加速微藻特殊活性物质的探勘与提升其提纯技术，将可开创出更为广阔的市场应用前景。目前开发藻种的重点希望透过微藻的大量养殖过程降低废水与废气污染，减缓二氧化碳的排放，还希望能从藻体提炼出生物能源或高价的活性物质，达到环保与产业双赢的目标(Farrelly,D.J.et.al.,2013.Carbon sequestration and the role of biological carbon mitigation:Areview.Renewable and Sustainable Energy Reviews 21:712-727)。

微藻生命周期需仰赖光合作用的进行，因此二氧化碳、阳光和水，是培养微藻所需的三大要素。一般而言，微藻大约每6至72小时藻体量会增加一倍，若藻体生长速度越快则能采收的频率越高；藻体含油量高就表示能有较多藻油可被转换为生物燃料，要以微藻来生产生物能源得挑选生长快速且含油量高的藻种，但通常含油量高的藻种生长速度较含油量低的藻种来的慢，因此需同时考虑生长速度与含油量两个因素加以选择出较适当的藻种。另外藻体回收的过程为目前耗能大的一环节，因此适合作为生物燃料生产的微藻种类须具备生物产量高、藻油量高、藻体易于回收的特点。藻油中脂肪酸的饱和度和三酸甘油酯(TAG)的比例也须纳入考虑，藻体中的总油量是由三酸甘油酯到固醇等多种化学化合物所组成，但并非所有化学化合物都适合生物燃料的生产，其中含有脂肪酸的脂质是优选的化合物，因其可藉由转酯化将其转化为生物柴油，因此藻油中脂肪酸图谱可作为藻种筛选的指标之一(Ramos,M.J.,et al.,2009.Influence of fatty acid composition of rawmaterials on biodiesel properties.Bioresour.Technol.100:261-268)，于2013年有研究文献指出旋转单针藻(Monoraphidium contortum)(SAG 47.8)具备300mg/L/天的生物能产量、含油量占藻体干重的22.2％与主要脂肪酸组成为C16:0到C18:1脂肪酸，可做为生物燃料的潜力藻株(Bogen,C.,et al.,2013.Identification of Monoraphidium contortumas a promising species for liquid biofuel production.Bioresource Technology133:622-626)，另外研究指出即使是单一藻种中总油量的多寡与脂肪酸组成成分会受到培养基成分与培养过程所影响(Dhup S.and Dhawan V.,2014.Effect of nitrogenconcentration on lipid productivity and fatty acid composition ofMonoraphidium sp.Bioresource Technology 152:572-575)。

微藻的传统分类方法主要是藉由藻体细胞与丝状物的形态、营养细胞的长度和宽度、终端细胞的形态、细胞大小、分裂型式、细胞形状和排列、异形细胞的间距、异形和厚壁孢子间最近的距离、异形细胞、厚壁孢子、色素、气泡和厚鞘的有无、与其是否可聚集成群落(colony)等形态特征差异来加以分类。Selenastraceae科中常见藻体形态为月牙型(capricornutum shape)或新月型(crescent shape)的藻属如纤维藻属(Ankistrodesmus)、月牙藻属(Selenastrum)、单针藻属(Monoraphidium)与蹄形藻属(Kirchneriella)等藻属，虽可藉由藻体为单一或聚集成群落、胞外物质胶垫(mucilagepad)的有无与藻体细胞形态等特征加以区分藻属，但由于藻体形态有些会因为培养基成分与培养时间的长短而有所变化，导致此类藻属形态的多型性，但由于近几年分子生物学的蓬勃发展，透过生物基因组中重复序列的高保留性使其可以作为DNA指纹图谱的分子标记，目前微藻领域最常用的分子标记是以18S rRNA序列与ITS区域序列为主，用以辅助藻种的鉴定(Krienitz,L.,et al.,2011；Yu,X.et al.,2012.SSU rRNA Gene Phylogeny ofMorphospecies Affiliated to The Bioessay Alga“Selenastrum capricornutum”Recovered the Polyphyletic Origin of Crescent-Shaped Chlorophyta.J.Phycol.47:880-893)。

肥胖是现今许多人所关注的问题，体脂肪屯积会造成如糖尿病、高血脂症、心血管疾病、高血压等代谢异常与循环系统疾病。活动量较少与摄取过多的能量是造成肥胖的主要原因。其中摄取过多的脂肪是能量摄取过高的主要原因的一。然而，脂肪亦为重要的营养素的一，除可提供能量的外，亦与脂溶性维生素的吸收有关。同时，脂肪具有独特的风味，可提供食品丰富的口感与质感，亦为料理食品不可或缺的热介质。天然的脂肪包含许多不同的三酸甘油酯，为了解决脂肪摄取过多的问题，许多研究和厂商相继开发脂肪替代物，希望降低油脂的吸收。例如美国第3,600,186号专利的蔗糖脂肪酸(sucrose polyester)，其拥有不被消化吸收以和会被排泄至粪便中的特性，故有“低卡油”的功用。但蔗糖脂肪酸有可能会引起腹部痉挛或软便的问题，而且具有阻碍脂溶性维生素吸收等的缺点。1,3-二酰基甘油(diacylglycerol；1,3-DAG)为天然油脂，其在一般油脂中的含量不高，但因其结构特征，经人体消化吸收后多代谢为能量，几乎不会再重新合成三酸甘油酯，故摄取1,3-二酰基甘油被视为优选的食用油脂型态。已有许多关于如何利用1,3-二酰基甘油取代三酸甘油酯成为健康油脂的主成分的研究。如彭宣融等人发表(伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)脂肪酶和其伴护子的选殖表现与应用。台湾化学与食品科学49(6):316-328，2011)和台湾第I423983号专利，系一种经分离的脂肪酶基因和所述脂肪酶的伴护子基因，其所编码的多肽具有脂肪酶的活性，可用于制备1,3-二酰基甘油。

目前尚无藻类的脂肪组成中富含1,3-二酰基甘油的相关文献报导。故藻类培养物是否可用做健康油脂和生物燃料的原料，尚待进一步的开发和探讨。

发明内容

本发明的一目的在于提供一种微藻分离株，所述微藻分离株的培养物可用做生产健康油脂和生物柴油的原料，并可固定二氧化碳作为减碳的工具。

本发明的另一目的在于提供一种培养所述微藻分离株以获得含有微藻培养产物的方法。

本发明的另一目的在于提供一种由上述方法所获得的微藻培养产物。

本发明的另一目的在于提供一种由上述微藻培养产物中获得1,3-二酰基甘油的方法。

本发明的另一目的在于提供一种由上述微藻培养产物中获得脂肪酸的方法。

本发明在以下部分中详细描述。本发明的其他特征、目的和优点可易见于本发明的实施方式和权利要求书中。

附图说明

图1显示FP-7MA藻株的显微镜检图，其中A为明视野观察，细胞长约为10-15μm，宽约为5-8μm，显微倍率1,000X；且B为以Nile Red染色，以荧光显微镜观察，藻体内部有黄色的油滴分布，显微倍率1,000X。

图2显示FP-7MA藻株以C培养基在不同培养温度下的生长情形。

具体实施方式

本发明可藉由下述实施方式中所揭示的各种发明态样、实施例和表列的相关叙述所了解。除非在本文中另作定义，否则与本发明关联使用的术语(包含技术和科学术语)应具有本发明所属技术领域中具有通常知识者所了解的含义。且当可了解，除非本文中提供的定义另作说明，在任何潜在歧义的情况，术语的定义应与所述等普遍使用的术语(如词典中所定义)一致。可进一步了解者，本案所使用的术语仅系用作描述特定实施态样的目的，而非用于限定。

必须注意的是，除非有清楚的相反指示，于说明书或权利要求书使用的单数格式“一种”和“所述”亦包含复数表示。因此，除非上下文另有需要，单数术语应包含复数而复数术语亦包含单数。

本发明的范围以“自一个‘约’特定数值和/或至另一个‘约’特定数值”表示。当范围藉上述方式表示时，其包含自一特定数值和/或至另一特定数值的范围。同样地，当数值可藉由术语“约”以表示近似值，将可了解其为一特定值的另一个态样。可进一步了解，当提和有关其它端点和其他端点本身而言，每一范围的两端点皆为有意义的。根据本发明，“约”可表示±20％，优选为±10％，更优选为±5％。

于本发明中，术语"经分离"或"分离"意谓使物质自其原始环境(例如，若天然存在则为天然环境)中移出。术语"经分离"或"分离"并不一定指物质系经纯化者。

本发明的目的一在于提供一种微藻分离株，其包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少95％相似度的18S rRNA序列，且与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少95％相似度的ITS区域序列。换言的，所述微藻分离株中的18S rRNA序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似度，且ITS区域序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似度。

两个核酸序列间的差异可出现于参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处，或个别散布于参考序列中的核苷酸当中或散布于参考序列内的一或多个邻近基团中的彼等末端位置的间的任何地方。任何特定核酸分子是否与参考核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相似系指使用此项技术中所熟知的标准算法在两个分子的间所进行的比较且可常规使用公开可用的计算机程序(诸如BLASTN算法)来判定。

于本发明的一个优选的实施态样中，所述微藻分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2015030的菌株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2015030的菌株具有实质上完全相同特征的变异株。

上述“变异株”意谓涵盖全体细胞遗传组成已藉由如化学突变诱发、自发突变、遗传工程、转化或转染而改变，以致影响其物理或生物化学特性的任何微藻株。然而，所述变异株应具有以保藏编号为CCTCC M 2015030保藏于中国典型培养物保藏中心的菌株的所有识别特征。

本发明的另一目的系在于提供一种制备微藻培养产物的方法，其包含将本发明微藻分离株接种于液态培养基中，且温度在约15℃至约35℃、照光和通气下进行培养以获得所述培养产物。本发明亦提供由上述方法所获得的培养产物。

本发明中所述用于培养微藻分离株的“液态培养基”可为任何容许微藻分离株生长、繁殖并制造1,3-二酰基甘油和/或脂肪酸的液体培养基基，例如C培养基(每100mL中包含15mg的Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg的KNO₃、5mg的β-甘油磷酸二钠·5H₂O、4mg的MgSO₄·7H₂O、0.01μg的维生素B12、0.01μg的生物素(Biotin)、1μg的噻胺HCl、0.3mL的PIV金属(每100mL中包含100mg的Na₂EDTA·2H₂O、19.6mg的FeCl₃·6H₂O、3.6mg的MnCl₂·4H₂O、1.04mg的ZnCl₂、0.4μg的CoCl₂·6H₂O、0.25μg的Na₂MoO₄·2H₂O和水)、50mg的Tris、和水)、BG-11培养基(每100Ml包含1,500mg的NaNO₃、40mg的K₂HPO₄、75mg的MgSO₄·7H₂O、27.18mg的CaCl₂、6mg的柠檬酸、6mg的柠檬酸铁铵、1mg的Na₂·Mg·EDTA·2H₂O、20mg的Na₂CO₃、2.86mg的HBO₃、1.181mg的MnCl₂·4H₂O、0.222mg的ZnSO₄·7H₂O、0.39mg的Na₂MoO₄·2H₂O、0.0718mg的CuSO₄·5H2O、0.049mg的Co(NO₃)₂·6H₂O、和水)和MA培养基(每100mL中包含10mg的Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg的KNO₃、5mg的NaNO₃、4mg的Na₂SO₄、5mg的MgCl₂·6H₂O、10mg的β-甘油磷酸二钠·5H₂O、0.5mg的Na₂EDTA·2H₂O、0.05mg的FeCl₃·6H₂O、0.5mg的MnCl₂·4H₂O、0.05mg的ZnCl₂、0.5mg的CoCl₂·6H₂O、0.08mg的Na₂MoO₄·2H₂O、2mg的H₃BO₃、和50mg的Bicine)。

本发明的液态培养基中，可视需要添加NaOH作为增加油脂产率的诱导剂，而所添加NaOH的最终浓度可为约0.5mM至约2mM，优选可为约0.5mM至约1.5mM，更优选可为约1mM。

且本发明中用于培养微藻分离株的适当条件意旨如温度、照光和培养时间等条件，其可容许所述微藻分离株生长、繁殖并制造1,3-二酰基甘油和/或脂肪酸。本技术领域的人士可根据既有知识针对培养基的成分和培养条件作调整。

于本发明的实施态样中，其培养温度可为约15℃至约35℃，优选为约20℃至约30℃；且照光量可为约100lux至约4,000lux，优选为约2,000lux。

本文中所谓“通气”意旨于液体培养基中持续地通入空气，而通气量可为约0.05vvm至约1vvm，优选为约0.1vvm至约0.5vvm。于所述空气中的二氧化碳的含量除可天然的为约0.04％，亦可额外的调整，使其中二氧化碳的含量可高达约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。

本发明制备微藻培养产物的方法中，可视需要包含分离所述培养产物的步骤，而所述分离步骤可为如离心和/或过滤等习知的方法步骤。

由于本发明的微藻培养产物中富含1,3-二酰基甘油和/或脂肪酸，故可用做获得1,3-二酰基甘油和/或脂肪酸的原料，进而分别用于制作健康油脂和/或生物能源。

本文中的“脂肪酸”意旨具有8至30个碳原子和0至6个不饱和键的羧酸化合物，其优选为具有12至20个碳原子和0至5个不饱和键的羧酸化合物，更优选为具有16至18个碳原子和0至3个不饱和键的羧酸化合物。

1,3-二酰基甘油和脂肪酸的获得可使用本技术领域所熟知的任何萃取和分离方法，例如Folch等人(The Journal of biological Chemistry,1956,23:497-509.)、Balasubramanian等人(Bioresource Technology,2011,102:3396-3403.)和Sajilata等人(Journal of Food Engineering,2008,84:321–326)的方法。简而言的，所述方法可包含将细胞以如研磨法或超音波法等方式击碎，藉由适当的溶剂萃取细胞中的1,3-二酰基甘油或脂肪酸，再藉由如HPLC和/或离子交换树脂的技术获得1,3-二酰基甘油或脂肪酸。

本文所述的所有公开案、专利和专利文献均以全文引用的方式并入本文中。

提供以下实例以辅助熟习此项技术者实施本发明。即使如此，不应将所述等实例视为本发明的限制，因为本发明所属技术领域中具有通常知识者在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行的修改和变化，而仍属于本发明的范围。

实施例

材料与方法

1.培养基配方

(1)C培养基

依序加入15mg的Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg的KNO₃、5mg的β-甘油磷酸二钠·5H₂O、4mg的MgSO₄·7H₂O、0.01μg的维生素B12、0.01μg的生物素(Biotin)、1μg的噻胺HCl、0.3mL的PIV金属与50mg的Tris，随后将其体积补水至100mL，调整pH至7.5后进行高压灭菌。若为1.5％洋菜固体培养基则需加入15g的洋菜胶一同灭菌。

PIV金属的配制为依序加入100mg的Na₂EDTA·2H₂O、19.6mg的FeCl₃·6H₂O、3.6mg的MnCl₂·4H₂O、1.04mg的ZnCl₂、0.4μg的CoCl₂·6H₂O与0.25μg的Na₂MoO₄·2H₂O，随后将其体积补水至100mL后进行高压灭菌。

2 采集藻样、单离与培养

取台湾彰化永靖的养殖鱼池的水样品约10ml置于50ml的离心管中，加入约30ml的C培养基，于25℃照光培养。培养期间以显微镜观察是否有藻体生长，然后取出适量含藻体的培养液，将其转至平板培养基，于25℃照光培养。待藻体生长后取单一藻种将其于平板培养基中涂开，以上步骤需重复至筛到单一藻体为止。平板培养则取单一藻落涂至C平板培养基，于25℃照光培养。大量培养则自平板刮取下新鲜培养的单一藻体，添加至C液态培养基中，使其添加藻体后的培养液OD₆₈₂nm值约达0.1～0.15，于25℃照光充气培养。

3.油脂染色分析

将培养好的藻体取20μl与1μl Nile Red(于二甲基亚砜中0.1mg/mL)混合以进行油滴染色，染色后于室温静置5分钟，再利用荧光显微镜进行观察。(Chen,W.et al.,2009.Ahigh throughput Nile red method for quantitative measurement of neutrallipids in microalgae.Journal of Microbiological Methods 77:41–47和Huang,G.H.,et al.,2009.Rapid screening method for lipid production in alga based on Nilered fluorescence.Biomass and bioenergy 33:1386-1392)。

4.藻种的分子鉴定

藻体基因体(genomic)DNA的抽取：自平板刮取下新鲜培养的藻体，将其收集在2ml微量离心管，以200μl EB(1M NaCl、70mM Tris、30mM Na₂EDTA)溶液冲洗、离心后，再加入400μl EB溶液复溶藻体，随后加入适量的玻璃砂，以撞击式细胞破碎仪(MM400)振荡约5分钟，重复两次至藻体破裂均质后，加入10μl的RNAase于37℃作用30分钟，依序加入50μl的10％CTAB与400μl的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)震荡3分钟，以13,000rpm于4℃离心10分钟，取上清液至另一新离心管中，再以400μl的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合震荡3分钟，重复离心过程将上清液至另一新离心管中，加入等体积的2-丙烯醇混合，置于-30℃中30分钟以上，再以13,000rpm转速于4℃下离心15分钟，去掉上清液，将沉淀物以70％EtOH清洗、风干后，以50μl ddH₂O复溶此基因体DNA沉淀物。

PCR增幅与定序分析：将藻体基因体DNA作为PCR模板，以18S rRNA与ITS区域(包含18S核糖体RNA的後端、内转录间隔区1、5.8S核糖体RNA、内转录间隔区2與28S核糖体RNA的前端等序列)的相关引子组来增幅其基因片段。PCR反應溶液如下：取適量的基因体DNA溶液作為PCR模板，於含8μl的10mM dNTP、10μl的10X PCR緩衝液、10pmole的5′端引子和3′端引子与5U Taq酵素。PCR反應條件為95℃，3分鐘；(95℃，30秒、50℃，30秒、72℃，2分鐘30秒)共30次循環；72℃，10分鐘；最後保持在4℃。取5μl产物进行电泳跑胶分析。将PCR产物纯化后以适当引子进行定序，将序列结果以Vector NTI Suite 9软件(VNTI)与NCBI/Blastn进行序列重组与序列相似性比对分析。

5.藻体分析

(1)藻体含油量的分析：参考修饰Folch等人的方法(Folch,J.et al.,1956.Asimple method for the isolation and purification of total lipids from animaltissue.The Journal of biological Chemistry 23:497-509)来进行，其过程为取30mg冷冻干燥的藻粉(A值)至2ml微量离心管，加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)与适量大颗玻璃珠，以撞击式细胞破碎仪(MM400)振荡约5分钟，重复两次。以10,000rpm离心5分钟后，取上清液到抛弃式15ml离心管中，随即于2ml微量离心管内加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)，再以超音波振荡与离心，取上清液到抛弃式15ml离心管中，直到萃取液无色为止。于装有萃取液的15mL离心管中加入等体积的145mM NaCl溶液后，以摩天轮混和均匀后，经4,500rpm离心10分钟，以玻璃吸管取下层液体到已秤重的玻璃瓶(B值)中。将此玻璃瓶内液体隔夜风干再秤重(C值)，计算藻干含油量的百分比(D值)。藻干含油量计算公式:(C-B)/Ax100＝D％。

(2)脂肪酸图谱分析方法：刮取适量干燥藻体置于玻璃试管中，加入1mL溶液1(NaOH 45g、甲醇150mL和ddH₂O 150mL)，震散藻体。于100℃加热5分钟，再将所有藻体震散，续加热25分钟。加入2mL溶液2(6N HCl 325mL和甲醇200mL)，于80℃加热10分钟，完成后迅速冷却。加入1.25mL溶液3(己烷200mL、三级丁基甲基醚200mL)，缓慢混合10分钟，以玻璃吸管尖吸取下层液体并丢弃。将上层液体加入3mL溶液4(NaOH 10.8g、ddH₂O 900mL)，混合5分钟后，吸取上层液体以GC/MS(HP 5973GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法参考2007年Valencia,I.等人的方法(Valencia,I.et al.,2007.Development of dryfermented sausages rich in docosahexaenoic acid with oil from the microalgaeSchizochytrium sp.:Influence on nutritional properties,sensorial quality andoxidation stability.Food Chemistry104:1087-1096)，GC/Mass分析条件为：毛细管管柱：SP-2560,75m x 0.18mm I.D.,0.14μm。注入口温度：Inj,250℃。离子源温度：FID,250℃。管柱烘箱温度：起始温度140℃，保持5分钟后以4℃/min的升温速率升温至240℃，保持2分钟。载送气体：He。管柱流量：40cm/sec@175℃。注射:1μL。分裂比：1/100。脂肪酸标准品：37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,Sigma-Aldrich)。设定好条件后，先分析标准品确认图谱正确后再进行样品分析。分析完成的结果整理在表格中以方便比对。

(3)油脂组成分析：将抽取的藻油样品以HPLC分析其油脂组成，HPLC分析条件：分离管柱为德国Merck公司制造的Silica gel(4.6mm id×250mm,颗粒大小5μm)；冲提溶剂A：己烷；冲提溶剂B：己烷/乙酸乙酯/异丙醇＝80：10：10(v/v)，在0分钟溶剂A/B＝98：2(v/v)，在8分钟线性增加至溶剂A/B＝50：50(v/v)，在8.5分钟线性增加至溶剂A/B＝2：98(v/v)，15分钟维持相同梯度，20分钟线性减少至溶剂A/B＝98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸发光散射检测器(ELSD；Evaporative Light Scattering Detector)条件；气体流量2.6L/min；蒸发器温度：40℃(詹国靖等人，以甘油与植物油利用脂解酶的转酯化反应生产1,3-双酰甘油。台湾农化与食品科学，45:19-25(2010))。

6.藻种培养特性分析

(1)培养温度的测试：自平板刮取下藻体，悬浮于适量C培养液中，测量其OD₆₈₂nm值并将2ml藻液转至12孔培养盘内放入含10％二氧化碳的密封袋中，以不同温度20℃、30℃与37℃进行照光培养，的后于培养第7天与14天量测其OD₆₈₂nm值。

(2)不同二氧化碳浓度对藻体生长的影响：将藻体培养液添加至1L含C培养液的培养瓶中，再以0.1vvm的条件，分别通入空气(0.04％二氧化碳)和5％二氧化碳气体(95％空气)，在30℃下照光培养14天，比较在不同二氧化碳浓度下，记录藻体干重变化和藻株生长和产油效率的差异。藻体干重的量测：取100mL藻液，以5,000rpm离心20分钟后去除上清液，利用去离子水将沉淀的藻体悬浮，洗去残留的盐类后，再以5,000rpm离心20分钟后去除上清液，离心收集的藻体置于-80℃冷冻库中进行预冷。完成预冷程序后至冷冻干燥机进行冷冻干燥，约72小时后，将完成冻干的藻体称重，记录干重(WA)，并进行藻体含油量、脂肪酸图谱和油脂组成分析。

(Chisti,Y.2008.Biodiesel from microalgae beats bioethanol.TrendsBiotechnol.26:126-131.)

(3)藻油生产的诱导培养：第一阶段取适量新鲜藻液接种至装有900ml C培养基的1L血清瓶中，使其初始OD₆₉₀nm值为0.1，以30℃、0.5vvm空气和2,000lux的条件培养14天。第二阶段于培养基中分别加入油脂生产诱导因子(NaOH其最终浓度为1mM)，再以相同条件培养7天，进行藻体干重和藻体含油量的分析(Nayak,M.,et al.,2013.Maximizing BiomassProductivity and CO₂Biofixation of Microalga,Scenedesmus sp.by Using SodiumHydroxide.J.Microbiol.Biotechnol.23:1260-1268)。

实例一、藻株的鉴定

于台湾彰化永靖的鱼池水样品，分离纯化得到藻株FP-7MA。以1,000X显微镜观察，此藻以非群聚的单一藻体存在，此藻细胞中央部分略凹陷，细胞两端为钝型非细尖型并朝同一方向弯曲似肾形，细胞长约为10～15μm，宽约为5～8μm(图1A)。以Nile Red染色后，以荧光显微镜观察到藻体内部有大量明显且呈现黄色的油滴分布，显示其藻体内可以蓄积油滴(图1B)。

将FP-7MA的18S序列(SEQ ID NO:1)与NCBI的nr数据库比对，得到前4笔相似度最高的序列分别是来自(1)Ankistrodesmus gracilis(Acession no.AB917098.1)，相似度为99％。(2)Ankistrodesmus gracilis(Acession no.Y16937.1)，相似度为99％。(3)Raphidocelis subcapitata SAG12.81(Acession no.KF673369.1)，相似度为99％。(4)Monoraphidium sp.FXY-10(Acession no.JQ809706.1)，相似度为99％。由以上DNA序列比对结果显示FP-7MA藻株可能是Ankistrodesmus或Raphidocelis或Monoraphidium藻属。再经由FP-7MA藻株的形态特征比对，发现与Raphidocelis subcapitata SAG 12.81较相近，而与Ankistrodesmus gracilis和Monoraphidium sp.FXY-10在形态上差异较大。

将FP-7MA的ITS序列(SEQ ID NO:2)与NCBI的nr数据库比对，得到前5笔相似度最高的序列分别是来自(1)Nephrochlamys subsolitaria(Acession no.AB917131.1)，相似度为94％。(2)Scenedesmus regularis isolate DRL2(Acession no.JX138999.1)，相似度为94％。(3)Monoraphidium sp.KMMCC 1531(Acession no.JQ315786.1)，相似度为92％。(4)Scenedesmus sp.GUBIOTJT116(Acession no.KF471115.1)，相似度为90％。(5)Ankistrodesmus sp.RS-2012(Acession no.JX456463.1)，相似度为90％。以上ITS序列比对结果显示FP-7MA藻株与Nephrochlamys subsolitaria、Scenedesmus regularisisolate DRL2、Monoraphidium sp.KMMCC 1531、Scenedesmus sp.GUBIOTJT116和Ankistrodesmus sp.RS-2012等藻种的相似度皆小于为95％，显示FP-7MA藻株与以上藻种的差异度很大；而Raphidocelis subcapitata SAG 12.81藻种ITS区域的DNA序列尚未发表于公开数据库上，所以FP-7MA藻株的ITS序列无法与其比对。

FP-7MA藻株的形态为肾形，以非群聚的单一藻体存在，较接近Raphidocelissubcapitata SAG 12.81，综合DNA序列与形态特征的分析比对，初步鉴定FP-7MA藻株为Raphidocelis sp.。

FP-7MA藻株已根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2015年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center For Type Culture Collection(CCTCC),中国武汉大学)，保藏编号为CCTCC M 2015030。

实例二、FP-7MA藻株的培养特性分析

(1)培养温度的测试：将2mL藻液(C培养基)转至12孔培养盘内放入含10％二氧化碳的密封袋中，以不同温度20℃、30℃与37℃进行照光培养，的后于培养第7天与14天量测其OD_682nm值。图2显示FP-7MA于20℃和30℃培养温度中OD_682nm值可从0.219提高至0.574和0.402，藻体可持续生长。另外于37℃温度培养下，其OD_682nm值从0.219降至0.096藻体生长受到抑制。

(2)不同二氧化碳浓度对藻体生长的影响：将FP-7MA藻液在30℃的1L含C培养液中照光培养，并在0.1vvm条件下，分别通入空气(二氧化碳含量为0.04％)或含5％二氧化碳气体。经过14天后，测量通入空气和5％二氧化碳的藻株的藻体干重和含油量。其结果显示于表1。

表1

表1的结果显示藻体干重则在培养时通入5％二氧化碳条件下达到1,584mg/L，为通入空气的条件下的藻体干重(360mg/L)的4.4倍。而藻体含油量在通入5％二氧化碳后则由34.75％降至23.37％。在培养时通入5％二氧化碳条件下的生物质产率、油脂产率和二氧化碳固定率分别可达113.19mg/L/天、26.46mg/L/天和212.80mg/L/天。而通入空气条件下的生物质产率、油脂产率和二氧化碳固定率分别可达25.71mg/L/天、8.97mg/L/天和48.34mg/L/天。故相较于以空气培养，FP-7MA的藻液以5％二氧化碳通气培养可以分别增加其生物质产率4.4倍、油脂产率2.9倍和二氧化碳固定率4.4倍。此结果显示FP-7MA的藻液在照光下以C培养基并通入二氧化碳培养，可以显著增进其生物质产率、藻油产率和二氧化碳固定率。

其次，表2的结果显示，通入空气和5％二氧化碳亦会影响藻株的脂肪酸组成，并发现脂肪酸组成中的主要的成分为碳链为C16和C18的脂肪酸，其分别占总脂肪酸含量的84.9％和91.34％。经计算后，其DU(Dgree of Unsaturation)值分别为110.8和112.38，其皆小于137，符合欧盟的生物柴油标准(Ramos et al.,2009.Influence of fatty acidcomposition of raw materials on biodiesel properties.Bioresour.Technol.100:261-268)，故适合做为提炼生物柴油的原料。由以上的结果可发现，通入5％二氧化碳气体有助于FP-7MA藻株生产生物柴油；而FP-7MA藻株的二氧化碳固定率可高达212.80mg/L/天，显示其具有降低大气二氧化碳的潜力。

表2

注：ND：低于可侦测的极限

DU：不饱和程度(Degree of Unsaturation)＝(单不饱和,w％+2(多不饱和,w％)(Ramos,M.J.,et al.,2009.Influence of fatty acid composition of raw materialson biodiesel properties.Bioresour.Technol.100:261-268)

此外，分析分别通入空气或5％二氧化碳的藻株的油脂组成后，发现以空气培养藻株的三酸甘油酯(TAG)、1,3-二酰基甘油(1,3-DAG)、单酰基甘油(MAG)和游离脂肪酸(FA)的含量分别为49.08％、48.56％、2.14％和4.96％；而以5％二氧化碳培养藻株的三酸甘油酯(TAG)和1,3-二酰基甘油(1,3-DAG)的含量则分别为94.57％和5.43％，且其中并未检测到单酰基甘油(MAG)和游离脂肪酸(FA)(表3)。由以上的结果显示FP-7MA藻株以空气或5％二氧化碳培养藻株的油脂组成皆适合做为生产生物柴油的原料。FP-7MA藻株以空气培养的1,3-二酰基甘油(1,3-DAG)含量高达48.56％，是目前发现唯一可合成1,3-二酰基甘油的藻种，将可应用于生产1,3-二酰基甘油健康油脂。

表3

注:TAG：三酸甘油酯；FA：脂肪酸；1,3-DAG：1,3-二酰基甘油；MAG：单酰基甘油:；Nd：低于可侦测的极限

(3)藻油生产的诱导培养：FP-7MA藻株先以C培养基在30℃通空气培养14天后，再以含有1mM NaOH诱导剂的培养基培养7天，以诱导藻油的生产。结果如表4所示，以1mM NaOH诱导的藻体干重达240mg/L，藻油含量占藻体干重的54.5％；对照组的藻体干重为230mg/L，藻体含油量占藻体干重的38.2％。故相较于对照组，以1mM NaOH诱导剂处理的藻体中，藻油含量可增加1.43倍。此说明1mM NaOH可以应用在量产FP-7MA藻株，做为产油的诱导因子，以提升藻油的产量。

表4

结论

本发明首先发现经初步鉴定为Raphidocelis sp.的新颖的微藻FP-7MA分离株。此藻株的干燥藻体的含油量在23.37％以上，且经由1mM NaOH诱导后，其含油量可以增达54.5％。FP-7MA藻株以空气培养，其1,3-二酰基甘油含量占油脂组成的48.56％，为目前发现唯一会生成1,3-二酰基甘油的藻种，故可应用于生产1,3-二酰基甘油健康油脂。FP-7MA藻株在通入5％CO₂下培养14天，所得到的生物质产率(113.19mg/L/day)和油脂产率(26.46mg/L/day)皆比以通空气培养方式产率高，其油脂组成以三酸甘油酯为主(占94.57％)，而且脂肪酸组成以C16～C18的脂肪酸为主，其DU值为112.38，以上的结果显示FP-7MA藻株适合做为提炼生物柴油的原料。FP-7MA藻株在通入5％CO₂下培养14天，得到的二氧化碳固定率为212.8mg/L/天，可做为减碳的工具。由以上的结果显示，Raphidocelissp.FP-7MA藻株为一新颖微藻，可以做为生产1,3-二酰基甘油健康油脂和生物柴油的原料，也可以用作固定二氧化碳来减少大气中二氧化碳含量的工具，故其在生物能源、健康油脂和减碳领域上皆扮演重要的角色。

Claims (16)

1.一种微藻(Raphidocelis sp.)分离株，其为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2015030的菌株。

2.一种制备微藻培养产物的方法，其包含将根据权利要求1的微藻分离株接种于液态培养基中，且温度在15℃至35℃、照光和通气下进行培养以获得所述培养产物。

3.根据权利要求2的方法，其中所述液态培养基中进一步含有0.5mM至2mM的NaOH。

4.根据权利要求3的方法，其中所述液态培养基中NaOH的含量为1mM。

5.根据权利要求2或3的方法，其中所述温度为20℃至30℃。

6.根据权利要求2或3的方法，其中所述照光量为100lux至4,000lux。

7.根据权利要求2或3的方法，其中所述通气量为0.05vvm至1vvm。

8.根据权利要求2或3的方法，其中所述通气中二氧化碳的含量为0.04％至10％。

9.根据权利要求8的方法，其中所述通气中二氧化碳的含量为5％。

10.根据权利要求2或3的方法，其进一步包含分离所述培养产物的步骤。

11.根据权利要求2至4中任一权利要求的方法，其用于固定二氧化碳。

12.一种微藻培养产物，其由根据权利要求2至10中任一权利要求的方法来获得。

13.一种制备1,3-二酰基甘油的方法，其包含自根据权利要求12的微藻培养产物中分离出1,3-二酰基甘油。

14.一种制备脂肪酸的方法，其包含自根据权利要求12的微藻培养产物中分离出脂肪酸。

15.根据权利要求14的方法，其中所述脂肪酸具有8至30个碳原子和0至6个不饱和键。

16.根据权利要求15的方法，其中所述脂肪酸具有16至18个碳原子和0至3个不饱和键。