BR112015024308B1 - Método para a produção de polissacarídeos e método para a produção de um composto orgânico - Google Patents
Método para a produção de polissacarídeos e método para a produção de um composto orgânico Download PDFInfo
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Abstract
MICROALGAS DO GÊNERO EUGLENA, MÉTODO PARA PRODUZIR POLISSACARÍDEOSE MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO ORGÂNICO A presente invenção refere-se a microalgas do gênero Euglena que se inserem sob a cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou uma sua cepa mutante as quais são capazes de produzir pelo menos polissacarídeos. É adicionalmente proporcionado um método para produzir polissacarídeos incluindo: cultivar microalgas do gênero Euglena que se inserem sob a cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou a sua cepa mutante e que são capazes de produzir pelo menos polissacarídeos como organismos de produção de polissacarídeos para produzir os polissacarídeos. É adicionalmente proporcionado um método para produzir um composto orgânico incluindo: cultivar microalgas do gênero Euglena que se inserem sob a cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou uma sua cepa mutante e que são capazes de produzir pelo menos polissacarídeos para produzir pelo menos um composto orgânico selecionado a partir do grupo que consiste de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos e proteínas.
Description
[001] O presente pedido reivindica prioridade ao pedido de patente japonesa No. 2013-067558, o relatório descritivo do qual se encontra aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[002] A presente invenção se refere as microalgas do gênero Euglena, um método para produzir polissacarídeos, e um método para produzir um composto orgânico.
[003] Microalgas do gênero Euglena são também chamadas de Euglena, e são conhecidas como microorganismos que produzem polissacarídeos tal como paramilo ou semelhante por serem cultivadas.
[004] Várias microalgas do gênero Euglena são convencionalmente conhecidas.Por exemplo, Euglena gracilis cepa NIES-48 é conhecida (Literatura de Patente 1).
[005] As referidas microalgas do gênero Euglena produzem polissacarídeos tais como paramilo por serem cultivados, e armazenam os polissacarídeos em suas células.
[006] Adicionalmente, as microalgas do gênero Euglena podem converter os polissacarídeos armazenados em ésteres de cera ou podem adicionalmente produzir proteínas ao mesmo tempo em que produzem os polissacarídeos, dependendo das condições de cultura.Então, os compostos orgânicos tal como polissacarídeos, lipídeos, e proteínas que são produzidos e armazenados nas células das microalgas podem ser usados em aplicações tais como combustível e alimentação.
[007] Entretanto, as microalgas do gênero Euglena têm um problema de que o desempenho para produzir um composto orgânico tal como polissacarídeos não é necessariamente suficiente.
[008] Lista de Referências
[009] Literatura de Patente
[010] Literatura de Patente 1: JP H07-070207 A
[011] Sumário
[012] Problema Técnico
[013] Em vista do dito acima e de outros problemas, é um objetivo da presente invenção proporcionar microalgas do gênero Euglena que são capazes de suficientemente produzir pelo menos polissacarídeos.É outro objetivo da presente invenção proporcionar um método para produzir polissacarídeos que permite que os polissacarídeos sejam suficientemente obtidos.É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar um método para produzir um composto orgânico que permite que pelo menos um composto orgânico selecionado a partir do grupo que consiste de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos, e proteínas seja suficientemente obtido.
[014] Solução para o problema
[015] De modo a solucionar o problema acima mencionado, microalgas do gênero Euglena de acordo com a presente invenção são caracterizadas por serem Euglena gracilis cepa EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou a sua cepa mutante e sendo capaz de produzir pelo menos polissacarídeos.
[016] Um método para produzir polissacarídeos de acordo com a presente invenção é caracterizado por cultivar microalgas do gênero Euglena que se inserem sob a cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou a sua cepa mutante e que são capazes de produzir pelo menos polissacarídeos como organismos de produção de polissacarídeos para produzir os polissacarídeos.
[017] De acordo com um aspecto do método para produzir polissacarídeos da presente invenção, um caldo usado na cultura pode conter 15 a 30 g/L de glicose.
[018] De acordo com outro aspecto do método para produzir polissacarídeos da presente invenção, o caldo usado na cultura pode conter lisado de levedura.
[019] De acordo com ainda outro aspecto do método para produzir polissacarídeos da presente invenção, o caldo usado na cultura pode ter uma composição de meio de cultura AF6.
[020] De acordo ainda com outro aspecto do método para produzir polissacarídeos da presente invenção, os polissacarídeos podem ser paramilo.
[021] Um método para produzir um composto orgânico de acordo com a presente invenção é caracterizado por cultivar microalgas do gênero Euglena que se inserem sob a cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou a sua cepa mutante e que são capazes de produzir pelo menos polissacarídeos para produzir pelo menos um composto orgânico selecionado a partir do grupo que consiste de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos e proteínas.
[022] A Figura 1 é uma tabela de comparação para a sequência de base do gene de 18S rRNA de Euglena gracilis.
[023] A Figura 2 é uma árvore filogenética construída usando o gene de 18S rRNA.
[024] A Figura 3A é uma imagem que mostra um padrão de banda em análise RAPD.
[025] A Figura 3B é uma imagem que mostra um padrão de banda em análise RAPD.
[026] A Figura 3C é uma imagem que mostra um padrão de banda em análise RAPD.
[027] A Figura 4 é um gráfico que mostra a conversão de glicose de microalgas e o peso seco de microalgas em cultura heterotrófica.
[028] A Figura 5 é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e o peso seco de microalgas em cultura fotoheterotrófica.
[029] A Figura 6 é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e o peso seco de microalgas em cultura fotoheterotrófica usando meio de cultura sob diferentes condições de pH.
[030] A Figura 7 é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e o peso seco de microalgas em cultura fotoheterotrófica usando meio de cultura sob diferentes condições de pH.
[031] A Figura 8A é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e o teor de paramilo por célula quando as condições mudam a partir de aeróbica para anaeróbica em cultura fotoheterotrófica.
[032] A Figura 8B é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e a quantidade de paramilo por caldo quando as condições mudam a partir de aeróbica para anaeróbica em cultura fotoheterotrófica.
[033] A Figura 9A é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e o teor de lipídeo por célula quando as condições mudam a partir de aeróbica para anaeróbica em cultura fotoheterotrófica.
[034] AFigura 9B é um gráfico que mostra um período de cultura de microalgas e a quantidade de lipídeo por caldo quando as condições mudam a partir de aeróbica para anaeróbica em cultura fotoheterotrófica. Descrição das Realizações
[035] Daqui em diante, uma modalidade de microalgas do gênero Euglena de acordo com a presente invenção é descrita em detalhes.
[036] As microalgas do gênero Euglena de acordo com a presente modalidade (daqui em diante, simplesmente referida como microalgas do gênero Euglena ou microalga) são da cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de acesso FERM BP-11530) ou a sua cepa mutante e que são capazes de produzir pelo menos polissacarídeos.
[037] As microalgas do gênero Euglena da presente modalidade têm um efeito de permitir que pelo menos polissacarídeos sejam suficientemente produzidos.
[038] As microalgas do gênero Euglena são organismos que habitam ao mesmo tempo em que flutuam na água.Adicionalmente, as microalgas do gênero Euglena são microalgas unicelulares com um tamanho de cerca de 10 μm a 50 μm, que difere dependendo das cepas.
[039] As propriedades das microalgas do gênero Euglena são descritas em detalhes abaixo.
[040] As propriedades morfológicas das microalgas do gênero Euglena
[041] As células vegetativas das microalgas do gênero Euglena têm flagelos e se movem ativamente.Adicionalmente, cada célula tem um formato quase fusiforme. A célula inclui uma organela vermelha chamado de ocelo além de organelas gerais tais como o núcleo, cloroplastos, e mitocôndrias.
[042] As propriedades fisiológicas ou bioquímicas das microalgas do gênero Euglena
[043] (1) Meio de cultura: um caldo principalmente composto de água fresca pode ser usado para o desenvolvimento (matéria orgânica derivada a partir de água de refugo também pode ser usada para o desenvolvimento).
[044] (2) Capacidade fotossintética: o desenvolvimento Fotoautotrófico por fotossíntese é possível.
[045] (3) pigmentos contidos: Clorofila a, clorofila b, e outros carotenoides são contidos.
[046] (4) Substâncias de armazenamento anabólicas: Proteínas, lipídeos (ésteres de cera), e polissacarídeos (paramilo)
[047] (5) faixa de temperatura de crescimento: 15°C a 35°C (temperatura ótima: 25°C)
[048] (6) faixa de pH adequada para o crescimento: pH 3.5 a 5.5 (entretanto, crescimento é possível um pH fora da faixa acima mencionada)
[049] Informação genética de microalgas do gênero Euglena
[050] As microalgas do gênero Euglena têm o 18S rDNA (gene 18S rRNA) representado pela Sequência No. 1.
[051] O gene de 18S rRNA pode ser analisado por um método comumente usado como um método para identificar microalga. Especificamente, o gene de 18S rRNA pode ser analisado, por exemplo, por um método descrito em EXEMPLOS.
[052] A sequência de base do gene de 18S rRNA das microalgas do gênero Euglena pode ser comparada com a sequência de base do gene de 18S rRNA de microalgas conhecidas do gênero Euglena obtidas a partir de GenBank usando a pesquisa de homologia BLAST. Os resultados da comparação com as microalgas conhecidas do gênero Euglena na homologia de sequência de grau correspondente será mostrada nos EXEMPLOS abaixo.
[053] No banco de dados, EMBL e DDBJ pode ser também usado, por exemplo.
[054] Adicionalmente, uma árvore filogenética molecular pode ser construída usando um software de desenho de árvore filogenética molecular Mega 5 program (Tamura et al., 2011, Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739) pelo método de máxima probabilidade.A árvore filogenética molecular construída será mostrada em detalhes nos m EXEMPLOS abaixo.
[055] Usando a técnica como descrita acima, as microalgas do gênero Euglena acima mencionadas foram identificadas a partir dos últimos resultados descritos nos EXEMPLOS as Euglena gracilis e nomeado cepaEuglena gracilis EOD-1.
[056] A cepa Euglena gracilis EOD-1 foi internacionalmente depositada no Organismo de Depósito de Patentes, NaçãoalInstituteof Technology and Evaluação (NITE-IPOD: 2-5-8-120 Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba 292-0818 Japan) em 28 de Junho de 2013 (data original de depósito: 25 de março de 2013) como No. de acesso FERM BP-11530 sob as provisões do Budapest Treaty.
[057] Como foi descrito acima, as microalgas do gênero Euglena têm cloroplastos em suas células, e portanto podem se desenvolver para a fotossíntese. Ou seja, as microalgas do gênero Euglena são fotoautotróficas.
[058] Adicionalmente, as microalgas do gênero Euglena podem se desenvolver também por usar nutrientes orgânicos tal como glicose os seus nutrientes.Ou seja, as microalgas do gênero Euglena são também heterotróficas.
[059] Desse modo, as microalgas do gênero Euglena podem se desenvolver apenas por fotoautotrofia, podem se desenvolver apenas por heterotrofia, ou podem se desenvolver por concomitante fotoautotrofia e heterotrofia.
[060] A cepa mutante é produzida, por exemplo, por aplicar um processo de mutação comum, adaptação por subcultura, ou mutação natural.
[061] O processo de mutação pode ser realizado usando mutagênico comum.Exemplos do mutagênico incluem os fármacos tendo atividade mutagênica e raios ultravioleta.Exemplos de fármacos tendo atividade mutagênica incluem análogos com base em nucleotídeo tal como estreptomicina, ofloxacina, sulfonato de etil metano, e N- metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, e bromouracila, e acridinas.
[062] Em seguida, uma modalidade do método para produzir polissacarídeos de acordo com a presente invenção é descrita.
[063] De acordo com o método para produzir polissacarídeos da presente modalidade, pelo menos polissacarídeos são produzidos por cultivar as microalgas do gênero Euglena.
[064] O método para produzir os polissacarídeos da presente modalidade tem um efeito de permitir que os polissacarídeos sejam suficientemente obtidos.
[065] Especificamente, o método para produzir polissacarídeos da presente modalidade inclui uma etapa de cultura de cultivar as microalgas do gênero Euglena em um caldo contendo pelo menos água.
[066] O caldo preferivelmente contém água e nutrientes que promovem o crescimento da microalga.
[067] Exemplos de nutrientes incluem nutrientes inorgânicos e nutrientes orgânicos.
[068] Exemplos dos nutrientes inorgânicos incluem compostos inorgânicos contendo nitrogênio e compostos inorgânicos contendo fósforo. Adicionalmente, exemplos dos nutrientes inorgânicos incluem íon de potássio, íon de ferro, íon de manganês, íon de cobalto, íon de zinco, íon de cobre, íon de molibdênio, e íon de níquel.
[069] A concentração dos nutrientes inorgânicos no caldo é em geral cerca da concentração, ou seja, comumente conhecida.
[070] Exemplos de nutrientes orgânicos incluem monossacarídeos tal como glicose e frutose, vitaminas tal como vitaminas B6 e B12, amino ácidos tal como arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, e histidina, ácidos orgânicos tal como ácido málico, ácido cítrico, ácido succínico, e ácido acético, e álcoois tal como etanol.
[071] Exemplos da composição do caldo a ser empregada incluem uma composição de "Meio de cultura AF-6", a composição de "Meio de cultura Cramer- Myers", uma composição de "Meio de cultura Hutner", que será descrita abaixo, ou a composição similar às referidas composições.
[072] Na etapa de cultura, o caldo preferivelmente contém 15 a 30 g/L de glicose como uma fonte de carbono.Adicionalmente, o caldo preferivelmente contém lisado de levedura (que será descrito abaixo).Adicionalmente, o caldo preferivelmente tem uma composição de meio de cultura AF6.
[073] A etapa de cultura pode ser realizada, por exemplo, em um banho contendo uma mistura do caldo acima mencionado e a microalga.
[074] Na etapa de cultura, a fotossíntese das microalgas pode ser causada por irradiar as microalgas com luz.Ou seja, na etapa de cultura, a cultura fotoautotrófica pode se dióxido de carbonor realizada.
[075] Quando as microalgas são irradiadas com luz na etapa de cultura, as microalgas introduzem dióxido de carbono em suas células por fotossíntese, e podem se desenvolver ao mesmo tempo em que produzem pelo menos polissacarídeos tal como paramilo.Adicionalmente, as microalgas podem se desenvolver ao mesmo tempo em que produzem proteínas e metabólitos secundários tal como lipídeos, pigmentos, e vitaminas.
[076] A luz com a qual as microalgas são irradiadas na etapa de cultura não é especificamente limitada desde que cause a fotossíntese da microalga.Como a luz, a luz natural a partir do sol ou luz artificial tal como iluminação é, por exemplo, empregada.
[077] A intensidade da irradiação da luz na etapa de cultura fotoautotrófica não é especificamente limitada, mas é em geral 50 μmol/m2^s a 200 μmol/m2^s.
[078] Na etapa de cultura, um período durante o qual as microalgas são irradiadas com luz e um período durante o qual as microalgas não são irradiadas com luz pode ser alternadamente repetido.
[079] Ou seja, um período durante o qual a cultura fotoautotrófica é realizada e um período durante o qual a cultura fotoautotrófica não é realizada pode ser alternadamente repetido na etapa de cultura.
[080] O período de irradiação da luz na etapa de cultura é em geral 8 horas a 15 horas, que é equivalente a durante o dia no qual a luz do sol brilha.Adicionalmente, o período de condições de escuro durante o qual a irradiação da luz não é realizada para inibir a fotossíntese das microalgas é em geral 9 horas a 16 horas, que é equivalente a noite durante o qual a luz do sol não brilha. Os referidos períodos podem ser mudados dependendo da situação ou do fim.
[081] As condições de escuro nas quais a irradiação da luz não é realizada são as condições nas quais a densidade de fluxo de fóton fotossintético (PPFD) é 50 μmol/m2^s ou menos.
[082] Nesse meio tempo, cultura heterotrófica na qual as microalgas são cultivadas na presença de nutrientes orgânicos incluídos nos nutrientes acima mencionados pode ser realizada na etapa de cultura.Quando as microalgas são cultivadas na presença de nutrientes orgânicos na etapa de cultura, as microalgas introduzem os nutrientes orgânicos em suas células, e podem se desenvolver ao mesmo tempo em que produzem pelo menos polissacarídeos tal como paramilo.
[083] Ou seja, pelo menos uma de cultura fotoautotrófica e de cultura heterotrófica pode ser realizada na etapa de cultura.
[084] É preferível que não só a cultura fotoautotrófica mas também a cultura heterotrófica sejam realizadas na etapa de cultura ao mesmo tempo, em que o crescimento das microalgas pode ser adicionalmente promovido. Ou seja, é preferível que a cultura fotoheterotrófica seja realizada na etapa de cultura.
[085] É preferível se empregar, como os nutrientes orgânicos usados na cultura heterotrófica e na cultura fotoheterotrófica, álcoois tal como etanol, monossacarídeos tal como glicose e frutose, ou refugos contendo os referidos componentes que podem ser usados pelas microalgas do gênero Euglena, por exemplo.Adicionalmente, é preferível que a levedura ou o lisado de levedura (daqui em diante, referido também como o extrato de levedura) ser usado em combinação como os nutrientes orgânicos, em que o crescimento das microalgas do gênero Euglena pode ser mais confiavelmente promovido.
[086] Exemplos de materiais contendo pelo menos a parte dos nutrientes orgânicos acima mencionados incluem bebidas fermentadas, bebidas destiladas, borras de sake, borras de shochu, melaço, e melaço.As referidas bebidas alcoólicas podem ser usadas como uma fonte de fornecimento de nutrientes orgânicos na cultura heterotrófica e cultura fotoheterotrófica.
[087] As bebidas fermentadas são produzidas por fermentação alcoólica de um material bruto contendo teor de açúcar com levedura, e não são destiladas.
[088] As bebidas fermentadas não são destiladas, e contêm metabólitos de fermentação alcoólica com levedura.Portanto, as mesmas contêm nutrientes incluindo sacarídeos tal como glicose produzidas por levedura, proteínas, amino ácidos, vitaminas, fósforo, e potássio, além de etanol e água.
[089] Exemplos das bebidas fermentadas incluem cerveja, sake, vinho, uma bebida fermentada usando grãos tais como material bruto, a bebida fermentada usando legumes como um material bruto, a bebida fermentada usando batatas como um material bruto, e a bebida fermentada usando açúcar como um material bruto.
[090] A cerveja é produzida por sacarificação do amido contido em pelo menos malte com enzima contida no malte, desse modo produzindo açúcar, seguido por fermentação alcoólica do açúcar com levedura de cerveja.Ou seja, a cerveja nessa descrição inclui produtos adicionalmente usando outros materiais brutos, desde que os mesmos sejam produzidos como descrito acima usando pelo menos malte como um material bruto.
[091] Como o malte, malte de cevada é em geral usado.
[092] O sake (sakeJapones) é produzido por sacarificação de amido contido no arroz com malte de arroz, desse modo produzindo açúcar, seguido por fermentação alcoólica do açúcar com levedura.
[093] O vinho é produzido por fermentação alcoólica de pelo menos suco de uva com levedura.
[094] Exemplos de levedura incluem organismos que pertencem ao gênero Saccharomyces, especificamente, Saccaromycescerevisiae.
[095] Adicionalmente, exemplos de levedura incluem assim chamada de levedura de sake, a assim chamada de levedura vinho, e a assim chamada de levedura de cerveja.
[096] Exemplos do lisado de levedura (extrato de levedura) incluem autolisado de levedura gerado por autólise de levedura, levedura cujas paredes celulares são rompidas por contato com água quente, e levedura cujas paredes celulares são rompidas por enzima.
[097] Na etapa de cultura, um gás contendo oxigênio pode ser fornecido ao caldo de modo a manter a respiração de oxigênio da microalga.Adicionalmente, na etapa de cultura, a gás contendo dióxido de carbono pode ser fornecido ao caldo de modo a promover a fotossíntese da microalga.
[098] Os referidos gases podem ser fornecidos por aerar o caldo ou agitar o caldo, por exemplo.
[099] Especificamente, na etapa de cultura, o caldo pode ser aerado, por exemplo, com ar de modo a fornecer oxigênio para a respiração da microalga.Adicionalmente, na etapa de cultura, o caldo pode ser aerado, por exemplo, com um gás de exaustão contendo uma quantidade comparativamente grande de dióxido de carbono de modo a promover a fotossíntese da microalga.
[0100] Na etapa de cultura, é preferível que a cultura fotoautotrófica e a cultura heterotrófica seja realizada ao mesmo tempo, em que o oxigênio e o dióxido de carbono sejam fornecidos dentro do caldo, por exemplo, por aeração.Ou seja, na etapa de cultura, é preferível que a cultura fotoheterotrófica seja realizada por irradiação com luz e a cultura heterotrófica seja realizada na presença de nutrientes orgânicos, concomitantemente, enquanto um gás contendo ambos oxigênio e dióxido de carbono é fornecido ao caldo por aeração ou semelhante de modo a promover a respiração de oxigênio e fotossíntese da microalga.
[0101] Na etapa de cultura, a fotossíntese das microalgas pode ser promovida por fornecer dióxido de carbono ao caldo, enquanto as microalgas são irradiadas com luz, por exemplo, durante o dia.Adicionalmente, a cultura heterotrófica das microalgas pode ser realizada por fornecer ar na presença de nutrientes orgânicos, por exemplo, durante noite quando as microalgas não são irradiadas com luz.
[0102] Realizar a etapa de cultura desse modo é vantajoso em que o crescimento das microalgas é adicionalmente promovido, e a produção de paramilo ou semelhante pelas microalgas é adicionalmente promovido.
[0103] A temperatura da cultura na etapa de cultura não é especificamente limitada desde que as microalgas possam se desenvolver na temperatura. Especificamente, a temperatura da cultura (temperatura do calco), por exemplo, de 15°C a 35°C, preferivelmente 20°C a 30°C, é empregada.
[0104] O pH do caldo na etapa de cultura não é especificamente limitado desde que as microalgas podem se desenvolver no pH.Um A pH, por exemplo, de 2.5 a 5.5 é empregada.
[0105] Para ajustar o pH do calco, um ácido inorgânico tal como ácido hidroclorídrico pode ser adicionado ao caldo, ou um ácido orgânico tal como ácido acético pode ser adicionado ao caldo.Ao adicionar um ácido orgânico ao caldo é vantajoso em que as microalgas podem se desenvolver usando o ácido orgânico como um nutriente orgânico.
[0106] Adicionalmente, para ajustar o pH do caldo, um agente alcalino pode ser adicionado ao caldo. Como o agente alcalino, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ou semelhante é em geral usado.
[0107] Na etapa de cultura, o fornecimento de oxigênio ao caldo pode ser suprimido para permitir que as microalgas do gênero Euglena produzam ésteres de cera.
[0108] Especificamente, as microalgas podem ser cultivadas sob condições anaeróbicas na etapa de cultura, por exemplo, por parar a aeração do caldo ou o fornecimento de gás inerte livre de oxigênio ou semelhante ao caldo.
[0109] Na etapa de cultura, as microalgas que têm polissacarídeos armazenados tal como paramilo em suas células são adicionalmente cultivadas sob condições anaeróbicas, desse modo permitindo que as microalgas do gênero Euglena convertam os paramilo em ésteres de cera de modo a armazenar os lipídeos em suas células.
[0110] Na etapa de cultura, é preferível que as microalgas sejam cultivadas sob condições anaeróbicas e condições escuras sem irradiação da luz, em eu a produção de ésteres de cera pode ser adicionalmente promovida.
[0111] Nesse meio tempo, na etapa de cultura, as microalgas podem ser cultivadas na presença de nutrientes inorgânicos contendo nitrogênio ou nutrientes orgânicos contendo nitrogênio, enquanto o oxigênio é fornecido ao caldo, de modo a permitir que as microalgas do gênero Euglena produzam proteínas.
[0112] Na etapa de cultura, as microalgas são cultivadas como descrito acima, desse modo permitindo que as microalgas para produzir compostos orgânicos tal como polissacarídeos, lipídeos, ou proteínas enquanto as microalgas se desenvolvem.Assim, os referidos compostos orgânicos podem ser armazenados nas células da microalga.
[0113] Adicionalmente, na etapa de cultura, as condições de cultura são adequadamente ajustadas, desse modo permitindo que as microalgas produzam compostos orgânicos tal como pigmentos, vitaminas tal como vitamina C e vitamina E, proteínas, e ácidos graxos incluindo ácidos graxos saturados, ácidos graxos não saturados avançados tal como ácido linoleico, ácido araquidônico, e ácido eicosapentaenoico, diferente dos compostos orgânicos acima mencionados.
[0114] Então, as microalgas que armazenam os referidos compostos orgânicos em suas células podem ser usadas como biomassa disponível para várias aplicações tal como alimentação, farmacêutica, alimentação, produtos químicos, e combustível.
[0115] Exemplos dos polissacarídeos incluem paramilo (β-1,3- glucan).O paramilo é formado por ligação de cerca de 700 unidades de glicose.
[0116] Exemplos de lipídeos incluem ésteres de cera.Os ésteres de cera são formados por ligação de éster entre ácidos graxos superiores e álcoois superiores. Como os ésteres de cera, ésteres de cera formados por ligação de éster entre ácido graxo C-14 e álcool superior C-14 podem ser mencionados.
[0117] No método para produzir polissacarídeos da presente modalidade, as mesmas etapas que no método para produzir um composto orgânico, que será descrito abaixo, podem ser realizadas.
[0118] Subsequentemente, uma modalidade do método para produzir um composto orgânico de acordo com a presente invenção é descrita.
[0119] De acordo com o método para produzir um composto orgânico da presente modalidade, pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos, e proteínas são produzidos como o composto orgânico por realizar o método de cultura acima mencionado (etapa de cultura).
[0120] O método para produzir um composto orgânico da presente modalidade tem um efeito de permitir que pelo menos um composto orgânico selecionado a partir do grupo que consiste de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos, e proteínas seja suficientemente obtido.
[0121] Entre os referidos, vitamina C, vitamina E, pigmentos, e proteínas pode ser produzidos juntos com polissacarídeos por realizar o método para produzir polissacarídeos.
[0122] Preferivelmente, o método para produzir um composto orgânico da presente modalidade inclui a etapa de cultura acima mencionada, e adicionalmente inclui uma etapa de espessamento de que aumenta a relação das microalgas após serem cultivadas e uma etapa de secagem de secagem das microalgas por adicionalmente reduzir a umidade nas microalgas após a etapa de espessamento.No método para produzir um composto orgânico, a etapa de espessamento e a etapa de secagem não são necessariamente necessárias.
[0123] A etapa de espessamento pode ser realizada, por exemplo, por usando um agente de espessamento comum.
[0124] Especificamente, exemplos de agente de espessamento incluem um dispositivo que concentra as microalgas por aumentar a relação da microalga, por exemplo, usando espessamento de flutuação, espessamento de gravidade, espessamento usando filtragem de membrana, ou espessamento de correia.Adicionalmente, um agente de desidratação pode ser usado como o agente de espessamento de modo a adicionalmente aumentar a relação da microalga.
[0125] Especificamente, exemplos do agente de desidratação incluem um agente de desidratação a vácuo, um agente de desidratação de pressão (prensa de filtro), uma prensa de correia, uma prensa de parafuso, um agente de desidratação centrífugo (decantador de parafuso), e um agente de desidratação.
[0126] A etapa de espessamento pode ser realizada usando apenas o agente de espessamento, ou pode ser realizada usando não só o agente de espessamento mas também o agente de desidratação, dependendo de aplicações de polissacarídeos, lipídeos, proteínas, ou semelhante a serem produzidos.
[0127] A etapa de secagem pode ser realizada, por exemplo, por aquecer as microalgas após a etapa de espessamento ou dispor as microalgas após a etapa de espessamento sob pressão reduzida.
[0128] Uma vez que as microalgas após a etapa de espessamento ou as microalgas após a etapa de secagem podem conter pelo menos um de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos, e proteínas e suas células, as mesmas podem ser usadas como em aplicações tal como alimentação.
[0129] Adicionalmente, pelo menos um de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos, e proteínas é extraída a partir das microalgas como um composto orgânico por submeter as microalgas após a etapa de espessamento ou as microalgas após a etapa de secagem a um processo de extração comum, como necessário.O composto orgânico extraído pode ser usado em aplicações tal como materiais de alimentação brutos e combustível.
[0130] Exemplos do processo de extração a ser empregado incluem um processo de extração de extrair o composto orgânico acima mencionado usando um solvente orgânico tal como etanol e hexano, e um processo de extração de extrair os lipídeos acima mencionados ou semelhante usando a CO2 solvente em um estado subcrítico.
[0131] As microalgas do gênero Euglena, o método para produzir polissacarídeos, e o método para produzir um composto orgânico de acordo com as realizações acima mencionadas são como exemplificadas acima.Entretanto, a presente invenção não é limitada às microalgas do gênero Euglena, o método para produzir polissacarídeos, e o método para produzir um composto orgânico exemplificado acima.
[0132] Adicionalmente, é também possível se empregar várias realizações que são comumente usadas em microalgas do gênero Euglena, um método para produzir polissacarídeos, e um método para produzir um composto orgânico, desde que os efeitos da presente invenção não sejam prejudicados.
[0133] Ou seja, a presente invenção não é limitada às realizações acima descritas, e o desenho pode ser adequadamente modificado dentro do âmbito pretendido pela presente invenção.A vantagem operacional da presente invenção também não é limitada às realizações anteriores.
[0134] As realizações descritas aqui devem ser construídas em todos os respeitos como ilustrativas mas não limitantes. O âmbito da presente invenção não é indicada pela descrição anterior mas pelo âmbito das reivindicações. Adicionalmente, o âmbito da presente invenção é pretendido de modo a incluir todas as modificações equivalentes no sentido e o âmbito ao âmbito das reivindicações. Exemplos
[0135] Em seguida, a presente invenção é descrita adicionalmente em detalhes por meio de exemplos. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos referidos exemplos.
[0136] A coleta e o isolamento de microalgas do gênero Euglena
[0137] Água do lago coletada em lagos e pântanos em Nagasaki foi inoculada em Meio de cultura AF-6 (que será descrito abaixo), que foi cultivado por dois meses a temperatura ambiente ao mesmo tempo em que foram irradiadas com luz fluorescente.
[0138] Microalgas no meio de cultura após a cultura serem isoladas com uma micro pipeta. As microalgas isoladas foram cultivadas em Meio de cultura AF-6 a temperatura ambiente ao mesmo tempo em que foram irradiadas com luz fluorescente.
[0139] Identificação de microalgas do gênero Euglena
[0140] Determinação da sequência de base
[0141] Para confirmar que as microalgas isoladas foram a espécie que pertence ao gênero Euglena, as operações a seguir foram realizadas.
[0142] Ou seja, a sequência de base do gene de 18S rRNA das microalgas cultivadas do gênero Euglena foi determinada por um sequenciador de DNA ("CEQ8000", fabricado por BeckmanCoulter, Inc.) usando um conjunto de primer dedicado ao gene de 18S rRNA das microalgas do gênero Euglena (Zakrys et al., 2002, Journal de Phycology 38: 1190-1199). A sequência de base determinada é mostrada como Sequência No. 1 em uma listagem de sequência.
[0143] Comparação de sequência de base
[0144] A sequência de base determinada foi comparada com a sequência de base do gene de 18S rRNA de microalgas conhecidas do gênero Euglena obtidos a partir de GenBank usando a pesquisa de homologia BLAST. Adicionalmente, uma comparação com as microalgas conhecidas do gênero Euglena em uma homologia de sequência correspondendo ao grau foi produzido.A Figura 1 mostra uma tabela de comparação da sequência de base do gene de 18S rRNA das microalgas isoladas do gênero Euglena com uma sequência de base do gene de 18S rRNA das microalgas conhecidas do gênero Euglena.
[0145] Adicionalmente, a árvore filogenética molecular foi construída pelo método de probabilidade máxima usando um software de desenho de árvore filogenética molecular Mega5 (Tamura et al., 2011, Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739).A Figura 2 mostra a árvore filogenética.
[0146] Como um resultado, as microalgas isoladas como acima foram identificadas como sendo a espécie que pertence ao gênero Euglena (Euglena gracilisKlebs). Deve ser observado que Ka, Kb, Na, e Nb da cepa EOD-1 na Figura 2 são símbolos que denotam amostras de teste de microalgas isoladas. O mesmo resultado foi obtido quando se usa qualquer amostra de teste.
[0147] RAPD analise
[0148] Adicionalmente, para comparação das microalgas isoladas do gênero Euglena com as microalgas conhecidas do gênero Euglena, o padrão de banda das microalgas isoladas do gênero Euglena e o padrão de bandas de 6 cepas do NaçãoalInstitute for AmbientealStudies foram obtidos por análise RAPD (RandomAmplifiedPolymorphic DNA) (Literatura de Referência: Williams et al., (1990) Nucleic Aids Res. 18 (22), 6531-6535).
[0149] As condições de PCR na análise RAPD foram como a seguir.
[0150] Número da amostra: 3
[0151] Primer 1: AAATCGGGCTG: RAPD-6, Sequência No. 2
[0152] Enzima: ExTaq (fabricada por TakaraBio Inc.)
[0153] Tampão de reação: 50 μL
[0154] Quantidade de matriz de DNA: cerca de 0.5 ng
[0155] Condições de temperatura de PCR: como mostrado na Tabela 1; especificamente, após um tratamento a 94°C por um minuto, um conjunto de tratamentos (94°C por um minuto, 40°C por 45 segundos, e 72°C por um minuto) foi repetido 35 vezes, seguido por um tratamento a 72°C for 7 minutos.
[0156] Condições de eletroforese: 2,5 massa% de gel de agarose, 100 V, 40 minutos Tabela 1
[0157] Cepas comparadas em análise RAPD
[0158] Euglena gracilis NIES-47
[0159] Euglena gracilis NIES-48
[0160] Euglena gracilis NIES-49
[0161] Euglena gracilis NIES-253
[0162] Euglena gracilis NIES-286
[0163] Euglena gracilis NIES-2149
[0164] Adicionalmente, embora mudando o primer, a análise RAPD foi realizada da mesma maneira por PCR.
[0165] Primer 2: ATCGGGTCCG: RAPD-4, Sequência No. 3
[0166] Primer 3: GCGATCCCCA: RAPD-3, Sequência No. 4
[0167] As sequências de bases dos primers acima mencionados 2 a 4 são descritas em Mostafa et al., (2011) Molecules 16, 2598-2608.
[0168] A Figura 3A mostra os resultados (padrões de banda) de análise RAPD usando o primer 1 acima mencionado.Adicionalmente, A Figura 3B e A Figura 3C mostram os resultados de análise RAPD respectivamente usando os primers 2 e 3 acima mencionados.Deve ser notado que Ka e Na de cepa EOD-1 na Figura 3A a Figura 3C respectivamente correspondem a Ka e Na na Figura 2.
[0169] A partir dos resultados da análise RAPD, foi observado que o padrão de bandas das microalgas do gênero Euglena isoladas como acima são diferentes a partir do padrão de bandas das microalgas conhecidas do gênero Euglena.Desse modo, foi determinado que as cepas das microalgas do gênero Euglena isoladas como acima são diferentes a partir das da microalgas conhecidas do gênero Euglena.
[0170] Então, as microalgas do gênero Euglena isoladas como acima foram nomeadas Euglena gracilis cepa EOD-1.
[0171] Cultura de microalgas do gênero Euglena
[0172] De modo a cultivar as microalgas do gênero Euglena, os materiais a seguir foram preparadas e foram submetidas para a etapa de cultura sob as condições de cultura a seguir.
[0173] Cepas de microalgas do gênero Euglena da presente invenção: Microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 (No. de acesso: FERM BP- 11530) (depositadas no Organismo de Depósito de Patente no NationalInstituteof Technology and Evaluation)
[0174] Microalgas conhecidas cepas do gênero Euglena: Microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa NIES-48 (obtidos a partir da Coleta de Cultura Microbiana no NationalInstitute for AmbientealStudies)
[0175] Recipiente de Cultura: como descrita abaixo, tal como um frasco de 300-a-500 mL
[0176] Fornecimento de gás ao caldo: agitação a 130 rpm; ar é fornecidos para dentro do caldo por agitação do caldo.
[0177] Temperatura da cultura: 28°C
[0178] Período de Cultura: como descrito abaixo
[0179] pH de caldo: como descrito abaixo
[0180] Componentes no caldo para cultura: As composições mostradas na Tabela 2 e na Tabela 3 foram empregadas como composições básicas.
[0181] A composição mostrada na Tabela 2 foi obtida por se adicionar os componentes da composição de "metais P IV" meio de cultura (descrito pela Coleta de Cultura Microbiana no NationalInstitute for AmbientealStudies) a uma composição de "Meio de cultura AF-6" descrito pela Coleta de Cultura Microbiana no NationalInstitute for AmbientealStudies.Adicionalmente, o componente diferente dos nutrientes contidos no caldo foi água.
[0182] Adicionalmente, a composição mostrada na Tabela 3 foi baseada na composição de Meio de cultura Cramer-Myers.
[0183] Peso inicial de microalgas antes da cultura: 0,78 g/L (peso seco)
[0184] Nutrientes orgânicos: os materiais a seguir foram adequadamente mudados dependendo de cultura.
[0185] • Glicose
[0186] • extrato de Levedura (autolisado de levedura): "extrato de levedura seca D-3" (nome do produto), fabricado por NIHON FARMACÊUTICA CO., LTD.
[0187] • Cerveja como a bebida fermentada: cerveja comercialmente oferecida (com um coeficiente de uso de malte de 66.7% ou mais) contendo 5 vol% de etanol
[0188] Nos exemplos 1 a 4 e Exemplos Comparativos 1 a 4, cultura heterotrófica foi realizada sob condições no escuro, e cultura fotoheterotrófica foi realizada nos outros exemplos e exemplos Comparativos.As condições de cultura na cultura fotoheterotrófica de microalgas são mostradas em detalhes abaixo.
[0189] Condições de Fotoirradiação: após a fotoirradiação por 12 horas, disposta no escuro por 12 horas
[0190] Intensidade de Luz: densidade de fluxo fóton fotossintético (PPFD) de cerca de 100 μmol/m2^s ou cerca de 200 μmol/m2^s
[0191] Exemplo 1
[0192] 200 mL da composição mostrada na Tabela 2 foi posta em um frasco de 500 mL Sakaguchi. Adicionalmente, glicose e extrato de levedura foram adicionados ao mesmo a uma concentração de glicose de 15 g/L e uma concentração de extrato de levedura de 5 g/L. Adicionalmente, o pH foi ajustado para 4.0 pela adição de ácido hidroclorídrico.Assim, um caldo foi preparado.
[0193] Então, o frasco foi agitado sob as acimas mencionadas condições de cultura e condições no escuro (ou seja, sob as condições de cultura heterotróficas), e microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 foram cultivadas por 3 dias.A etapa de cultura foi assim realizada.
[0194] Exemplos 2 a 4
[0195] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto em que a quantidade de glicose foi mudada de modo que a concentração de glicose no caldo foi 20 g/L, 25 g/L, e 30 g/L, respectivamente.
[0196] Exemplo Comparativo 1
[0197] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto em que microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa NIES- 48 foram cultivadas por 5 dias em vez das microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1.
[0198] Exemplos Comparativos 2 a 4
[0199] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo Comparativo 1, exceto em que a quantidade de glicose foi mudada de modo que a concentração de glicose no caldo foi 20 g/L, 25 g/L, e 30 g/L, respectivamente.
[0200] O peso seco das microalgas após a etapa de cultura em cada um dos Exemplos e nos Exemplos Comparativos foi medido. Adicionalmente, o coeficiente de conversão de nutrientes adicionados foi determinado pelas fórmulas de cálculo a seguir.
[0201] Coeficiente de conversão (%) = peso seco (g/L) de algas aumentou por cultura/Concentração (g/L) de glicose consumida
[0202] A Figura 4 mostra os resultados do coeficiente de conversão e o peso seco das algas após a cultura em cada um dos Exemplos e nos Exemplos Comparativos
[0203] Como visto a partir da Figura 4, as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 têm uma maior produção de biomassa do que as conhecidas cepas NIES-48.
[0204] Exemplo 5
[0205] A etapa de cultura foi realizada por cultivar as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto em que um frasco Erlenmeyer de 300 mL foi usado, um caldo obtido por adicionar cerveja a 50 mL da composição mostrada na Tabela 2 a uma concentração de etanol derivado a partir de cerveja de 2,5 vol% foi usado, o extrato de levedura não foi adicionado ao caldo, ambiente de fotoirradiação por 12 horas e ambiente escuro por 12 horas foram repetidos durante a cultura, e um período de cultura foi 7 dias.A densidade de fluxo de fóton fotossintético (PPFD) foi ajustada para cerca de 100 μmol/m2^s.
[0206] Exemplo 6
[0207] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 5, exceto em que o extrato de levedura foi adicionado ao caldo a uma concentração do extrato de levedura de 2 g/L.
[0208] Exemplo Comparativo 5
[0209] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 5, exceto em que microalgas do gênero Euglena cepa NIES-48 foram cultivadas em vez das microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1.
[0210] Exemplo Comparativo 6
[0211] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo Comparativo 5, exceto em que o extrato de levedura foi adicionado ao caldo a uma concentração do extrato de levedura de 2 g/L.
[0212] Na etapa de cultura de cada um dos Exemplos 5 e 6, e Exemplos Comparativos 5 e 6, o peso seco de microalgas após a cultura por 1, 2, 3, 4, 5, e 7 dias foi medido.A Figura 5 mostra os resultados.
[0213] Como visto a partir da Figura 5, as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 têm maior produtividade do que as conhecidas cepas NIES-48, mesmo quando as mesmas foram cultivadas sob condições de cultura fotoheterotróficas.
[0214] Exemplos 7 a 12
[0215] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 5, exceto em que a composição mostrada na Tabela 3 foi usada em vez da composição mostrada na Tabela 2, o pH inicial do caldo foi mudado para pH 5.5, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 8.5, e pH 9.0, respectivamente, e um período de cultura foi mudado para 10 dias.
[0216] Na etapa de cultura de cada de Exemplos 7 a 12, o peso seco das microalgas após a cultura foi medido com o tempo.A Figura 6 mostra os resultados.
[0217] Exemplos 13 a 17
[0218] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 5, exceto em que a composição mostrada na Tabela 3 foi usada em vez da composição mostrada na Tabela 2, a densidade de fluxo de fóton fotossintético (PPFD) foi ajustada para cerca de 200 μmol/m2^s, o pH inicial do caldo foi mudado para pH 3.5, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, e pH 5.5, respectivamente, e um período de cultura foi mudado para 10 dias.
[0219] Exemplos 18 e 19
[0220] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 5, exceto em que a composição mostrada na Tabela 3 foi usada em vez da composição mostrada na Tabela 2, o pH inicial do caldo foi mudado para pH 3.5 e pH 5.5, respectivamente, e um período de cultura foi mudado para 10 dias.
[0221] Na etapa de cultura de cada de Exemplos 13 a 19, o peso seco das microalgas após a cultura foi medido over time.A Figura 7 mostra os resultados.
[0222] Exemplo 20
[0223] A etapa de cultura foi realizada por cultivar as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 da mesma maneira que no Exemplo 5, exceto em que um período de cultura foi 7 dias.
[0224] A cultura foi realizada sob condições aeróbicas por agitação do frasco até dois dias após o início da cultura.Posteriormente, a agitação foi interrompida, e a cultura foi realizada sob condições anaeróbicas por fornecer um gás inerte (gás nitrogênio).
[0225] Exemplo Comparativo 7
[0226] A etapa de cultura foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 20, exceto em que microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa NIES- 48 foram cultivadas em vez das microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1.
[0227] A cultura foi realizada sob condições aeróbicas por agitação do frasco até 4 dias após o início da cultura. Posteriormente, a agitação foi interrompida, e a cultura foi realizada sob condições anaeróbicas por fornecer um gás inerte (gás nitrogênio).
[0228] As quantidades de paramilo e lipídeos (ésteres de cera) produzidos pela cultura no Exemplo 20 e no Exemplo Comparativo 7 foram medidas a cada dia.
[0229] A quantidade de paramilo após a cultura foi medida pelo procedimento a seguir.Ou seja, uma mistura (40 mL) do caldo e as microalgas após a cultura foi posta em um tubo de centrífuga, seguido por centrifugação. Água pura foi adicionada ao precipitado após a centrifugação para produzir uma suspensão, e a operação de re-separação centrífuga foi repetida duas vezes.Então, uma pequena quantidade de água pura foi adicionada ao precipitado após a centrifugação para produzir a suspensão, e os sólidos suspensos foram secos a congelamento.Assim, os componentes do caldo foram removidos.
[0230] Em seguida, cerca de 400 mg de as células das microalgas secas por congelamento foram precisamente pesadas em um tubo centrífugo (que foi pesado como um valor em branco).Acetona foi adicionad ao mesmo para produzir a suspensão, e o fluido sobrenadante após a centrifugação foi removido.Até a cor do fluido sobrenadante desaparecer, a operação de lavagem com acetona foi repetida cerca de 5 vezes.Assim, os componentes de pigmento produzidos pelas microalgas foram removidos.
[0231] Subsequentemente, usando uma solução de dodecil sulfato de sódio, a operação de remover os componentes diferentes de paramilo foi realizada.Ou seja, 20 mL de uma solução de 1% dodecil sulfato de sódio (SDS) foi adicionado ao resíduo após os componentes de pigmento foram removidos de modo a produzir a suspensão, que foi posteriormente aquecida a 100°C por 10 minutos.Então, o fluido sobrenadante após a centrifugação foi removido.A referida operação foi repetida duas vezes, e após a mesma operação foi repetida três vezes usando água pura em vez da solução de SDS.Assim, a SDS foi retirada por lavagem.
[0232] Finalmente, todo o tubo centrífugo foi posto em uma secadora a 105°C de modo que a umidade foi removida, e o peso do tubo centrífugo contendo paramilo foi medido.Então, a quantidade de paramilo foi determinada a partir da diferença a partir do valor em branco acima mencionado.
[0233] Nesse meio tempo, a quantidade de ésteres de cera após a cultura foi medida pelo método BLUZ-DYER.
[0234] A Figura 8A e a Figura 8B mostram os resultados de medição da quantidade de paramilo com o tempo na cultura de Exemplo 20 e Exemplo Comparativo 7.Adicionalmente, a Figura 9A e a Figura 9B mostram os resultados da quantidade de medição de lipídeo (éster de cera) com o tempo.
[0235] Como visto a partir da Figura 8A e da Figura 8B, as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 têm uma velocidade superior de produção de paramilo do que as convencionais microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa NIES-48.Adicionalmente, a cepa EOD-1 tem um teor de paramilo por célula de cerca de 55% ou mais, que é maior do que na cepa NIES-48.
[0236] Adicionalmente, como visto a partir da Figura 9A e da Figura 9B, as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 têm uma maior velocidade de produção de lipídeo (éster de cera), e assim o teor de ésteres de cera por célula é aumentado dentro de um período mais curto.
[0237] Adicionalmente, a etapa de cultura foi realizada usando um meio de cultura tendo a composição mostrada na Tabela 4 e Tabela 5 abaixo sob as condições de cultura a seguir.
[0238] Exemplo 21
[0239] As microalgas acima mencionadas, cepa EOD-1, foram cultivadas por dois dias por cultura fotoheterotrófica.
[0240] Exemplo Comparativo 8
[0241] As microalgas acima mencionadas, cepa NIES-48, foram cultivadas por dois dias por cultura fotoheterotrófica.
[0242] Como o meio de cultura, um meio de cultura obtido por adicionar 30 g/L de glicose a um Meio de cultura Hutner modificado (daqui em diante, referida como "Meio de cultura Hutner modificado") foi empregado. Especificamente, a composição foi como mostrada na Tabela 4, e o componente no líquido diferente do nutriente foi água.Como a solução de metal de traços na Tabela 4, a solução de metal de traços tendo a composição na Tabela 5 abaixo foi usada.O componente diferente de metal de traços foi água.
[0243] O método de cultura detalhado foi como a seguir.
[0244] Caldo: com um pH ajustado para 4.0 usando ácido hidroclorídrico
[0245] Recipiente de Cultura: frasco de 500 mL Sakaguchi
[0246] Introdução antes da cultura: 200 mL do caldo e as microalgas antes da cultura foram posts em frascos de Sakaguchi (de modo a ajustar a quantidade inicial de biomassa, 220 mL no total foi usado para a cepa EOD-1 e 236 mL em total foi usado para a cepa NIES-48).
[0247] Temperatura durante cultura: 28°C
[0248] Condições de luz e escuro durante a cultura: cultivadas sob condições escuras protegidas da luz
[0249] Condições Aeróbicas durante a cultura: o frasco de Sakaguchi foi disposto em um agitador, e o ar foi fornecido dentro do caldo por operar o agitador com agitação reciproca a 130 rpm. Tabela 4 Meio de cultura Hutner modificado: Glicose Adicionado
Tabela 5 
[0250] O peso seco (produção de biomassa) das algas após dois dias a partir da cultura e a conversão de glicose foram calculados da mesma maneira como acima. A Tabela 6 mostra os resultados. Tabela 6
[0251] Como pode ser visto a partir da Tabela 6, as microalgas do gênero Euglena (Euglena gracilis) cepa EOD-1 têm uma melhor produção de biomassa desempenho e uma melhor conversão de glicose do que as microalgas do gênero Euglena convencionais (Euglena gracilis) cepa NIES-48.
[0252] APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[0253] As microalgas da presente invenção, o método para produzir polissacarídeos da presente invenção, e o método para produzir um composto orgânico da presente invenção são adequadamente usados para se obter os compostos orgânicos tais como polissacarídeos tal como paramilo, lipídeos tal como ésteres de cera, e proteínas por cultura.
[0254] Os compostos orgânicos obtidos podem ser usados em aplicações tal como alimentação saudável, farmacêutica, alimentação, produtos químicos, ou combustível, ao mesmo tempo em que permanecem armazenados nas células da microalga, ou após serem extraídos por um processo de extração ou semelhante. Especificamente, os lipídeos armazenados nas células das microalgas como compostos orgânicos por cultura são adequadamente usados, por exemplo, como um material bruto de combustível por ser extraído a partir das células.
Claims (5)
1. Método para a produção de polissacarídeos, caracterizado pelo fato que compreende cultivar microalgas do gênero Euglena como organismos de produção de polissacarídeos para produzir os polissacarídeos, em que as microalgas do gênero Euglena que pertencem à cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de Acesso FERM BP-11530).
2. Método para a produção de polissacarídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o caldo usado na cultura contém 15 a 30 g/l de glicose.
3. Método para a produção de polissacarídeos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que o caldo usado na cultura contem lisado de levedura.
4. Método para a produção de polissacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que os polissacarídeos são paramilo (paramylum).
5. Método para a produção de um composto orgânico, caracterizado pelo fato que compreende cultivar as microalgas do gênero Euglena para produzir pelo menos um composto orgânico selecionado a partir do grupo que consiste de polissacarídeos, lipídeos, vitamina C, vitamina E, pigmentos e proteínas, em que as microalgas do gênero Euglena que pertencem à cepa Euglena gracilis EOD-1 (No. de Acesso FERM BP-11530).
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