JP6019305B1 - 新規のユーグレナ属微細藻類 - Google Patents
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Abstract
【課題】増殖性が優れた（例えば、より高い比増殖速度を有する）新規のユーグレナ属微細藻類を提供する。【解決手段】新規のユーグレナ属微細藻類であるユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のＫｉｓｈｕ株（２０１５年１１月３０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００））を提供することによって、上記課題を解決した。【選択図】なし
Description
本発明は、新規のユーグレナ属微細藻類およびその使用方法に関する。
ユーグレナ属微細藻類は、光の照射下では光合成によって育成するとともに従属栄養下でも育成し得るという動植物の両特性を有する原生動物である。そのタンパク質を構成するアミノ酸は、動物タンパク質に酷似しているので栄養価が高く、細胞外膜が柔らかいため消化吸収がよく、ビタミン類を多量に含むという特徴を有している。また、細胞内には多糖類やワックスエステルを蓄積することが知られている。ユーグレナ属微細藻類としては、様々なものが知られており、例えば、ユーグレナグラシリスＺ株（ＮＩＥＳ−４８株）が知られている（特許文献１，２）。
ユーグレナ属微細藻類は食品として利用可能であるのみならず、バイオ燃料の製造やプラスチックの製造が可能である。
ユーグレナ属微細藻類を用いる工業生産においては、ユーグレナ属微細藻類の増殖速度を促進することが重要であるが、従来技術のユーグレナ属微細藻類の増殖速度は十分なものではない。また、増殖性に優れた新たなユーグレナグラシリス微細藻類の開示はない。(特許文献１，２）
本発明は、従来のユーグレナ属微細藻類と比較して、増殖性が優れた（例えば、より高い比増殖速度を有する）新規のユーグレナ属微細藻類を提供することを課題とする。さらに、本発明は、そのような新規のユーグレナ属微細藻類を利用する方法を提供する。
本発明の発明者らは、新規のユーグレナ属微細藻類であるユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のＫｉｓｈｕ株を提供することによって、上記課題を解決した。このＫｉｓｈｕ株は、図１（配列番号１）に示す核酸配列を含む１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する。このユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｋｉｓｈｕ株は、２０１５年１１月３０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）。
例えば、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株。
（項目２）
ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）。
（項目３）
項目１に記載のＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株を培養する工程を包含する、多糖類、タンパク質、脂肪酸、脂質、ビタミン類、および、油からなる群から選択される物質を生産する方法。
（項目４）
前記物質が多糖類である、請求項３に記載の方法。
（項目５）
前記多糖類がパラミロンである、項目４に記載の方法。
（項目６）
項目１に記載のＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株を培養する方法であって、ＫＨ培地中で培養する工程を包含する、方法。
（項目１）
ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株。
（項目２）
ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）。
（項目３）
項目１に記載のＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株を培養する工程を包含する、多糖類、タンパク質、脂肪酸、脂質、ビタミン類、および、油からなる群から選択される物質を生産する方法。
（項目４）
前記物質が多糖類である、請求項３に記載の方法。
（項目５）
前記多糖類がパラミロンである、項目４に記載の方法。
（項目６）
項目１に記載のＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株を培養する方法であって、ＫＨ培地中で培養する工程を包含する、方法。
本発明の新規のユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｋｉｓｈｕ株は、以下の菌学的特徴を有する：
・単細胞性であり、株によって若干異なるが大きさが概ね１０μｍから５０μｍの微小な藻類である。
・Ｋｉｓｈｕ株の栄養型細胞は、鞭毛を有し、活発に運動する。また、細胞の形状は、おおよそ紡錘形である。細胞内には、核、葉緑体、ミトコンドリアなどの一般的なオルガネラに加えて眼点という赤色の小器官を有する。
・単細胞性であり、株によって若干異なるが大きさが概ね１０μｍから５０μｍの微小な藻類である。
・Ｋｉｓｈｕ株の栄養型細胞は、鞭毛を有し、活発に運動する。また、細胞の形状は、おおよそ紡錘形である。細胞内には、核、葉緑体、ミトコンドリアなどの一般的なオルガネラに加えて眼点という赤色の小器官を有する。
本発明のＫｉｓｈｕ株は、例えば、以下の生理学的又は生化学的性質の少なくとも一つ以上を有する。
（１）培地：主として淡水からなる培養液中で増殖できる（廃水由来の有機物を利用しても増殖可能）。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養増殖ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロテノイド類を含む。
（４）同化蓄積物質：タンパク質、脂質（ワックスエステルなど）、多糖類（パラミロンなど）。
（５）増殖温度域：１５℃〜３７℃（好ましくは２０℃〜３５℃、至適温度３５℃）。
（６）好適増殖ｐＨ域：ｐＨ３．５〜５．５（ただし、左記ｐＨ範囲外でも増殖可能）
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
（１）培地：主として淡水からなる培養液中で増殖できる（廃水由来の有機物を利用しても増殖可能）。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養増殖ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロテノイド類を含む。
（４）同化蓄積物質：タンパク質、脂質（ワックスエステルなど）、多糖類（パラミロンなど）。
（５）増殖温度域：１５℃〜３７℃（好ましくは２０℃〜３５℃、至適温度３５℃）。
（６）好適増殖ｐＨ域：ｐＨ３．５〜５．５（ただし、左記ｐＨ範囲外でも増殖可能）
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において使用される用語「多糖類」とは、グリコシド結合によって単糖分子が多数重合した物質またはそのような物質を修飾した物質をいう。代表的には、本発明の多糖類は、β−１，３−グルカン（すなわち、グルコースがβ−１,３型の結合で連なった多糖）である。本発明のＫｉｓｈｕ株によって産生されるβ−１，３−グルカンは、限定されることはないが、例えば、パラミロンである。
本明細書において使用される用語「ワックスエステル」とは、嫌気状態に置かれたユーグレナが体内に貯蔵しているパラミロンを分解して得られるろう質物であり、脂肪酸と脂肪アルコールからなる物質である。代表的にはミリスチン酸ミリスチルである。
本明細書において使用される用語「独立栄養培地」とは、以下の成分を含む培地をいう。
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ １０００ｍｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ５０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １８ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ４ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４ １．２ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４ＶＯ３ ０．５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１ ２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２ ５μｇ／Ｌ
本明細書において使用される用語「ＫＨ培地」とは、以下の成分を含む培地をいう。
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ １０００ｍｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ５０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １８ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ４ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４ １．２ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４ＶＯ３ ０．５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１ ２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２ ５μｇ／Ｌ
本明細書において使用される用語「ＫＨ培地」とは、以下の成分を含む培地をいう。
アルギニン塩酸塩 ０．５ｇ／Ｌ
アスパラギン酸 ０．３ｇ／Ｌ
グルコース １２．５ｇ／Ｌ
グルタミン酸 ４ｇ／Ｌ
グリシン ０．３ｇ／Ｌ
ヒスチジン塩酸塩 ０．０５ｇ／Ｌ
リンゴ酸 ６．５ｇ／Ｌ
クエン酸・３Ｎａ ０．５ｇ／Ｌ
コハク酸・２Ｎａ ０．１ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５ｇ／Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ３ ０．２５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．２５ｇ／Ｌ
ＭｇＣＯ３ ０．６ｇ／Ｌ
ＣａＣＯ３ ０．１２ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ５０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １８ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ４ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４ １．２ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４ＶＯ３ ０．５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１ ２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２ ５μｇ／Ｌ
本明細書において使用される用語「平面培地」とは、各種培地成分に寒天2g/Lを添加したものをいう。
アスパラギン酸 ０．３ｇ／Ｌ
グルコース １２．５ｇ／Ｌ
グルタミン酸 ４ｇ／Ｌ
グリシン ０．３ｇ／Ｌ
ヒスチジン塩酸塩 ０．０５ｇ／Ｌ
リンゴ酸 ６．５ｇ／Ｌ
クエン酸・３Ｎａ ０．５ｇ／Ｌ
コハク酸・２Ｎａ ０．１ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５ｇ／Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ３ ０．２５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．２５ｇ／Ｌ
ＭｇＣＯ３ ０．６ｇ／Ｌ
ＣａＣＯ３ ０．１２ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ５０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １８ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ４ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４ １．２ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４ＶＯ３ ０．５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ０．６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１ ２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２ ５μｇ／Ｌ
本明細書において使用される用語「平面培地」とは、各種培地成分に寒天2g/Lを添加したものをいう。
本発明は、増殖速度において優れた新規のユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）を提供する。
（１．ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｋｉｓｈｕ株の培養法）
本発明のユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｋｉｓｈｕ株は、周知の培養法によって培養することができる。種々の所望の生産物を産生するための培養法もまた周知である。
本発明のユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｋｉｓｈｕ株は、周知の培養法によって培養することができる。種々の所望の生産物を産生するための培養法もまた周知である。
例えば、本発明のユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｋｉｓｈｕ株の培養工程においては、前記微細藻類の酸素呼吸を維持させるべく、酸素を含むガスを培養液に供給することができる。また、培養工程においては、前記微細藻類の光合成を促すべく、二酸化炭素を含むガスを培養液に供給することができる。斯かるガスの供給は、培養液を曝気すること、培養液を撹拌することなどにより行うことができる。具体的には、培養工程においては、前記微細藻類に呼吸用の酸素を供給すべく、例えば空気によって培養液を曝気することができる。また、培養工程においては、前記微細藻類の光合成を促進させるべく、例えば、二酸化炭素を比較的多く含む排気ガスなどによって培養液を曝気することができる。
培養工程においては、曝気等によって培養液中に酸素及び二酸化炭素を供給しつつ、光独立栄養培養及び従属栄養培養を同時に行うことが好ましい。即ち、培養工程においては、前記微細藻類の酸素呼吸及び光合成を促進させるべく、酸素及び二酸化炭素の両方を含むガスを曝気等によって培養液に供給しつつ、有機栄養素の存在下で従属栄養培養を行いながら、光を照射することによって光従属栄養培養を行うことが好ましい。
培養工程においては、昼などにて、前記微細藻類に光を照射しつつ培養液に二酸化炭素を供給することによって前記微細藻類の光合成を促進させることができる。また、夜などの光が照射されないときに、有機栄養素の存在下で培養液に空気を供給して前記微細藻類を従属栄養培養することができる。
このようにして培養工程を実施することにより、前記微細藻類の増殖がより促進され、しかも、前記微細藻類によるパラミロン等の産生がより促進されるという利点がある。
さらに、前記微細藻類は、タンパク質、及び、脂質、色素やビタミン類などの二次代謝物などを産生しつつ増殖し得る。
培養工程において前記微細藻類に照射される光は、前記微細藻類に光合成をさせるものであれば、特に限定されない。該光としては、例えば、太陽からの自然光、又は、照明からの光などの人工光等が採用される。光独立栄養培養工程において照射する光の強度は、特に限定されるものではないが、通常、５０μｍｏｌ／ｍ2・ｓ〜２００μｍｏｌ／ｍ2・ｓである。培養工程においては、前記微細藻類に光を照射する期間と、前記微細藻類に光を照射しない期間とを交互に繰り返すことができる。培養工程においては、光独立栄養培養を行う期間と、光独立栄養培養を行わない期間とを交互に繰り返すことができる。
培養工程において光を照射する期間は、通常、日光が出ている昼の時間に相当する８時間〜１５時間である。また、微細藻類の光合成を抑制すべく光を照射しない暗条件の期間は、通常、日光が出ていない夜の時間に相当する９時間〜１６時間である。これらの期間は、状況や目的に応じて変化させることができる。
なお、光を照射しない暗条件下とは、光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）が５０μｍｏｌ／ｍ2・ｓ以下の条件である。
一方で、培養工程においては、上述した栄養素のうちの有機栄養素の存在下にて微細藻類を培養する従属栄養培養を行うこともできる。培養工程において有機栄養素の存在下にて前記微細藻類を培養すると、微細藻類は、有機栄養素を細胞内に取り込み、少なくともパラミロンなどの多糖類を産生しつつ増殖し得る。
（２．変異株の作製）
前記変異株は、例えば、一般的な突然変異処理を施すこと、又は経代培養による適応若しくは自然変異により作製される。
前記変異株は、例えば、一般的な突然変異処理を施すこと、又は経代培養による適応若しくは自然変異により作製される。
前記突然変異処理は、一般的な変異原を用いて行われ得る。変異原としては、例えば、変異原作用を有する薬剤、紫外線などが挙げられる。変異原作用を有する薬剤としては、例えば、ストレプトマイシン、オフロキサシン、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシル等のヌクレオチド塩基類似体、又は、アクリジン類などが挙げられる。
本発明の変異株は、代表的には、Ｋｉｓｈｕ株の比増殖速度と比較して、少なくとも１２０％以下の比増殖速度、少なくとも１１５％以下の比増殖速度、少なくとも１１０％以下の比増殖速度、少なくとも１０５％以下の比増殖速度、または、少なくとも１００％以下の比増殖速度を示す。比増殖速度を決定・比較するための培養条件は特に限定されることはないが、代表的には、ＫＨ培地、遮光した暗条件、２５℃での振とう培養である。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提
供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定され
るものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定され
るものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１：Ｋｉｓｈｕ株の単離）
和歌山県の池から採集した水１００ｍｌに、硫酸アンモニウム０．９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．４５ｇ／Ｌを添加し（ｐＨ２．９）、直射日光の当たらない窓際に静置し、室温で１０日間培養した。培地中の対象微細藻類をキャピラリーで分取し、独立栄養平面培地で３日間培養した。得られたコロニーを滅菌水で希釈し、ＫＨ平面培地で４日間培養した。さらに、得られたコロニーをＫＨ培地で４日間培養した。
和歌山県の池から採集した水１００ｍｌに、硫酸アンモニウム０．９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．４５ｇ／Ｌを添加し（ｐＨ２．９）、直射日光の当たらない窓際に静置し、室温で１０日間培養した。培地中の対象微細藻類をキャピラリーで分取し、独立栄養平面培地で３日間培養した。得られたコロニーを滅菌水で希釈し、ＫＨ平面培地で４日間培養した。さらに、得られたコロニーをＫＨ培地で４日間培養した。
Ｋｉｓｈｕ株は、２０１５年１１月３０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）。
（実施例２：Ｋｉｓｈｕ株の特徴付け（１） １８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析）
単離したＫｉｓｈｕ株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を下記の方法で決定した。
・ＤＮＡ抽出は、物理的破壊およびＭａｒｍｕｒ（１９６１）の改変法を用いた。
・ＰＣＲには、以下を使用した： ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ，滋賀）
・サイクルシークエンスには、以下を使用した： ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）
・ＰＣＲ増幅用プライマーは、以下のとおりである： １８Ｆ， １８Ｒ （Ｕｅｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｍｉｋａｔａ， １９９９）
・配列決定用プライマーは、以下のとおりである：
１８Ｆ， １８Ｒ， ５５０Ｒ（Ｕｅｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｍｉｋａｔａ， １９９９）
ＳＲ４ （Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ， ２００５）
ＳＲ８， ＳＲ９ （Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）
・シークエンスには、以下を利用した： ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）
・配列決定には、以下を利用した： ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．７ （Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ｔｅｗａｎｔｉｎ， ＡＵＳ））
・相同性検索には、以下を利用した：ソフトウェア アポロン３．０ 国際塩基配列データベース （ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）。
単離したＫｉｓｈｕ株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を下記の方法で決定した。
・ＤＮＡ抽出は、物理的破壊およびＭａｒｍｕｒ（１９６１）の改変法を用いた。
・ＰＣＲには、以下を使用した： ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ，滋賀）
・サイクルシークエンスには、以下を使用した： ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）
・ＰＣＲ増幅用プライマーは、以下のとおりである： １８Ｆ， １８Ｒ （Ｕｅｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｍｉｋａｔａ， １９９９）
・配列決定用プライマーは、以下のとおりである：
１８Ｆ， １８Ｒ， ５５０Ｒ（Ｕｅｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｍｉｋａｔａ， １９９９）
ＳＲ４ （Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ， ２００５）
ＳＲ８， ＳＲ９ （Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）
・シークエンスには、以下を利用した： ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）
・配列決定には、以下を利用した： ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．７ （Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ｔｅｗａｎｔｉｎ， ＡＵＳ））
・相同性検索には、以下を利用した：ソフトウェア アポロン３．０ 国際塩基配列データベース （ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）。
決定した塩基配列をＢＬＡＳＴホモロジー検索を用いてＧｅｎＢａｎｋから得た既知のユーグレナ属の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と比較し、相同性を算出した。上位５塩基配列との相同率は、以下の表１のとおりである。
Ｅｕｇｌｅｎａ属の分子系統学的研究に関する各種文献（Ｋｏｓｍａｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｌｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を参考に国際塩基配列データベースより１８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を取得し、近隣結合法にて分子系統解析を行った。その結果、単離した新規微細藻類がユーグレナ・グラシリス種であることを同定した。結果を図２に示す。
（実施例３：Ｋｉｓｈｕ株の特徴付け（２） ＲＡＰＤ解析）
単離したユーグレナ属微細藻類Ｋｉｓｈｕ株と、既知のユーグレナ属微細藻類とを比較するために、ＲＡＰＤ解析（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）（参考文献：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ら．（１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（２２）， ６５３１−６５３５）によって、Ｋｉｓｈｕ株のバンドパターンと、国立環境研究所保存株２株（ＮＩＥＳ−４７、ＮＩＥＳ−４８）のバンドパターンとを比較した。
単離したユーグレナ属微細藻類Ｋｉｓｈｕ株と、既知のユーグレナ属微細藻類とを比較するために、ＲＡＰＤ解析（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）（参考文献：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ら．（１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（２２）， ６５３１−６５３５）によって、Ｋｉｓｈｕ株のバンドパターンと、国立環境研究所保存株２株（ＮＩＥＳ−４７、ＮＩＥＳ−４８）のバンドパターンとを比較した。
ＲＡＰＤ解析におけるＰＣＲ条件は、下記の通りである：
サンプル数：２
ゲノムＤＮＡ：３００ｎｇ以下
プライマー１：ＡＴＣＧＧＧＴＣＣＧ
酵素：Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）
反応バッファー量：３０μｌ
ＰＣＲの温度条件は、以下に示す通り。
サンプル数：２
ゲノムＤＮＡ：３００ｎｇ以下
プライマー１：ＡＴＣＧＧＧＴＣＣＧ
酵素：Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）
反応バッファー量：３０μｌ
ＰＣＲの温度条件は、以下に示す通り。
・変性 ９４℃ １分間
・以下を３５サイクル
変性 ９４℃ １分間
結合 ４０℃ ４５秒間
伸長 ７２℃ １分間
・伸長 ７２℃ ７分間。
・以下を３５サイクル
変性 ９４℃ １分間
結合 ４０℃ ４５秒間
伸長 ７２℃ １分間
・伸長 ７２℃ ７分間。
ＲＡＰＤ解析における比較対象株として、以下を使用した：
Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ ＮＩＥＳ−４８
Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ ＮＩＥＳ−４７。
Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ ＮＩＥＳ−４８
Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ ＮＩＥＳ−４７。
プライマーをプライマー２（ＧＣＧＡＴＣＣＣＣＡ）に換え、同様の条件でのＰＣＲを用いてＲＡＰＤ解析を行った。
その他の条件は、以下のとおりである：
泳動条件：２．５質量％アガロースゲル、１００Ｖ、４０分
ＤＮＡマーカー：ＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒ １ｋｂ（日本ジェネティクス株式会社）。
泳動条件：２．５質量％アガロースゲル、１００Ｖ、４０分
ＤＮＡマーカー：ＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒ １ｋｂ（日本ジェネティクス株式会社）。
なお、上記プライマー１，２の塩基配列は、Ｍｏｓｔａｆａ ら． （２０１１） Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １６， ２５９８−２６０８ に記載されているものである。上記のプライマー１を用いてＲＡＰＤ解析を行った結果（バンドパターン）を図３に示す。また、上記のプライマー２を用いてＲＡＰＤ解析を行った結果を図４に示す。
ＲＡＰＤ解析の結果から、Ｋｉｓｈｕ株のバンドパターンが、既知のユーグレナ属微細藻類（ＮＩＥＳ−４７、ＮＩＥＳ−４８）のバンドパターンと異なることがわかった。従って、単離したユーグレナ属微細藻類Ｋｉｓｈｕ株は、既知のユーグレナ属微細藻類と異なる株であると判断した。
そして、上記のごとく単離したユーグレナ属微細藻類をユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のＫｉｓｈｕ株と命名した。
（実施例４：Ｋｉｓｈｕ株の特徴付け（３） ＮＩＥＳ−４８株とＫｉｓｈｕ株の増殖性及びＴＯＣ除去率の比較）
単離したユーグレナ属微細藻類（Ｋｉｓｈｕ株）の優位性を確認するため、以下の条件で培養を行い、比増殖速度およびＴＯＣ除去率について既知のユーグレナ微細藻類（ＮＩＥＳ−４８）との比較実験を行った。実験条件は、以下のとおりである：
［培養株］：ＮＩＥＳ−４８株、Ｋｉｓｈｕ株
［培養液］：ＫＨ培地（前述の通り） １５０ｍｌ
［培養液のｐＨ］：３．５
［培養温度］：２５℃
［培養容器］：３００ｃｃ三角フラスコ
［培養液へのガスの供給］：１８０ｒｐｍの振とう
（培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する）
［培養時の明暗条件］：遮光した暗条件にて培養。
数時間毎にサンプリングを行い、以下の式に従い比増殖速度(μ)算出した。：
μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１）
μは単位時間あたりの細胞量の増加を示す。ｔ２およびｔ１は時間を示す（ただし、ｔ２＞ｔ１）。ｍｔ１は時間ｔ１におけるバイオマスを示す。ｍｔ２は時間ｔ２におけるバイオマスを示す。
単離したユーグレナ属微細藻類（Ｋｉｓｈｕ株）の優位性を確認するため、以下の条件で培養を行い、比増殖速度およびＴＯＣ除去率について既知のユーグレナ微細藻類（ＮＩＥＳ−４８）との比較実験を行った。実験条件は、以下のとおりである：
［培養株］：ＮＩＥＳ−４８株、Ｋｉｓｈｕ株
［培養液］：ＫＨ培地（前述の通り） １５０ｍｌ
［培養液のｐＨ］：３．５
［培養温度］：２５℃
［培養容器］：３００ｃｃ三角フラスコ
［培養液へのガスの供給］：１８０ｒｐｍの振とう
（培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する）
［培養時の明暗条件］：遮光した暗条件にて培養。
数時間毎にサンプリングを行い、以下の式に従い比増殖速度(μ)算出した。：
μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１）
μは単位時間あたりの細胞量の増加を示す。ｔ２およびｔ１は時間を示す（ただし、ｔ２＞ｔ１）。ｍｔ１は時間ｔ１におけるバイオマスを示す。ｍｔ２は時間ｔ２におけるバイオマスを示す。
その結果、図５の増殖曲線及び図６に見られるＴＯＣ除去率を得た。ＮＩＥＳ−４８株及びＫｉｓｈｕ株の比増殖速度（μ）は、それぞれＮＩＥＳ−４８株 ０．０６６／ｈ、Ｋｉｓｈｕ株 ０．０９０／ｈとなった（図５参照）。また、培養９６時間後のＫＨ培地のＴＯＣ除去率は、ＮＩＥＳ−４８株７１．５％、Ｋｉｓｈｕ株 ８４．１％となった（図６）。結果から、Ｋｉｓｈｕ株は既存株よりも高い増殖性とＴＯＣ除去率を示すことがわかった。
（実施例５：Ｋｉｓｈｕ株の特徴付け（４） ＮＩＥＳ−４８株とＫｉｓｈｕ株の塩ストレス耐性の比較）
Ｋｉｓｈｕ株の塩ストレス耐性を評価するため、以下の塩濃度培地を用いて５日間培養を行い、既知のユーグレナ属微細藻類（ＮＩＥＳ−４８）との増殖比較実験を行った：
［培養株］：ＮＩＥＳ−４８株、Ｋｉｓｈｕ株
［培養液］：ＫＨ培地（前述の通り） １５０ｍｌ
（ＮａＣｌを０％、０．５％、０．７５％、１％（終濃度）になるように添加）
［培養液のｐＨ］： ３．５
［培養温度］：２５℃
［培養容器］：３００ｃｃ三角フラスコ
［培養液へのガスの供給］：１８０ｒｐｍの振とう
（培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する）
［培養時の明暗条件］：遮光した暗条件にて培養
数時間毎にサンプリングを行い、以下の式に従い比増殖速度(μ)算出した。：
μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１）
μは単位時間あたりの細胞量の増加を示す。ｔ２およびｔ１は時間を示す（ただし、ｔ２＞ｔ１）。ｍｔ１は時間ｔ１におけるバイオマスを示す。ｍｔ２は時間ｔ２におけるバイオマスを示す。
Ｋｉｓｈｕ株の塩ストレス耐性を評価するため、以下の塩濃度培地を用いて５日間培養を行い、既知のユーグレナ属微細藻類（ＮＩＥＳ−４８）との増殖比較実験を行った：
［培養株］：ＮＩＥＳ−４８株、Ｋｉｓｈｕ株
［培養液］：ＫＨ培地（前述の通り） １５０ｍｌ
（ＮａＣｌを０％、０．５％、０．７５％、１％（終濃度）になるように添加）
［培養液のｐＨ］： ３．５
［培養温度］：２５℃
［培養容器］：３００ｃｃ三角フラスコ
［培養液へのガスの供給］：１８０ｒｐｍの振とう
（培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する）
［培養時の明暗条件］：遮光した暗条件にて培養
数時間毎にサンプリングを行い、以下の式に従い比増殖速度(μ)算出した。：
μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１）
μは単位時間あたりの細胞量の増加を示す。ｔ２およびｔ１は時間を示す（ただし、ｔ２＞ｔ１）。ｍｔ１は時間ｔ１におけるバイオマスを示す。ｍｔ２は時間ｔ２におけるバイオマスを示す。
その結果、図７に見られる比増殖速度を得た。この試験結果から、Ｋｉｓｈｕ株は塩存在下において増殖速度は低下するものの、常にＮＩＥＳ−４８株の比増殖速度を上回ることが示された。特に、ＮａＣｌが１％存在する場合においては２倍の比増殖速度を示した。このことから、Ｋｉｓｈｕ株は既存株よりも強い塩ストレス耐性を有することがわかった。
（実施例６：Ｋｉｓｈｕ株の特徴付け（５） ＮＩＥＳ−４８株とＫｉｓｈｕ株の高温耐性の比較）
Ｋｉｓｈｕ株の高温耐性を評価するため、以下の温度条件において３日間培養を行い、既知のユーグレナ属微細藻類（ＮＩＥＳ−４８）との増殖比較実験を行った。培養は以下の条件で行った：
［培養株］：ＮＩＥＳ−４８株、Ｋｉｓｈｕ株
［培養液］：ＫＨ培地（前述の通り） １５０ｍｌ
［培養液のｐＨ］： ３．５
［培養温度］：１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃
［培養容器］：３００ｃｃ三角フラスコ
［培養液へのガスの供給］：１８０ｒｐｍの振とう
（培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する）
［培養時の明暗条件］：遮光した暗条件にて培養
数時間毎にサンプリングを行い、以下の式に従い比増殖速度(μ)算出した。：
μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１）
μは単位時間あたりの細胞量の増加を示す。ｔ２およびｔ１は時間を示す（ただし、ｔ２＞ｔ１）。ｍｔ１は時間ｔ１におけるバイオマスを示す。ｍｔ２は時間ｔ２におけるバイオマスを示す。
Ｋｉｓｈｕ株の高温耐性を評価するため、以下の温度条件において３日間培養を行い、既知のユーグレナ属微細藻類（ＮＩＥＳ−４８）との増殖比較実験を行った。培養は以下の条件で行った：
［培養株］：ＮＩＥＳ−４８株、Ｋｉｓｈｕ株
［培養液］：ＫＨ培地（前述の通り） １５０ｍｌ
［培養液のｐＨ］： ３．５
［培養温度］：１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃
［培養容器］：３００ｃｃ三角フラスコ
［培養液へのガスの供給］：１８０ｒｐｍの振とう
（培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する）
［培養時の明暗条件］：遮光した暗条件にて培養
数時間毎にサンプリングを行い、以下の式に従い比増殖速度(μ)算出した。：
μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１）
μは単位時間あたりの細胞量の増加を示す。ｔ２およびｔ１は時間を示す（ただし、ｔ２＞ｔ１）。ｍｔ１は時間ｔ１におけるバイオマスを示す。ｍｔ２は時間ｔ２におけるバイオマスを示す。
その結果、図８に見られる比増殖速度を得た。この試験結果から、Ｋｉｓｈｕ株はＮＩＥＳ−４８株の増殖が著しく低下する３５℃においても高い比増殖速度を示すことがわかった。このことから、Ｋｉｓｈｕ株は既存株よりも高温耐性を有しているといえる。
従来のユーグレナ属微細藻類と比較して、増殖性が優れた（例えば、より高い比増殖速度を有する）新規のユーグレナ属微細藻類を提供する。
Ｋｉｓｈｕ株は、２０１５年１１月３０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）
配列番号１：Ｋｉｓｈｕ株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
配列番号２：ＲＡＰＤ解析のプライマー１
配列番号３：ＲＡＰＤ解析のプライマー２
配列番号２：ＲＡＰＤ解析のプライマー１
配列番号３：ＲＡＰＤ解析のプライマー２
Claims (8)
- ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）。
- ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、増殖至適温度が３５℃である、変異株。
- ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、少なくともＫｉｓｈｕ株の比増殖速度を有する、変異株。
- ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に属するＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、１％ ＮａＣｌ存在下においてＮＩＥＳ−４８株の２倍の比増殖速度を有する、変異株。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株を培養する工程を包含する、多糖類、タンパク質、脂肪酸、脂質、ビタミン類、および、油からなる群から選択される物質を生産する方法。
- 前記物質が多糖類である、請求項５に記載の方法。
- 前記多糖類がパラミロンである、請求項６に記載の方法。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＫｉｓｈｕ株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２２３００）またはその変異株を培養する方法であって、ＫＨ培地中で培養する工程を包含する、方法。
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| WO2014157077A1 (ja) * | 2013-03-27 | 2014-10-02 | 国立大学法人筑波大学 | ユーグレナ属微細藻類、多糖類の製造方法、及び有機化合物の製造方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2003137744A (ja) * | 2001-10-29 | 2003-05-14 | Iwase Cosfa Kk | 育毛・養毛剤 |
| JP2010090065A (ja) * | 2008-10-08 | 2010-04-22 | Nihon Kolmar Co Ltd | 化粧料 |
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