WO2022149590A1 - 微生物資材および植物の栽培方法、並びに、細菌株 - Google Patents

微生物資材および植物の栽培方法、並びに、細菌株 Download PDF

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strain
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ottawaense
bacterial
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究 南澤
沙和 原
学 板倉
シケイラ アルトゥール フェルナンデス
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国立大学法人東北大学
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the disclosure in this application relates to microbial materials and plant cultivation methods, as well as bacterial strains.
  • Bradyrhizobium soybean root nodules are plant symbiotic microorganisms that coexist with soybean roots to form nodules and fix nitrogen in the atmosphere, and most of them also possess denitrifying ability.
  • B. Nitrous oxide carries the N 2 O reductase gene (nos) that reduces N 2 O ⁇ N 2 , which is the final reaction of denitrification. N 2 O generated in the denitrification process shows a greenhouse effect about 300 times that of CO 2 , and its reduction is an important issue.
  • B. possessing N 2 O reductase Inoculation of nitrous oxide in soybean fields can reduce the occurrence of N2O from the rhizosphere of soybeans.
  • the nos-enhanced mutant strains described in Non-Patent Documents 1 and 2 have a stronger N2O reducing ability as compared with the wild-type strain.
  • an international framework has been established to prevent adverse effects on biodiversity.
  • regulatory measures have been taken when using genetically modified organisms, etc. under the "Act on Ensuring Biological Diversity by Regulating the Use of Genetically Modified Organisms, etc.” (commonly known as the "Cartagena Act"). .. Therefore, the nos-enhanced mutant strains described in Non-Patent Documents 1 and 2 have a problem that they cannot be used in a natural environment. Therefore, it is desired to discover a bacterial strain that can promote the growth of plants by having a nitrogen - fixing ability and has an excellent N2O reducing ability.
  • the purpose of the disclosure of this application is to provide microbial materials and plant cultivation methods, as well as bacterial strains.
  • the bacterial strain is B.I.
  • OTU operational taxonomic unit
  • Bacterial strains were further analyzed by B.I.
  • the bacterial strain further has an ITS base sequence having 97% or more homology with the ITS (16S-23S rRNA intergene region) base sequence of Bradyrhizobium genus bacteria, (1), (2), and above.
  • a method for cultivating a plant which comprises a step of contacting the microbial material according to any one of (1) to (9) above with the seed or root of the plant, or allowing the microbial material to exist in the vicinity of the root of the plant.
  • the microbial material disclosed in this application has nitrogen - fixing ability and N2O reducing ability. Therefore, it is possible to promote the growth of plants and suppress the emission of N2O , which is a greenhouse gas.
  • FIG. 1A is an evolutionary tree of Bradyrhizobium genus bacterial strains by AMPHORA (housekeeping gene), and FIG. 1B is a diagram showing the function of each bacterial strain.
  • FIG. 2 is a graph in which the occupancy rate of the nodules formed in Example 1 was investigated.
  • FIG. 3 is a drawing substitute photograph
  • FIG. 3A is a photograph of soybean grown in Example 2
  • FIG. 3B is a photograph of soybean grown in Comparative Example 1.
  • FIG. 4 shows B.I. Wild strains belonging to the ottawaense clade, as well as B. It is a graph which shows the difference of the N 2 O reducing ability of the wild type strain belonging to a nitrous oxide clade, and the mutant strain which enhanced the N 2 O reducing ability.
  • FIG. 5A is an evolutionary tree of Bradyrhizobium genus bacterial strains by AMPHORA (housekeeping gene), and FIG. 5B is a diagram showing the function of each bacterial strain.
  • FIG. 6 is a drawing substitute photograph, which is a photograph of soybean grown in Example 3 (SG09, SF21, SH12), Comparative Example 2 (USDA110) and Comparative Example 3 (without inoculation).
  • FIG. 7 shows the dry weight of soybean root nodules grown in Example 3 and Comparative Example 2 (Nodules dry weight), and the number of nodules of soybean grown in Example 3 and Comparative Example 2 (Nodules Number).
  • FIG. 8 shows B.I. Wild strains belonging to the ottawaense clade, as well as B.
  • FIG. 9 shows relatively the N 2 O flux measured values of Example 4 (SG09) and Comparative Example 5 (110 ⁇ H1) when the N 2 O flux measured value of Comparative Example 4 (USDA 110) was set to 1. It is a graph.
  • the microbial material disclosed in the present application includes a bacterial strain belonging to the Bradyrhizobium genus ottawaense clade having nitrogen - fixing ability and N2O reducing ability (hereinafter, may be simply referred to as "bacterial strain").
  • bacterial strain belongs to the Bradyrhizobium genus ottawaense clade having nitrogen - fixing ability and N2O reducing ability
  • microbial material is a microorganism (bacterial strain) itself inoculated into soil or crop seeds for the purpose of improving the growth and health of plants, or a material obtained by adding other components to the microorganism. Means.
  • the new bacterial strain disclosed in this application is isolated from the sorghum root of the Fukushima Nihonmatsu field and belongs to Bradyrhizobium.
  • the genus Bradyrhizobium is known to have a nitrous oxide clade having an N 2 O reducing ability and a japonicum clade having no N 2 O reducing ability.
  • the new bacterial strain disclosed in this application is a good soybean rhizobia isolated in Canada. Included in the ottawaense clade. As a result of investigating the activities of many bacterial strains, the present inventors have found that some bacterial strains have N2O reducing ability but have nitrogen - fixing ability and some do not.
  • nitrogen-fixing ability means the ability to convert stable N 2 contained in the atmosphere into another nitrogen compound such as highly reactive NH 3 .
  • N 2 O reducing ability means the ability to reduce N 2 O generated in the process of nitrification and denitrification of NH 3 to N 2 .
  • the fact that the bacterial strain "has nitrogen-fixing ability and N2O - reducing ability” means that it has a gene that exerts the above-mentioned ability.
  • the bacterial strain disclosed in this application belongs to the ottawaense clade, and is not particularly limited as long as it has nitrogen - fixing ability and N2O reducing ability. As will be described later, the presence or absence of nitrogen fixation ability and N2O reduction ability may be measured from the screened bacterial strains.
  • B. OO99 which is an ottawaense reference strain
  • Bacterial strains disclosed in this application are B. In the evolutionary phylogenetic tree analysis including the operational taxonomic unit (OTU) containing the operational taxonomic unit OO99 and one or more Bradyrhizobium species thereof. It belongs to the clade containing the ottawaense reference strain OO99.
  • OTU operational taxonomic unit
  • the above OTU refers to a unit obtained when the base sequence of a bacterial essential gene (generally, a 16S ribosomal RNA gene) is classified on a computer using the similarity as an index. If the OTUs are the same, it can be said that they are evolutionarily composed of the same bacterial species.
  • the evolutionary tree analysis was performed using AMPHORA for dnaG, frr, infC, nusA, pgk, pyrG, rplA, rplB, rplC, rplD, rplE, rplF, rplK, rplL, rplM, rplN, rplP.
  • Bacterial strains were further analyzed by ANI (Average Nucleotide Identity) analysis.
  • the ANI value for the ottawaense reference strain OO99 may be 95% or more. If the ANI value is 95% or more, it can be determined to be of the same type.
  • the ANI analysis may be performed by a known method.
  • the bacterial strain may further have an ITS base sequence having 97% or more homology with the ITS (16S-23S rRNA intergene region) base sequence of Bradyrhizobium genus bacteria.
  • ITS is a region used for molecular phylogenetic analysis, and can be said to be the same species if it has 97% or more homology.
  • Examples of the bacterial strain include, but are not limited to, SG09, SG11, SF21, SH12 and the like.
  • SG09 was received by the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center on January 5, 2021, and the accession number is "NITE P-03361". SG09 was transferred to the Patent Microorganisms Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation as an international deposit based on the Budapest Treaty, and was received on November 8, 2021. The acceptance number is "NITE BP-03361".
  • any known medium can be used for culturing the bacterial strain disclosed in this application.
  • a solid medium such as a slope medium containing agar and a plate medium can also be used. By using these media, a bacterial strain can be grown to obtain a desired bacterial cell mass.
  • any substance that can be assimilated by the above bacterial strain can be used, and sugars such as glucose, galactose, lactose, arabinose, mannose, and malt extract starch hydrolyzate can be exemplified.
  • various synthetic or natural products that can be used by bacterial strains such as peptone, meat extract, and yeast extract can be used.
  • inorganic salts such as salt and phosphate
  • metal salts such as calcium, magnesium and iron
  • micronutrient sources such as vitamins and amino acids
  • the other components contained in the microbial material are not particularly limited as long as they are components generally contained in the microbial material.
  • examples thereof include carriers such as porous materials for adsorbing and stabilizing microorganisms, various organic materials used as nutrient sources during the growth of microorganisms, fertilizer components, other minerals, diluting agents, dispersants and the like.
  • the bacterial strains disclosed in this application have nitrogen - fixing ability and N2O reducing ability. Therefore, the microbial material containing the bacterial strain functions not only as a plant growth promoter but also as an agent for suppressing the release of N2O from the field. Examples of plants that promote growth include legumes (soybean, peanut, mung bean, etc.), grasses (sorghum, corn, wheat, barley, etc.) and the like.
  • the method for cultivating a plant disclosed in the present application includes a step of contacting the above-mentioned microbial material with the seed or root of the plant or allowing the microbial material to exist in the vicinity of the root of the plant.
  • the step promotes the growth of the plant.
  • the "root” means a portion in the soil or hydroponic solution that absorbs water and nutrients when a plant is cultivated.
  • promoting growth means promoting the growth of the host plant by fixing nitrogen regardless of the presence or absence of nodule formation.
  • Bacterial extracts were prepared from surface-sterilized sorghum roots, and the extract was inoculated into soybean seeds to isolate Bradyrhizobium spp. From root nodules formed. The specific procedure is as follows.
  • sorghum roots harvested from a field in Nihonmatsu City, Fukushima Prefecture were washed with 70% ethanol and then immersed in 2.5% NaOCl at room temperature for 10 minutes for surface sterilization. After washing 10 times with sterilized distilled water, the mixture was pulverized using a sterilized milk bowl and a milk stick while freezing in liquid nitrogen. Approximately 200 mL of Tris-HCl buffer (50 mM, pH 7.5) was added to the ground product, mixed well, and filtered using Miracloth (Milipore) to remove plant residues.
  • Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7.5
  • ITS array The 16S-23S rRNA intergenic region (ITS) of the isolate was amplified by the PCR method, and then the base sequence was determined by the Sanger method.
  • Blend taq registered trademark
  • Saeki et al. "Growing of Bradyrhizobium USDA Strines by Sequence Analysis of 16S rDNA and 16S-23S rDNA Transcription Specter Region", Soil. Plant Nutr. , 50 (4), 517-525, 2004, using ITS-F and ITS-R, the composition of the PCR reaction solution shown in Table 1 was carried out under the reaction conditions shown in Table 2.
  • the determined ITS sequence was BLAST-searched by NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), and it was confirmed that SG09 and SG11 obtained this time belong to the genus Bradyrhizobium.
  • the N2O reduction activity was measured by observing a decrease in the added N2O .
  • the target strain was inoculated into 15 mL of HMM medium (Sameshima-Saito et al. 2006) in a 75 mL volume test tube, and pre-cultured at 30 ° C. under aerobic conditions for about 6 hours.
  • a butyl rubber stopper was attached to the test tube containing the bacterial solution, and the gas phase was replaced with 4.98% N2O gas ( 95.02% N2 ). Shaking culture was carried out for 12 to 14 hours to induce N2O reduction.
  • the medium added to maintain the anaerobic condition and the gas phase in the test tube were degassed with N 2 gas in advance, and the dead space of the plastic syringe and needle to be used was also washed with N 2 gas three times.
  • 10 mL of the prepared bacterial solution was transferred to a sterile test tube filled with 100% N2 gas, and the amount of the bacterial solution and the amount of gas phase were adjusted between the strains.
  • the volume of the test tube was 73.8 ⁇ 0.2 mL with the butyl rubber stopper attached, and the volume of the gas phase was 63.8 mL.
  • FIG. 1A is an evolutionary tree of Bradyrhizobium genus bacterial strains by AMPHORA (housekeeping gene), and FIG. 1B is a diagram showing the function of each bacterial strain.
  • N 2 fixation nitrogen fixation
  • nodulation nodule formation
  • ⁇ indicates that the gene cluster is possessed
  • ⁇ indicates that the gene cluster is not possessed.
  • Denitrification ⁇ indicates that the gene cluster is possessed, while ⁇ indicates the nos gene cluster ( an enzyme that reduces N2O to N2 , etc.), which is the final process of denitrification. It indicates that there is a gene cluster), and ⁇ indicates that there is no nos gene cluster.
  • known Bradyrhizobium genus bacterial strains are shown in FIG. 1 for comparison.
  • OO99 which is a known soybean rhizobia contained in the ottawaense clade
  • TM102, TM233, and TM239 contained in the ottawaense clade refer to Shintaro Hara et al. , "Identification of Nitrogen-Fixing Bradyrhizobium Associated With Fields of Field-Green Sorghum by Metagenomics 10"
  • the SG09 strain showed an ANI value of 99.08% with respect to the OO99 strain.
  • the SG09 strain obtained this time is a bacterial strain that is the same as but different from OO99, which is a known soybean root nodule bacterium contained in the ottawaense clade, and (2) a bacterium contained in the ottawaense clade. It was confirmed that some strains had N2O reducing ability but some had nitrogen - fixing ability and some did not.
  • a microbial material was prepared by suspending the SG09 strain isolated in the above [isolation of bacterial strain] in sterile water. Next, the SG09 strain and a known soybean rhizobia are B.I.
  • a microbial material was prepared by mixing diazoefficiens USDA110 and USDA122 (BCRC number: 13533) belonging to the same cluster in 16S ribosomal RNA gene phylogenetic analysis at a density of 0.5 ⁇ 10 7 cells / mL at a ratio of 1: 1. For more information on USDA122, see Masayuki Sugawara et al.
  • FIG. 2 is a graph investigating the occupancy rate of the formed nodules. As is clear from FIG. 2, although the number of cells of the inoculated bacterial strain was the same, the predominance of SG09 in the soybean nodules after 26 days was about 74%. From the above results, the competitive nodule forming ability of SG09 is known as soybean rhizobia. It was found to be superior to diazoefficiens USDA122.
  • FIG. 3A shows a photograph of soybean grown in Example 2 on the 26th day after inoculation.
  • FIG. 3B shows a photograph of soybean grown in Comparative Example 1.
  • FIG. 4 shows B.I. Wild strains (SG09, OO99) belonging to the ottawaense clade, as well as B. It is a graph which shows the difference in the N 2 O reducing ability of the wild type strain (USDA110, JCM number: 10833) belonging to the diazoefficiens clade and the mutant strain (USDA110 ⁇ H1, USDA110 ⁇ nasS) whose N2O reducing ability was enhanced by genetic engineering. ..
  • USDA110 ⁇ H1 is a mutant strain genetically engineered according to the procedure described in Non-Patent Document 1
  • USDA110 ⁇ nasS is a mutant strain genetically engineered according to the procedure described in Non-Patent Document 2.
  • the measured value in FIG . 4 is the value measured by the above [Measurement of N2O reducing activity].
  • N 2 O reducing ability is about 5.4 times higher than that of USDA110, which is a wild strain belonging to the nitrorous oxide clade, and N 2 O is similar to USDA110 ⁇ H1 and USDA110 ⁇ nasS, which are mutant strains with enhanced N2O reducing ability. It was confirmed that it has a reducing ability. In addition, in the significant difference test performed by Tukey's HSD test, it was confirmed that a and b were significantly different at p ⁇ 0.05.
  • FIG. 5A is an evolutionary tree of Bradyrhizobium genus bacterial strains by AMPHORA (housekeeping gene), and FIG. 5B is a diagram showing the function of each bacterial strain.
  • the explanations of the symbols ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ) in the columns of “N 2 fixation”, “Nodule” and “Denitrification” in FIG. 5B are the same as those in FIG. 1B.
  • the SF21 strain showed an ANI value of 99.1% with respect to the OO99 strain
  • SH12 The strain showed an ANI value of 99.1% with respect to the OO99 strain.
  • SF21 strain and SH12 strain are bacterial strains that are the same as but different from the known soybean rhizobia OO99 contained in the ottawaense clade.
  • Microbial materials were prepared by suspending the separated SG09 strain, SF21 strain, and SH12 strain in sterile water so as to have a density of 1 ⁇ 10 9 cells / mL, respectively.
  • Five soybean seeds (Glycine max, cv. Enteri) surface-sterilized with 0.5% sodium hypochlorite were sown in a Leonardo jar pot containing sterile vermiculite, and 1 ml of microbial material was inoculated.
  • Cultivation was carried out in an artificial meteorological instrument at 25 ° C., 16 hours in the light period / 8 hours in the dark period, and on the 3rd day after sowing, 3 individuals with good germination were left and thinned out, and then cultivated for 27 days.
  • the pots were regularly supplied with nitrogen-free hydroponic solution. After cultivation, nodules were collected for each pot. After measuring the number of nodules in each pot, the nodules were dried at 80 ° C. for 48 hours, and the dry weight was immediately measured.
  • FIG. 6 shows photographs of soybeans grown in Example 3, Comparative Example 2 and Comparative Example 3.
  • the growth condition of the soybean inoculated with the microbial material of Example 3 is slightly inferior to that of the microbial material of Comparative Example 2 using the known soybean rhizobia, but the comparative example in which the microbial material was not inoculated. It was better than 3.
  • FIG. 7 shows the dry weight of nodules of soybeans grown in Example 3 and Comparative Example 2 (Nodules dry weight), and the number of nodules of soybeans grown in Examples 3 and 2 (Nodules Number).
  • Nodules dry weight the dry weight of nodules of soybeans grown in Example 3 and Comparative Example 2
  • Nodules Number the number of nodules of soybeans grown in Examples 3 and 2
  • the soil from the Tohoku University Kashimadai field was used for the nodule aging treatment.
  • the soil was sieved with a 2 mm sieve, and 10 g each was placed in a 50 ml centrifuge tube as many as the number of pots.
  • 30 ml of distilled water was added to the centrifuge tube, shaken for 10 minutes, and then centrifuged at 5000 g for 10 minutes, and the supernatant was discarded. After repeating this 3 times, 30 ml of distilled water was added to the centrifugal tube and the soil was well suspended.
  • the above-ground part was excised and 10 g of soil suspended in 30 ml of distilled water was added to the pot in which the root system (including nodules) remained. After that, the nodules were allowed to age under the conditions of 25 ° C. for 20 days and 16 hours in the light period / 8 hours in the dark period.
  • N2 O flux measurement The root system was collected from the pot, placed in a 60 mL glass vial, sealed, and incubated at 25 ° C. for 3 hours. The gas phase was sampled before and after the incubation, and the N2O concentration in the gas phase was measured using an ECD gas chromatograph ( Shimazu, GC2014 ) to determine the N2O flux under atmospheric conditions.
  • FIG. 9 shows N 2 O of Example 4 and Comparative Example 5 when the measured value of N 2 O flux of the USDA110 strain of Comparative Example 4 (a wild strain of B. diazoefficiens, which is a known soybean rhizobia) was set to 1. It is a graph which showed the flux measurement value relatively.
  • the wild strain SG09 strain (Example 4) can reduce the N 2 O flux of the wild strain USDA110 by about 50%, and can reduce the N 2 O reducing ability by genetic engineering. It was confirmed that the N 2 O flux could be reduced to almost the same level as in Comparative Example 5 which was an enhanced mutant strain (USDA110 ⁇ H1).
  • B. Bacterial strains belonging to the ottawaense clade have (1) high N2O reducing ability even in wild strains, ( 2 ) some strains have nitrogen-fixing ability and some do not, and (3) have nitrogen-fixing ability. It was confirmed that the strain coexists with soybean and promotes growth. Therefore, B. has a nitrogen-fixing ability and an N2O - reducing ability.
  • the microbial material disclosed in this application By using the microbial material disclosed in this application, it is possible to promote the growth of plants and reduce N2O emissions into the atmosphere. Therefore, the microbial materials disclosed in this application are useful in the agricultural field.

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Abstract

窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能に優れた細菌株および該細菌株を含む微生物資材を提供することを課題とする。　窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する細菌株を含む微生物資材により課題を解決できる。

Description

微生物資材および植物の栽培方法、並びに、細菌株
　本出願における開示は、微生物資材および植物の栽培方法、並びに、細菌株に関する。
　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ダイズ根粒菌はダイズの根に共生し根粒を形成し、大気中の窒素固定を行う植物共生微生物であり、その多くは脱窒能も保有している。その中でも、Ｂ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓは脱窒の最終反応であるＮ2Ｏ→Ｎ2の還元を行うＮ2Ｏ還元酵素遺伝子（ｎｏｓ）を保有している。脱窒過程で生じるＮ2ＯはＣＯ2の約３００倍の温室効果を示し、その削減は重要な課題である。Ｎ2Ｏ還元酵素を保有するＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓのダイズ圃場への接種により、ダイズ根圏からのＮ2Ｏ発生を削減できる。また、遺伝子組換え技術によりＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓのＮ2Ｏ還元活性を強化することも知られている（非特許文献１、２参照）。
Ｋ．Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｕｓ　ｏｘｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ＮａｓＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ",Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１７，９（４），ｐ３８９－３９６ Ｋ．Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｔｈｅ　ｎｉｔｒａｔｅ－ｓｅｎｓｉｎｇ　ＮａｓＳＴ　ｓｙｓｔｅｍ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｎｉｔｒｏｕｓｏｘｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎ　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ"，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１１１１／１４６２－２９２０．１２５４６
　非特許文献１および２に記載されているｎｏｓ強化変異株は、野生株と比較してより強力なＮ2Ｏ還元能を有する。しかしながら、遺伝子組換え生物等の使用については、生物の多様性へ悪影響が及ぶことを防ぐため国際的な枠組みが定められている。日本においても、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（通称「カルタヘナ法」）により、遺伝子組換え生物等を用いる際の規制措置が講じられている。したがって、非特許文献１および２に記載されているｎｏｓ強化変異株は、自然環境中で使用できないという問題がある。そのため、窒素固定能を有することで植物の生育を促進することができ、且つ、Ｎ2Ｏ還元能に優れた細菌株の発見が望まれる。
　本出願の開示は、上記問題を解決するためになされたものであり、鋭意研究を行ったところ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅには窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能に優れた細菌株が存在し、当該細菌株が微生物資材に有用であることを新たに見出した。
　すなわち、本出願の開示の目的は、微生物資材および植物の栽培方法、並びに、細菌株を提供することである。
（１）窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する細菌株を含む微生物資材。
（２）細菌株が、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９及びその１以上のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属別種をＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｕｎｉｔ）に含む進化系統樹解析において、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を含むクレードに属する、上記（１）に記載の微生物資材。
（３）進化系統樹解析は、ＡＭＰＨＯＲＡを用いて抽出したｄｎａＧ、ｆｒｒ、ｉｎｆＣ、ｎｕｓＡ、ｐｇｋ、ｐｙｒＧ、ｒｐｌＡ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＣ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＦ、ｒｐｌＫ、ｒｐｌＬ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＰ、ｒｐｌＳ、ｒｐｌＴ、ｒｐｍＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｓＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｓＥ、ｒｐｓＩ、ｒｐｓＪ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｒｐｓＳ、ｓｍｐＢおよびｔｓｆ遺伝子がコードするアミノ酸配列を連結してなる連結配列を各ＯＴＵについて作成して解析する、上記（２）に記載の微生物資材。
（４）細菌株が、さらに、ＡＮＩ解析においてＢ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を対象とするＡＮＩ値が９５％以上である、上記（１）または（２）に記載の微生物資材。
（５）細菌株が、さらに、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌のＩＴＳ（１６Ｓ－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子間領域）塩基配列との相同性が９７％以上であるＩＴＳ塩基配列を有する、上記（１）、（２）、（４）の何れか一つに記載の微生物資材。
（６）細菌株がＳＧ０９（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３６１）である、上記（１）～（５）の何れか一つに記載の微生物資材。
（７）細菌株が、ＳＦ２１（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５２）またはＳＨ１２（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５３）である、上記（１）～（５）の何れか一つに記載の微生物資材。
（８）植物の生育促進剤として機能する、上記（１）～（７）の何れか一つに記載の微生物資材。
（９）植物がマメ科植物である、上記（８）に記載の微生物資材。
（１０）上記（１）～（９）の何れか一つに記載の微生物資材を植物の種子または根部と接触、或いは、植物の根部の近傍に存在させる工程を含む、植物の栽培方法。
（１１）窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属し、
　Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９及びその１以上のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属別種をＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｕｎｉｔ）に含む進化系統樹解析において、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を含むクレードに属する、細菌株。
（１２）細菌株がＳＧ０９（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３６１）である、上記（１１）に記載の細菌株。
（１３）細菌株が、ＳＦ２１（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５２）またはＳＨ１２（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５３）である、上記（１１）に記載の細菌株。
　本出願で開示する微生物資材は、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有する。したがって、植物の生育を促進すると共に、温室効果ガスであるＮ2Ｏの排出を抑制できる。
図１ＡはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌株のＡＭＰＨＯＲＡ（ハウスキーピング遺伝子）による進化系統樹、図１Ｂは各細菌株の機能を示す図である。 図２は実施例１において形成された根粒の占有率を調査したグラフである。 図３は図面代用写真で、図３Ａは実施例２で生育したダイズの写真、図３Ｂは比較例１で生育したダイズの写真である。 図４は、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する野生株、並びに、Ｂ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードに属する野生株およびＮ2Ｏ還元能を強化した変異株のＮ2Ｏ還元能の差を示すグラフである。 図５ＡはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌株のＡＭＰＨＯＲＡ（ハウスキーピング遺伝子）による進化系統樹、図５Ｂは各細菌株の機能を示す図である。 図６は図面代用写真で、実施例３（ＳＧ０９、ＳＦ２１、ＳＨ１２）、比較例２（ＵＳＤＡ１１０）および比較例３（接種なし）で生育したダイズの写真である。 図７は、実施例３および比較例２で生育したダイズの根粒乾燥重量（Ｎｏｄｕｌｅｓ　ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ）、並びに、実施例３および比較例２で生育したダイズの根粒数（Ｎｏｄｕｌｅｓ　Ｎｕｍｂｅｒ）を示す。 図８は、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する野生株、並びに、Ｂ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードに属する野生株のＮ2Ｏ還元能の差を示すグラフである。 図９は、比較例４（ＵＳＤＡ１１０）のＮ2Ｏフラックス測定値を１とした時の、実施例４（ＳＧ０９）および比較例５（１１０ΔＨ１）のＮ2Ｏフラックス測定値を相対的に示したグラフである。
　以下に、本出願で開示する、微生物資材および植物の栽培方法について詳しく説明する。なお、本明細書において、数値や略等の記載に関しては、以下の通り解釈される。
（１）「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
（２）数値、数値範囲、及び定性的な表現（例えば、「同一」、「同じ」等の表現）については、当該技術分野において一般的に許容される誤差を含む数値、数値範囲及び性質を示している、
（微生物資材の実施形態）
　本出願で開示する微生物資材は、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する細菌株（以下、単に「細菌株」と記載することがある。）を含む。なお、本明細書において「微生物資材」とは、植物の生育や健康の向上を目的として土壌または作物種子に接種される微生物（細菌株）自体、または、当該微生物にその他の成分を加えたものを意味する。
　本出願で開示する新たな細菌株は、福島二本松圃場のソルガム根から分離されたものであり、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍに属する。Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属には、Ｎ2Ｏ還元能を有するｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレード、Ｎ2Ｏ還元能を有しないｊａｐｏｎｉｃｕｍクレードが知られている。一方、本出願で開示する新たな細菌株は、カナダで分離された優良ダイズ根粒菌であるＢ． ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれる。本発明者らは多くの細菌株の活性を調べた結果、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードには、Ｎ2Ｏ還元能を有するが、窒素固定能を有する細菌株と有しない細菌株があることを見出した。したがって、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属し、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有する細菌株を微生物資材として用いると、植物の生育を促進すると共に、圃場から発生するＮ2Ｏの排出量を軽減できる。なお、本明細書において「窒素固定能」とは、例えば大気中に含まれる安定なＮ2を反応性の高いＮＨ3等の他の窒素化合物に変換する能力を意味する。また、「Ｎ2Ｏ還元能」とは、ＮＨ3の硝化・脱窒過程で発生するＮ2ＯをＮ2に還元する能力を意味する。また、細菌株が「窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有する」とは、上記能力を奏する遺伝子を具備することを意味する。
　本出願で開示する細菌株は、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属し、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有すれば特に制限はない。後述するとおり、スクリーニングした細菌株の中から、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能の有無を測定すればよい。
　Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードの基準株は、カナダで採取されたＯＯ９９である（Ｘｉｕｍｅｉ　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ　ｓｐ．　ｎｏｖ．，　ａ　ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎｓ　ｉｎ　Ｃａｎａｄａ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４），６４，３２０２－３２０７）。
　後述する実施例のとおり、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株であるＯＯ９９は、野生株であるが優れたＮ2Ｏ還元能を有する。本出願で開示する細菌株は、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９及びその１以上のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属別種をＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｕｎｉｔ）に含む進化系統樹解析において、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を含むクレードに属する。
　なお、上記ＯＴＵは、細菌の必須遺伝子（一般に、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子）の塩基配列をコンピュータ上でその類似度を指標に分類したときに得られる単位をいう。ＯＴＵが同じであれば進化的に同一の菌種から構成されるといえる。
　進化系統樹解析は、ＡＭＰＨＯＲＡを用いて抽出したｄｎａＧ、ｆｒｒ、ｉｎｆＣ、ｎｕｓＡ、ｐｇｋ、ｐｙｒＧ、ｒｐｌＡ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＣ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＦ、ｒｐｌＫ、ｒｐｌＬ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＰ、ｒｐｌＳ、ｒｐｌＴ、ｒｐｍＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｓＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｓＥ、ｒｐｓＩ、ｒｐｓＪ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｒｐｓＳ、ｓｍｐＢおよびｔｓｆ遺伝子がコードするアミノ酸配列を連結してなる連結配列を各ＯＴＵについて作成して解析することで行われる。
　ＡＭＰＨＯＲＡの詳細については、（１）Ｍａｒｔｉｎ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ，　ｆａｓｔ，　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃ　ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ”，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２００８，９：Ｒ１５１、および、（２）Ｍａｒｔｉｎ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ａｒｃｈａｅａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｉｔｈ　ＡＭＰＨＯＲＡ２”，ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ　ＮＯＴＥ，Ｖｏｌ．２８，ｎｏ．７，２０１２，ｐ１０３３－１０３４（以下、「Ｗｕ　ａｎｄ　Ｓｃｏｔｔ，２０１２」と記載する。）、に記載されている。
　細菌株は、さらに、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析においてＢ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を対象とするＡＮＩ値が９５％以上であってもよい。ＡＮＩ値が９５％以上であれば同種と判定できる。なお、ＡＮＩ解析は公知の方法により行えばよい。
　細菌株は、さらに、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌のＩＴＳ（１６Ｓ－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子間領域）塩基配列との相同性が９７％以上であるＩＴＳ塩基配列を有してもよい。ＩＴＳは分子系統解析に用いられる領域で、９７％以上の相同性を有することで同種ということができる。
　細菌株としては、例えば、ＳＧ０９、ＳＧ１１、ＳＦ２１、ＳＨ１２等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本出願で開示する細菌株の内、ＳＧ０９は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０２１年１月５日付けで受領され、受託番号は「ＮＩＴＥ　Ｐ－０３３６１」である。ＳＧ０９は、ブダペスト条約に基づく国際寄託として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに移管され、２０２１年１１月８日に受領された。受託番号は「ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３６１」である。
　「ＳＦ２１」および「ＳＨ１２」は、ブダペスト条約に基づく国際寄託として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０２１年１１月８日に受領された。受託番号は、以下のとおりである。
・「ＳＦ２１」：「ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５２」
・「ＳＨ１２」：「ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５３」
　本出願で開示する細菌株の培養は、公知の任意の培地を用いることができる。また、液体培地以外に寒天入りの斜面培地及び平板培地等の固体培地を用いることもできる。これらの培地を用いることによって、細菌株を増殖させて、所望の菌体量を得ることができる。
　培地の炭素源としては、上記細菌株が同化しうるあらゆるものを使用することができるが、グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、麦芽エキス澱粉加水分解物などの糖を例示することができる。
　窒素源としても同様に、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの、細菌株が利用することができる各種の合成又は天然物が利用可能である。
　また、微生物培養の常法に従って、食塩、リン酸塩などの無機塩類、カルシウム、マグネシウム、鉄などの金属の塩類、ビタミン、アミノ酸などの微量栄養源も必要に応じて添加することができる。
　微生物資材に含まれるその他の成分は、微生物資材に一般的に含まれる成分であれば特に制限はない。例えば、微生物を吸着・安定化させるための多孔質素材などの担体、微生物増殖時の栄養源として用いた各種の有機質素材、肥料成分、その他ミネラル類、あるいは稀釈剤、分散剤等が挙げられる。
　上記のとおり、本出願で開示する細菌株は、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有する。したがって、当該細菌株を含む微生物資材は、植物の生育促進剤として機能すると共に、圃場からのＮ2Ｏの放出抑制剤としても機能する。生育を促進する植物としては、マメ科植物（ダイズ、落花生、リョクトウ等）、イネ科植物（ソルガム、トウモロコシ、小麦、大麦）等が挙げられる。
（植物の栽培方法の実施形態）
　本出願で開示する植物の栽培方法は、上記微生物資材を植物の種子または根部と接触、或いは、植物の根部の近傍に存在させる工程を含む。当該工程により、その植物の生育を促進する。なお本明細書において「根部」とは、植物を栽培した場合に土壌中または水耕液中にあって水分や栄養分の吸収を行なう部分を意味する。また、「生育を促進する」とは、根粒形成の有無を問わず窒素固定を行うことで宿主植物の生育を促進することを意味する。
　以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
［細菌株の分離］
　表面殺菌したソルガム根から細菌抽出液を調製し、その抽出液をダイズ種子に接種して形成された根粒からＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌を分離した。具体的な手順は以下のとおりである。
　福島県二本松市内の圃場から収穫したソルガム根約３０ｇを７０％エタノールで洗浄後、２．５％ＮａＯＣｌに室温で１０分間浸して表面殺菌した。滅菌蒸留水で１０回洗浄後、液体窒素で凍らせながら滅菌した乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。粉砕物に約２００ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加え十分混合し、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過することにより植物残渣を取り除いた。ろ液を遠心分離し（９，８７６×ｇ、１０ｍｉｎ）、沈殿物をＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に懸濁し、液量を１０ｍＬに調整した。レオナルドジャー（Ｉｎａｂａ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｎ2Ｏ　Ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｄｅｇｒａｄｅｄ　Ｓｏｙｂｅａｎ　Ｎｏｄｕｌｅｓ　Ｄｅｐｅｎｄｓ　ｏｎ　Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ”，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　Ｅｎｖｉｒｏｎ．，２０１２，Ｄｅｃ；２７（４）：４７０－４７６）に表面殺菌したダイズ種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　ｃｖ．　Ｅｎｒｅｉ）を５粒離して置き、１種子あたり細菌抽出液１ｍＬを滴下した。１ポット当り５個体播種し、人工気象機内（Ｋｏｉｔｏ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、２３℃、１６ｈ明・８ｈ暗）で３週間栽培した。その後、ダイズに着生した根粒を採集した。根粒を７０％エタノールで１分間洗浄後、０．５％　ＮａＯＣｌに１０分間浸し表面殺菌した。火炎滅菌したカッターで根粒を切断し、根粒断面内部を滅菌爪楊枝で触れて１００倍希釈したＮＡ寒天平板培地上（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ）に画線した。２８℃で１０日間培養後、出現したコロニーは１００倍希釈ＮＡ寒天培地でさらにシングルコロニー純化を行うことで分離株を得た。
　次に、実施例で用いた解析方法および測定方法等について説明する。
［ＩＴＳ配列］
　分離株の１６Ｓ－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子間領域（ＩＴＳ）をＰＣＲ法で増幅後、塩基配列をサンガー法で決定した。なお、ＰＣＲはパフォーマンス向上のためにＢｌｅｎｄ　ｔａｑ（登録商標）－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ　ＣＯ．，ＬＴＤ．，Ｏｋａｓａ）を用い、プライマーにはＳａｅｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｇｒｏｕｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ＵＳＤＡ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ａｎｄ　１６Ｓ－２３Ｓ　ｒＤＮＡ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　Ｓｐａｃｅｒ　Ｒｅｇｉｏｎ”，Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ．　Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒ．，５０（４），５１７－５２５，２００４に記載のＩＴＳ－ＦおよびＩＴＳ－Ｒを用い、表１に示すＰＣＲ反応液の組成で、表２に示す反応条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　決定したＩＴＳ配列をＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）でＢＬＡＳＴ検索し、今回得られたＳＧ０９およびＳＧ１１は、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属していることを確かめた。
［ＡＭＰＨＯＲＡによる進化系統樹］
　分離株のドラフトゲノムの塩基配列情報をＤＦＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｆａｓｔ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）にアップロードし、アミノ酸に変換した。系統関係を解析するため、上記した３１個のｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅのアミノ酸配列をＡＭＰＨＯＲＡ（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｓｃｏｔｔ，２０１２）を用いて抽出した。抽出した遺伝子のアミノ酸配列を結合し、ＭＥＧＡ　ｖ．７．０（Ｓｕｄｈｉｒ　Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，“ＭＥＧＡ７：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　７．０　ｆｏｒ　Ｂｉｇｇｅｒ　Ｄａｔａｓｅｔｓ”，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３３（７）：１８７０－１８７４，２０１６）を用いてｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法（Ｎａｒｕｙａ　Ｓａｉｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔｈｅ　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒｅｅｓ”，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４（４）：４０６－４２５，１９８７）で系統樹を描いた（ブートストラップ＝１０００回）。
［ＩＴＳ配列に基づくＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌分離株の系統樹］
　ＩＴＳ配列に基づき９７％でＯＴＵを作成した。その結果、分離株は、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレード、ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードおよびｊａｐｏｎｉｃｕｍクレードに含まれる複数種の細菌株であることを確認した。
［Ｎ２Ｏ還元活性の測定］
　Ｎ２Ｏ還元活性測定は添加したＮ２Ｏの減少を観察することによって行った。まず対象菌株を７５ｍＬ容試験管内の１５ｍＬのＨＭＭ培地（Ｓａｍｅｓｈｉｍａ－Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．２００６）に接種し、３０℃、好気条件で約６時間前培養した。次に菌液が入っている試験管にブチルゴム栓をつけて、気相を４．９８％のＮ２Ｏガス（９５．０２％　Ｎ２）に置換した。１２～１４時間振とう培養を行い、Ｎ２Ｏ還元を誘導した。培養液は滅菌済培地と混合して吸光度を約０．０５（光路＝１０ｍｍ）に調整した。この際、嫌気条件を保つために添加する培地および試験管内の気相はあらかじめＮ２ガスで脱気し、使用するプラスティックシリンジおよび針のデットスペースもＮ２ガスで３回洗浄した。調製済みの菌液１０ｍＬを１００％Ｎ２ガスで充満した滅菌試験管に移し、菌液量および気相量を株間で揃えた。なお、試験管の容量はブチルゴム栓をつけた状態で７３．８±０．２ｍＬで、気相の体積は６３．８ｍＬであった。試験管に１００％Ｎ２Ｏガスを０．６５ｍＬ導入し、終濃度を約１％に調整した。その時点を０時間としてＮ２Ｏ濃度の減少を経時的に測定した。Ｎ２Ｏ濃度はガスクロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｚｕ，ＧＣ２０１４）を用い、以下表３の条件で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　図１ＡはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌株のＡＭＰＨＯＲＡ（ハウスキーピング遺伝子）による進化系統樹、図１Ｂは各細菌株の機能を示す図である。図１ＢのＮ2　ｆｉｘａｔｉｏｎ（窒素固定）およびＮｏｄｕｌａｔｉｏｎ（根粒形成）に関し、■は当該遺伝子群を保有していることを示し、□は当該遺伝子群を保有していないことを示している。また、Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（脱窒）に関し、■は当該遺伝子群を保有していることを示すが、●は脱窒の最終過程であるｎｏｓ遺伝子群（Ｎ２ＯをＮ２に還元する酵素等をコードしている遺伝子群）があることを示し、〇はｎｏｓ遺伝子群がないことを示している。なお、図１には今回得られたＳＧ０９およびＳＧ１１に加え、公知のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌株が対比のため記載されている。その中で、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれる公知のダイズ根粒菌であるＯＯ９９はｏｔｔａｗａｅｎｓｅの種の基準となる基準株（タイプストレイン）である。なお、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれるＴＭ１０２、ＴＭ２３３、ＴＭ２３９の詳細は、Ｓｈｉｎｔａｒｏ　Ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ－Ｆｉｘｉｎｇ　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｗｉｔｈ　Ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｆｉｅｌｄ－Ｇｒｏｗｎ　Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｙ　Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｅｓ”，　Ｍａｒｃｈ　２０１９　｜　Ｖｏｌｕｍｅ　１０　｜　Ａｒｔｉｃｌｅ　４０７に記載されている。
　また、得られたＳＧ０９株の完全長ゲノムとＯＯ９９株の完全長ゲノムを公知の手法によりＡＮＩ解析したところ、ＳＧ０９株はＯＯ９９株に対して９９．０８％のＡＮＩ値を示した。
　以上の結果から、（１）今回得られたＳＧ０９株は、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれる公知のダイズ根粒菌であるＯＯ９９と同種ではあるが異なる細菌株であること、（２）ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれる細菌株は、Ｎ2Ｏ還元能を有するが、窒素固定能を有する株と有しない株があること、を確認した。
［微生物資材の作製および根粒形成の確認］
＜実施例１＞
　上記［細菌株の分離］で分離したＳＧ０９株を滅菌水で懸濁することで微生物資材を作製した。次に、ＳＧ０９株と公知のダイズ根粒菌でありＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓＵＳＤＡ１１０と１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子系統解析において同一クラスターに属するＵＳＤＡ１２２（ＢＣＲＣ番号：１３５３３）とを０．５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で１：１の割合で混合した微生物資材を作製した。ＵＳＤＡ１２２の詳細は、Ｍａｓａｙｕｋｉ　Ｓｕｇａｗａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ　ＵＳＤＡ１２２，　ａ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ－Ｆｉｘｉｎｇ　Ｓｏｙｂｅａｎ　Ｓｙｍｂｉｏｎｔ”，Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｇｅｎｏｍｅＡ．０１７４３－１６に記載されている。ダイズ種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ，　ｃｖ．　Ｅｎｔｅｒｉ）を栽培用ポット（レオナルドジャー、土はバーミキュライトを使用）に４粒播種し、上記で調整した菌液（微生物資材）１ｍＬを４回にわけて接種した。この際、菌液が直接ダイズ種子に触れないように、できるだけ離れた位置（１ｃｍ程度）から滴下した。ダイズが発芽した後、４粒のうち３粒を間引きし、１ポットあたり１個体を栽培した。栽培は人工気象機（Ｋｏｉｔｏ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，２３℃，１６ｈ明・８ｈ暗）にて２６日間行った。
　図２は、形成された根粒の占有率を調査したグラフである。図２から明らかなように、接種した細菌株の菌体数は同じであるにもかかわらず、２６日後のダイズ根粒中のＳＧ０９の優占度は約７４％であった。以上の結果から、ＳＧ０９の競合的根粒形成能は公知のダイズ根粒菌であるＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓＵＳＤＡ１２２より優れていることが明らかとなった。
［ＳＧ０９の生育促進能の確認］
＜実施例２＞
　実施例１で作製したＳＧ０９株のみを含む微生物資材（ＳＧ０９株の密度：０．５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を用い、実施例１と同様の手順でダイズの生育を行った。図３Ａに実施例２で生育した、接種してから２６日目のダイズの写真を示す。
＜比較例１＞
　微生物資材を接種しなかった以外は、実施例２と同様の手順により実験を行った。図３Ｂに比較例１で生育したダイズの写真を示す。
　図３Ａおよび図３Ｂから明らかなとおり、ＳＧ０９を接種した実施例２のダイズには窒素欠乏などの様子は観察されなかった。一方、ＳＧ０９を接種しなかった比較例１のダイズは、実施例２より生育が悪く且つ下葉が黄化しており窒素欠乏の症状を示した。以上の結果より、ＳＧ０９はソルガム根から分離したにも関わらずダイズに共生し正常な窒素固定能を奏することを確認した。
［Ｎ2Ｏ還元能の比較］
　次に、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する野生株とＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードに属する株のＮ2Ｏ還元能の比較を行った。図４は、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する野生株（ＳＧ０９、ＯＯ９９）、並びに、Ｂ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードに属する野生株（ＵＳＤＡ１１０、ＪＣＭ番号：１０８３３）および遺伝子操作によりＮ2Ｏ還元能を強化した変異株（ＵＳＤＡ１１０△Ｈ１、ＵＳＤＡ１１０△ｎａｓＳ）のＮ2Ｏ還元能の差を示すグラフである。なお、ＵＳＤＡ１１０△Ｈ１は非特許文献１に記載の手順により遺伝子操作した変異株、ＵＳＤＡ１１０△ｎａｓＳはは非特許文献２に記載の手順により遺伝子操作した変異株である。図４の測定値は、上記［Ｎ2Ｏ還元活性の測定］により測定した値である。
　図４に示すとおり、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する野生株であるＳＧ０９およびＯＯ９９は、Ｂ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードに属する野生株であるＵＳＤＡ１１０より約５．４倍もＮ2Ｏ還元能が高く、Ｎ2Ｏ還元能を強化した変異株であるＵＳＤＡ１１０△Ｈ１およびＵＳＤＡ１１０△ｎａｓＳと同程度のＮ2Ｏ還元能を有することを確認した。また、Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ＨＳＤ　ｔｅｓｔで行った有意差検定では、ａ，ｂはｐ＜０．０５で有意に異なることを確認した。
［ＳＧ０９株以外の菌株の探索］
　上記［細菌株の分離］、［ＩＴＳ配列］、［ＡＭＰＨＯＲＡによる進化系統樹］、［ＩＴＳ配列に基づくＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌分離株の系統樹］および［Ｎ２Ｏ還元活性の測定］と同様の手順で、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれる他の細菌株の探索を行った。
　図５ＡはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌株のＡＭＰＨＯＲＡ（ハウスキーピング遺伝子）による進化系統樹、図５Ｂは各細菌株の機能を示す図である。なお、図５Ｂ中の“Ｎ2　ｆｉｘａｔｉｏｎ”、“Ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ”および“Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”の欄の記号（■、□、●、〇）の説明は、図１Ｂと同じである。
　また、得られたＳＦ２１株およびＳＨ１２株の完全長ゲノムとＯＯ９９株の完全長ゲノムを公知の手法によりＡＮＩ解析したところ、ＳＦ２１株はＯＯ９９株に対して９９.１％のＡＮＩ値を示し、ＳＨ１２株はＯＯ９９株に対して９９.１％のＡＮＩ値を示した。
　以上の結果から、新たに得られたＳＦ２１株およびＳＨ１２株は、ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに含まれる公知のダイズ根粒菌であるＯＯ９９と同種ではあるが異なる細菌株であることを確認した。
［微生物資材の作製および生育促進能の確認］
＜実施例３＞
　分離したＳＧ０９株、ＳＦ２１株およびＳＨ１２株を、それぞれ、１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度となるように滅菌水に懸濁することで微生物資材を作製した。滅菌バーミキュライトを入れたレオナルドジャーポットに、０．５％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌したダイズ種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ，　ｃｖ．　Ｅｎｔｅｒｉ）を１ポット当たり５粒播種し、微生物資材を１ｍｌ接種した。栽培は人工気象器で２５℃、明期１６時間／暗期８時間の条件で行い、播種後３日目に発芽状態の良い３個体を残し間引きを行い、その後２７日間栽培を行った。ポットには定期的に無窒素水耕液を供給した。栽培後にポットごとに根粒（ｎｏｄｕｌｅｓ）の回収を行った。根粒はポットごとに根粒数を測定した後、８０℃で４８時間乾燥させた直ちに乾燥重量を測定した。
＜比較例２＞
　菌株としてＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓＵＳＤＡ１１０（ＪＣＭ番号：１０８３３）を用いた以外は、実施例３と同様の手順により実験を行った。
＜比較例３＞
　微生物資材を接種しなかった以外は、実施例３と同様の手順により実験を行った。
　図６に、実施例３、比較例２および比較例３で生育したダイズの写真を示す。図６から明らかなとおり、実施例３の微生物資材を接種したダイズの生育状況は、公知のダイズ根粒菌を用いた比較例２の微生物資材よりやや劣るものの、微生物資材を接種しなかった比較例３よりは良好であった。
　図７に、実施例３および比較例２で生育したダイズの根粒乾燥重量（Ｎｏｄｕｌｅｓ　ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ）、並びに、実施例３および比較例２で生育したダイズの根粒数（Ｎｏｄｕｌｅｓ　Ｎｕｍｂｅｒ）を示す。図７から明らかなように、微生物資材としてＳＧ０９株、ＳＦ２１株およびＳＨ１２株を用いると、比較例２（ＵＳＤＡ１１０）より根粒の数および量が多くなることを確認した。
［ＳＦ２１およびＳＨ１２のＮ2Ｏ還元能の比較］
　次に、細菌株として、ＵＳＤＡ１１０、ＳＧ０９、ＳＦ２１およびＳＨ１２を用い、上記［Ｎ2Ｏ還元能の比較］と同様の手順でＮ2Ｏ還元能の比較を行った。図８に結果を示す。図８に示すとおり、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する野生株であるＳＧ０９、ＳＦ２１およびＳＨ１２は、いずれも、Ｂ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓクレードに属する野生株であるＵＳＤＡ１１０よりＮ2Ｏ還元能が高いことを確認した。また、Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ＨＳＤ　ｔｅｓｔで行った有意差検定では、ａ，ｂはｐ＜０．０５で有意に異なることを確認した。
［老化根粒Ｎ2Ｏフラックス測定］
＜実施例４＞
　次に、ＳＧ０９株の老化根粒Ｎ2Ｏフラックスを測定した。手順を以下に示す。
（ダイズ栽培）
　分離したＳＧ０９株を、１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度となるように滅菌水に懸濁することで微生物資材を作製した。滅菌バーミキュライトを入れたレオナルドジャーポットに、０．５％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌したダイズ種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ，　ｃｖ．　Ｅｎｔｅｒｉ）を１ポット当たり３粒播種し、微生物資材を１ｍｌ接種した。栽培は人工気象器で２５℃、明期１６時間／暗期８時間の条件で行い、播種後３日目に発芽状態の良い１個体を残し間引きを行い、その後２７日間栽培を行った。ポットには定期的に無窒素水耕液を供給した。
（根粒老化処理）
　根粒老化処理には東北大鹿島台圃場の土壌を用いた。土壌を２ｍｍのふるいでふるい、１０ｇずつ、ポット数と同数の５０ｍｌ遠心チューブに入れた。土壌の洗浄を行うため、遠心チューブに蒸留水３０ｍｌを加え１０分間振とうした後、５０００ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を捨てた。これを３回繰り返した後、遠心チューブに蒸留水３０ｍｌを加え土壌をよく懸濁した。ダイズの根粒老化を人為的に促進させるため、地上部を切除し、蒸留水３０ｍｌに懸濁した土壌１０ｇを根系（根粒を含む）が残っているポットに添加した。その後２０日間２５℃、明期１６時間／暗期８時間の条件下に置き根粒老化を進行させた。
（Ｎ2Ｏフラックス測定）
　ポットから根系を回収し、６０ｍＬ容のガラスバイアルに入れ密閉し、２５℃で３時間インキュベートした。インキュベーション前後で気相のサンプリングを行い、ＥＣＤガスクロマトグラフ（Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｇ－Ｃ２０１４）を用い気相中のＮ２Ｏ濃度を測定し、大気条件下でのＮ2Ｏフラックスを求めた。
＜比較例４＞
　ＳＧ０９株に替え、ＵＳＤＡ１１０株を用いた以外は実施例４と同様の手順で老化根粒Ｎ2Ｏフラックス測定を行った。
＜比較例５＞
　ＳＧ０９株に替え、ＵＳＤＡ１１０△Ｈ１株を用いた以外は実施例４と同様の手順で老化根粒Ｎ2Ｏフラックス測定を行った。
　図９は、比較例４のＵＳＤＡ１１０株（公知のダイズ根粒菌であるＢ．ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓの野生株）のＮ2Ｏフラックス測定値を１とした時の、実施例４および比較例５のＮ2Ｏフラックス測定値を相対的に示したグラフである。図９から明らかなように、野生株であるＳＧ０９株（実施例４）は、野生株であるＵＳＤＡ１１０のＮ2Ｏフラックスを約５割削減することができ、遺伝子操作によりＮ2Ｏ還元能を強化した変異株（ＵＳＤＡ１１０△Ｈ１）である比較例５とほぼ同じレベルまでＮ2Ｏフラックスを削減できることを確認した。
　以上の結果よりＢ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する細菌株は、（１）野生株でも高いＮ2Ｏ還元能を有すること、（２）窒素固定能を有する株と有しない株が存在すること、（３）窒素固定能を有する株はダイズと共生し生育を促進すること、を確認した。したがって、窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する細菌株を含む微生物資材を圃場で使用することで、植物の生育促進および大気へのＮ2Ｏ排出を削減できるという効果を奏する。
　本出願で開示する微生物資材を用いることで、植物の生育促進および大気へのＮ2Ｏ排出を削減できる。したがって、本出願で開示する微生物資材は、農業分野に有用である。
[規則26に基づく補充 28.01.2022]　
Figure WO-DOC-PAGE-71

Figure WO-DOC-PAGE-71-2

Claims (13)

  1. 　窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属する細菌株を含む微生物資材。
  2. 　細菌株が、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９及びその１以上のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属別種をＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｕｎｉｔ）に含む進化系統樹解析において、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を含むクレードに属する、請求項１に記載の微生物資材。
  3. 　進化系統樹解析は、ＡＭＰＨＯＲＡを用いて抽出したｄｎａＧ、ｆｒｒ、ｉｎｆＣ、ｎｕｓＡ、ｐｇｋ、ｐｙｒＧ、ｒｐｌＡ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＣ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＦ、ｒｐｌＫ、ｒｐｌＬ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＰ、ｒｐｌＳ、ｒｐｌＴ、ｒｐｍＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｓＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｓＥ、ｒｐｓＩ、ｒｐｓＪ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｒｐｓＳ、ｓｍｐＢおよびｔｓｆ遺伝子がコードするアミノ酸配列を連結してなる連結配列を各ＯＴＵについて作成して解析する、請求項２に記載の微生物資材。
  4. 　細菌株が、さらに、ＡＮＩ解析においてＢ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を対象とするＡＮＩ値が９５％以上である、請求項１または２に記載の微生物資材。
  5. 　細菌株が、さらに、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌のＩＴＳ（１６Ｓ－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子間領域）塩基配列との相同性が９７％以上であるＩＴＳ塩基配列を有する、請求項１、２、４の何れか一項に記載の微生物資材。
  6. 　細菌株がＳＧ０９（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３６１）である、請求項１～５の何れか一項に記載の微生物資材。
  7. 　細菌株が、ＳＦ２１（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５２）またはＳＨ１２（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５３）である、請求項１～５の何れか一項に記載の微生物資材。
  8. 　植物の生育促進剤として機能する、請求項１～７の何れか一項に記載の微生物資材。
  9. 　植物がマメ科植物である、請求項８に記載の微生物資材。
  10. 　請求項１～９の何れか一項に記載の微生物資材を植物の種子または根部と接触、或いは、植物の根部の近傍に存在させる工程を含む、植物の栽培方法。
  11. 　窒素固定能およびＮ2Ｏ還元能を有するＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属ｏｔｔａｗａｅｎｓｅクレードに属し、
    　Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９及びその１以上のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属別種をＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｕｎｉｔ）に含む進化系統樹解析において、Ｂ．ｏｔｔａｗａｅｎｓｅ基準株ＯＯ９９を含むクレードに属する、細菌株。
  12. 　細菌株がＳＧ０９（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３６１）である、請求項１１に記載の細菌株。
  13. 　細菌株が、ＳＦ２１（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５２）またはＳＨ１２（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５５３）である、請求項１１に記載の細菌株。
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