CN112195121B

CN112195121B - 一种耐高温微小杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112195121B
Application number: CN202011043516.6A
Authority: CN
Inventors: 张维; 周正富; 李江; 柯秀彬; 陈明; 王劲; 林敏�
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2040-09-28
Also published as: CN112195121A

Abstract

本公开提供了一种耐高温微小杆菌，该微小杆菌的分类命名为Microvirga thermotolerans HR1，并且，该微小杆菌的保藏编号为GDMCC No:60619。该耐高温微小杆菌具有耐热的功能，能够作为潜在的耐高温基因资源以及在培育耐热转基因作物方面具有重要的意义。

Description

一种耐高温微小杆菌及其应用

技术领域

本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种耐高温微小杆菌及其应用。

背景技术

温度是影响作物生长发育的重要因素之一。每一种作物都有它的生长最低温度、最适温度和最高温度，适宜的温度是植物生长发育的前提条件。近年来全球变暖使得高温对植物生长的影响日益显著。在我国南方，夏季温度最高可达35℃以上，且持续时间长，对南方作物造成严重损害。油菜作为我国主要的食用油来源，内需巨大，高温直接影响油菜等油类作物的开花、结实等，严重影响油类作物的产量。因此，为适应不断升高的气候温度，培育耐高温植物，筛选具有耐热能力的菌株，鉴定其耐热基因，进而将该基因转化作物，对提高作物耐热性具有重大意义。

发明内容

本公开的目的是提供一种微小杆菌，该微小杆菌具有耐热能力，其耐热基因可以提高作物的耐热性能。

为了实现上述目的，本公开提供了一种耐高温微小杆菌，该微小杆菌的分类命名为Microvirga thermotolerans HR1，并且，该微小杆菌的保藏编号为GDMCC No:60619。

所述微小杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本公开提供了如上所述的耐高温微小杆菌作为耐热功能菌株的应用。

另一方面，本公开还提供了如上所述的耐高温微小杆菌在构建具有耐高温功能的转基因作物方面的用途。

再一方面，本公开还提供了如上所述的耐高温微小杆菌在诱变育种和改良植物的耐热功能形状方面的用途。

再一方面，本公开还提供了一种耐热蛋白，该耐热蛋白来源于如上所述的耐高温微小杆菌，并且该耐热蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

再一方面，本公开还提供了一种耐热基因，该耐热基因来源于如上所述的耐高温微小杆菌，并且该耐热基因编码如上所述的耐热蛋白。

再一方面，本公开还提供了一种增强植物耐热性的方法，在植物中转入如上所述的耐热基因。

通过上述技术方案，本公开提供了一种耐高温微小杆菌及其作应用，该耐高温微小杆菌可以直接作为耐热转基因生物的基因供体，将其优良的耐热基因转入其它生物体中，使其可以获得优良的抗逆性状；同时，它也可能作为新的基因工程菌株，通过接受外来其它优良基因从而获得更多的优良性状；此外，通过传统的诱变育种手段进行性状的改良，还可以获得更多优良性状的菌株。目前，微小杆菌属(Microvirga)已报道16个有效种，但均未报道能在48℃以上生长，而本公开的保藏编号为GDMCC No:60619的Microvirgathermotolerans HR1是微小杆菌属(Microvirga)中第一株能在48℃以上生长的菌株，由此本公开提供了良好的耐热基因资源及酶基因资源。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏信息

耐高温微小杆菌HR1，分类命名Microvirga thermotolerans HR1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2019年3月29日，菌种保藏号为：GDMCC No:60619。

序列信息

SEQ ID NO:1：耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)的16SrDNA核苷酸序列；

SEQ ID NO:2：gene2563基因氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：gene2563基因核苷酸序列。

附图说明

图1为耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)的透射电镜图片；

图2为耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)的菌落形态；

图3为耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)与其它微小杆菌属成员之间的进化分析(基于16S rDNA序列分析)；

图4为耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)与对照菌株耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)的耐热能力对比；

图5为转基因植株(G2563)与野生型植株(WT)的耐热能力对比。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

一方面，本公开提供了一种耐高温微小杆菌，该微小杆菌的分类命名为Microvirga thermotolerans HR1，并且，该菌种已于2019年3月29日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:60619，下述称为耐高温微小杆菌HR1。所述耐高温微小杆菌的16S rDNADNA序列如SEQ ID NO:1所示。

所述耐高温微小杆菌HR1是从黑龙江省佳木斯市长期种植水稻的田间土壤中分离培养出一个新的微生物菌种，发明人发现该菌具有耐热的功能，能够作为潜在的耐高温基因资源以及在培育耐热转基因作物方面具有重要的意义。

另一方面，本公开提供了如上所述的耐高温微小杆菌HR1作为耐热功能菌株的应用。

另一方面，本公开还提供了如上所述的耐高温微小杆菌HR1在构建具有耐高温功能的转基因作物方面的用途。

再一方面，本公开还提供了如上所述的耐高温微小杆菌HR1在诱变育种和改良植物的耐热功能形状方面的用途。

如上所述的耐高温微小杆菌的全基因组序列可以用于分离、鉴定新的耐热功能基因。

优选地，所述耐热基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述植物包括棉花、水稻、油菜和玉米中的至少一种。

以下通过实施例进一步详细说明本公开。

实施例中所用到的R₂A琼脂培养基成分为：酪蛋白水解物0.5g/L；酵母提取物0.5g/L；胰蛋白胨0.5g/L；葡萄糖0.5g/L；可溶性淀粉0.5g/L；磷酸氢二钾0.3g/L；无水硫酸镁0.024g/L；丙酮酸钠0.3g/L；氯化钠10g/L；固体加琼脂15g/L。该培养基的pH7.2±0.2。

实施例中所用到的R’F液体培养基的成分为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂ 0.05g/L，柠檬酸铁0.15g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05g/L，FeCl₃0.01g/L，维生素溶液10mL，微量元素溶液1mL。

实施例中所用到的LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl10g/L。

实施例中所用到的TGY培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,葡萄糖1g/L。

实施例1

本实施例中所用到的土壤样品为黑龙江省佳木斯市地区一块长期种植水稻的田间土壤。

采集土壤样品，称取0.2g土样，于20mL R₂A液体培养基中在48℃、220rpm下富集培养3d，取第一富集培养物200μL，加入到20mL新鲜的R₂A液体培养基中培养3d，反复上述操作两次，吸取最终富集培养物100μL，分别按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6梯度依次稀释，每个浓度梯度取200μL稀释后培养物涂布于R₂A琼脂培养基平板上，倒置于48℃培养箱中培养3d，得到分离菌株。

该分离得到的菌株在电子显微镜下为杆状细菌(如图1所示)；在R₂A琼脂培养基上培养，菌落呈现半透明乳白色、水滴状，表面湿润，边缘整齐，有胞外分泌物(如图2所示)。

该分离得到的菌株生理生化特征为：好氧生长，革兰氏阴性，产生鞭毛，有运动性。呈现碱性磷酸盐酶阳性，酯酶(C4)阳性，白氨酸芳胺酶阳性，萘酚-AS-Bl-磷酸水解酶阳性；能以葡萄糖、阿拉伯糖以及丙酮酸盐为碳源，不能以甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、苦杏仁苷等为碳源；最适生长温度40℃，细胞壁脂肪酸含有C_19:0cycloω8c，C_16:0，C_17:0，C_18:0，C_14:0 2-OH，Summed feature 8(C_18:1ω7c and/or C_18:1ω6c)等，其中以SummedFeature 8(C_18:1ω7c and/or C_18:1ω6c),C_19:0cycloω8c和C_16:0为主。

对该分离得到的菌株进行鉴定，确认该菌株属于微小杆菌属(Microvirga)，被命名为耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)，并对其进行全基因组测序。

实施例2

将实施例1中分离得到的耐高温微小杆菌HR1，菌株接种于R’F液体培养基中，在40℃下，以220r/min的振荡频率摇床培养至OD₆₀₀＝0.6(对数中期)，后转移至48℃以220r/min的振荡频率摇床上培养；分别在转移培养后的0h、2h、4h、6h取样100μL，并依次稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个浓度梯度，每个浓度梯度取8μL菌液点在R₂A琼脂培养基上，40℃倒置培养，观察结果。

实施例3

将实施例1分离得到的耐高温微小杆菌HR1基因组使用

公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱形)进行提取。耐高温微小杆菌HR1的16S rDNArDNA的PCR扩增所用的通用引物序列的设计参照William G.Weisburg(1991)的文章，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买于南京诺唯赞生物科技有限公司。

正向引物

27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，SEQ ID NO.4)

反向引物

1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO.5)

表1 16S rDNArDNA扩增体系：

成分	体积/uL
		2×Phanta PCR mix Buffer	25
27F	2
		1492R	2
HR1基因组	2
		灭菌ddH<sub>2</sub>O	定容至50uL

表2 PCR反应程序

将扩增得到的16S rDNADNA序列，连接于

公司的pJET 1.2/blunt载体上，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有氨苄抗生素的LB固体平板上筛选阳性子，对插入序列进行测序。

测序得到的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例4

在实施例1中分离得到的耐高温微小杆菌HR1菌株中的全基因组序列中选取了一个与热激应答相关的基因gene2563(编码激蛋白Hsp20)构建pCAMBIA2300-gene2563重组植物表达载体。

采用引物2563-F和2563-R从菌株HR1全基因组上扩增含有SmaI和XbaI酶切位点的gene2563片段，用SmaI和XbaI双酶切扩增片段和pCAMBIA2300载体，将PCR产物与载体pCAMBIA2300进行酶切回收。

2563-F(5’-TCCCCCGGGATGACGATGCGGGATCCGGCAAACT-3’，SEQ ID NO.6)

2563-R(5’-TGCTCTAGACTACACGTCCTTTTCAAGGCTGAAG-3’，SEQ ID NO.7)

将回收纯化好的目的DNA片段和载体用T4 DNA连接酶16℃过夜连接。将上述连接液转化DH5α感受态细胞中，检测筛选出阳性克隆进行测序。测序结果确定无误后，提取测序正确的质粒，利用电击转化法转入农杆菌GV3101。电击转化后的农杆菌GV3101，经活化后涂布于含双抗(Kan，Rif)的LB培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗(Kan，Rif)的LB培养液中扩培并抽提质粒。对提取的质粒进行测序验证，并将验证正确的重组子采用外植体共培养转化野生型甘蓝型油菜，经过诱导培养，筛选培养、生根培养、移栽与炼苗步骤，并通过转基因植株PCR检测验证，最后获得Hsp20转基因表达株系G2563。

所述的gene2563基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例5

将实施例4得到的获得的Hsp20转基因表达株系G2563进行移栽，将移栽14日后的植株幼苗，转移到35℃，光照16h(60umol/m²/s)，黑暗8h，相对湿度为70％的气候室中培养0天，3天，6天。

对比例1

本对比例所用到的极端耐受微生物耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)菌株由本实验室保存。

将耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)菌株接种于TGY液体培养基中，在30℃下，以220r/min的振荡频率摇床培养至OD₆₀₀＝2(对数中期)，后转移至48℃以220r/min的振荡频率摇床培养；分别在转移培养后的0h、2h、4h、6h取样100μL，并依次稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个浓度梯度，每个浓度梯度取8μL菌液点在TGY固体培养基上，30℃倒置培养，观察结果。

对比例2

将出芽14天的普通植株幼苗进行移栽转移到35℃，光照16h(60umol/m²/s)，黑暗8h，相对湿度为70％的气候室中培养0天，3天，6天。

测试例1

将实施例1分离得到的耐高温微小杆菌HR1的16S rDNA与同属的其它种的16SrDNA相比，具有显著性差异(相似度≤97％)：

与Microvirga 17mud 1-3的相似度为97.87％；

与Microvirga flavescens c27j1(T)的相似度为97.37％；

与Microvirga aerilata 5420S-16(T)的相似度为97.16％；

与Microvirga soli R491(T)的相似度为96.81％；

与Microvirga makkahensis SV1470(T)的相似度为96.81％；

与Microvirga 5A4的相似度为96.76％；

与Microvirga indica S-MI1b(T)的相似度为96.75％；

与Microvirga subterranean DSM 14364(T)的相似度为96.74％；

与Microvirga flocculans ATCC BAA-817(T)的相似度为96.74％等等。

构建的系统发育树如图3所示。

测试例2

将实施例1中分离得到的耐高温微小杆菌HR1与微小杆菌属标准菌株——Microvirga subterranea FaiI4(T)＝DSM14364及近缘菌株M.flavescens c27j1(T)、Microvirga aerilata 5420S-16(T)、M.indica S-MI1b(T)进行微生物学特性比较(见表3)，本实施例获取的菌株与标准菌株的微生物学特性有显著差异。

表3耐高温微小杆菌HR1与同属不同近缘菌株的微生物学特性比较

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“w”表示弱阳性，“ND”表示无该数据。

测试例3

将实施例2和对比例1平行试验三次，观察培养基上菌落的生长情况，实施例1中的耐高温微小杆菌HR1在48℃热击6h后，仍然可以正常生长，而对比例1中的耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)菌株在48℃热击6h后，其生长情况较正常生长滞后1-2个数量级(如图4所示)。

测试例4

对比实施例4和对比例2中不同植株的耐热能力，结果显示，在35℃处理3天后，对比例2中的植株出现一定程度的萎蔫，而实施例4中的转基因植株(G2563)生长良好；在35℃处理6天后，对比例2中的植株死亡，而实施例4中的转基因植株(G2563)生长良好(图5)。

这表明从耐高温微小杆菌HR1基因组中发现的gene2563基因能够有效的增强植株的耐热能力。耐高温微小杆菌HR1菌株能够作为耐热转基因植株的基因来源，在构建具有耐热能力的转基因作物方面具有良好的应用前景。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种耐高温微小杆菌及其应用

<130> 14909CAAS-B-ZW-R

<150> 201910943728.0

<151> 2019-09-30

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1467

<212> DNA

<213> 耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)

<400> 2

tttttagcaa gatgagtttg atcatggctc agaacgaacg ctggcggcag gcttaacaca 60

tgcaagtcga acgcaccctt cggggtgagt ggcagacggg tgagtaacgc gtgggaacgt 120

gcccttcagt tcggaataac ccagggaaac ttgggctaat accggatacg tccgagagga 180

gaaagattta tcgctgaagg atcggcccgc gtctgattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc gacgatcagt agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct 360

gatccagcca tgccgcgtga gtgatgaagg ccttagggtt gtaaagctct ttcggcgggg 420

acgataatga cggtacccgc agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta 480

atacgaaggg ggctagcgtt gttcggaatc actgggcgta aagggcgcgt aggcggccgt 540

tcaagtcggg ggtgaaagcc tgtggctcaa ccacagaatt gccttcgata ctgtacggct 600

cgagaccgga agaggtaagt ggaactgcga gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgca 660

agaacaccag tggcgaaggc ggcttactgg tccggttctg acgctgaggc gcgaaagcgt 720

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgccagccg 780

ttggcgagct tgctcgtcag tggcgcagct aacgctttaa gcattccgcc tggggagtac 840

ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900

gtttaattcg aagcaacgcg cagaacctta ccagcctttg acatgtcccg tatgaggagt 960

ggagacacgc ctcttcagtt cggctggcgg gaacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgcc tttagttgcc 1080

atcattcagt tgggcactct aaagggactg ccggtgataa gccgcgagga aggtggggat 1140

gacgtcaagt cctcatggcc cttacgggct gggctacaca cgtgctacaa tggcggtgac 1200

aatgggcagc gaaggggcga cctggagcta atcccaaaaa gccgtctcag ttcggattgc 1260

actctgcaac tcgagtgcat gaaggtggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt tggtcttacc 1380

cgacggcgct gcgccaaccg caagggggca ggcgaccacg gtagggtcag cgactggggt 1440

gaagtcgtaa caaggtaacc gtaatct 1467

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> 耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)

<400> 2

Met Thr Met Arg Asp Pro Ala Asn Trp Met Leu Ser Glu Ala Ile Asp

1 5 10 15

Ala Leu Ala Arg Ala Glu Arg Met His Arg Gln Leu Phe Gln Leu Gln

20 25 30

Arg Ser Gln Ala Arg Ala Pro Ala Trp Glu Pro Pro Leu Asp Met Ile

35 40 45

Glu Thr Asp Arg Glu Val Leu Ile Leu Ile Ala Leu Pro Gly Val Glu

50 55 60

Pro Asp Gln Val Glu Ala Val Val Arg Asp Gly Ala Leu Val Val Ala

65 70 75 80

Gly Arg Arg Leu Leu Pro Pro Glu Leu Arg Thr Ala Arg Ile His Arg

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Gln Gly Arg Phe Glu Arg His Val Pro Leu Pro Pro

100 105 110

Gly Arg Tyr Ser Ala Val Arg Arg Phe Ala Arg Asn Gly Cys Leu Val

115 120 125

Phe Ser Leu Glu Lys Asp Val

130 135

<210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> 耐高温微小杆菌HR1(Microvirga thermotolerans HR1)

<400> 3

atgacgatgc gggatccggc aaactggatg ctctcggaag cgattgacgc cctggcgcgg 60

gccgagcgga tgcaccggca actctttcag ctccagcgct cgcaggctcg ggcgccggcg 120

tgggagcctc ccctcgacat gatcgagacc gaccgtgagg tcctcatcct gattgccctg 180

ccaggggttg agcctgacca ggtcgaggcc gttgtccggg atggagcctt ggtggtggct 240

ggccggcgcc tgctgcctcc cgagctgcgg acggcccgca tccatcgcct ggaactgcca 300

cagggacggt tcgagcgaca cgtcccgctg ccgccggggc gctatagcgc cgtgcgccgg 360

ttcgcgcgga atgggtgtct cgtcttcagc cttgaaaagg acgtgtag 408

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

agagtttgat catggctcag 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

tcccccggga tgacgatgcg ggatccggca aact 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

tgctctagac tacacgtcct tttcaaggct gaag 34

Claims

1.一种耐高温微小杆菌，其特征在于，该耐高温微小杆菌的分类命名为Microvirgathermotolerans HR1，并且，该耐高温微小杆菌的保藏编号为GDMCC No:60619。

2.根据权利要求1所述的耐高温微小杆菌，其中，该耐高温微小杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述的耐高温微小杆菌作为耐热功能菌株的应用。

4.权利要求1或2所述的耐高温微小杆菌在构建具有耐高温功能的转基因作物方面的用途。

5.权利要求1或2所述的耐高温微小杆菌在诱变育种和改良植物的耐热功能形状方面的用途。

6.一种耐热蛋白，其特征在于，该耐热蛋白来源于权利要求1或2所述的耐高温微小杆菌，并且该耐热蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.一种耐热基因，其特征在于，该耐热基因来源于权利要求1或2所述的耐高温微小杆菌，并且该耐热基因编码权利要求6所述的耐热蛋白。

8.根据权利要求7所述的耐热基因，其中，该耐热基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

9.一种增强植物耐热性的方法，其特征在于，在植物中转入权利要求7或8所述的耐热基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述植物包括棉花、水稻、油菜和玉米中的至少一种。